人源核不均一核糖核蛋白E1真核表达载体在神经细胞中的表达

背景:人源核不均一核糖核蛋白E1功能广泛,可参与神经系统骨架蛋白的表达。目的:为深入研究其在神经细胞中的作用,构建其真核表达载体,观察其在神经细胞中的表达。方法:利用真核表达载体pcDNATM4/His C,通过亚克隆构建核不均一核糖核蛋白E1-pcDNATM4/His C重组质粒,经酶切、测序鉴定,通过转染神经细胞SH-SY5Y,采用western-blot,RT-PCR鉴定核不均一核糖核蛋白E1重组质粒的表达,并观察转染细胞的生长现象。结果与结论:成功构建了核不均一核糖核蛋白E1的真核表达载体,mRNA和蛋白水平上均证实了该质粒可在神经细胞SH-SY5Y中正确表达。SH-SY5Y细胞在转染核不均一核糖核蛋白E1后表现为加速生长。提示该蛋白对神经细胞的生长发育具有重要的作用。该载体为进一步研究核不均一核糖核蛋白E1在神经系统中的功能提供了前提条件。     

突变A53Tα-synuclein基因核输入信号和核输出信号真核载体的构建及表达分析

目的:构建真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES,瞬时转染SH-SY5Y细胞。方法:PCR扩增法获得含有SalI和NotI的目的片段A53T-SNCA-NLS、A53T-SNCA-NES,SalI、NotI双酶切载体pRK5,线性pRK5与目的片段经ligation high连接,酶切、PCR鉴定重组质粒pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES。重组质粒通过Lipofactamine2000转染SH-SY5H细胞,免疫荧光法鉴定瞬转细胞。结果:真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES构建成功,NLS、NES能介导突变基因A53T-SNCA翻译的α-synuclein蛋白在核内表达或胞质表达。结论:基因A53T-SNCA翻译的突变α-synuclein蛋白核内高表达或胞质高表达可能是家族性帕金森氏病发病机制中关键因素之一。     

突变AS3Tα-synuclein基因核输入信号和核输出信号真核载体的构建及表达分析

目的:构建真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES,瞬时转染SH-SY5Y细胞.方法:PCR 扩增法获得含有Sal I和Not I的目的片段A53T-SNCA-NLS、A53T-SNCA-NES,Sal I、Not I双酶切载体pRK5,线性pRK5与目的片段经ligation high连接,酶切、PCR鉴定重组质粒pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES.重组质粒通过Lipofactamine2000转染SH-SY5H细胞,免疫荧光法鉴定瞬转细胞.结果:真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES构建成功,NLS、NES能介导突变基因A53T-SNCA翻译的α-synuclein蛋白在核内表达或胞质表达.结论:基因A53T-SNCA翻译的突变α-synuclein蛋白核内高表达或胞质高表达可能是家族性帕金森氏病发病机制中关键因素之一.     

稳定沉默Beclin1的人成神经瘤SH-SY5Y细胞系的构建

为了构建pGenesil-1-Beclin1真核表达载体,并建立Beclin1稳定沉默的人成神经瘤SH-SY5Y细胞系,将合成的shRNA片段连接pGenesil-1质粒,构建成重组质粒pGenesil-1-Beclin1,转化其至感受态大肠杆菌JM109,挑取阳性克隆进行双酶切和DNA测序鉴定。常规培养SH-SY5Y细胞,将重组质粒pGenesil-1-Beclin1和空白对照质粒pGenesil-1转染SH-SY5Y细胞,G418抗性筛选,在荧光显微镜下挑取单细胞克隆并扩大培养至稳定细胞株,经RT-PCR和Western blot检测Beclin1基因的表达。经酶切和DNA测序鉴定重组真核表达载体构建正确,成功筛选出两株细胞系。和对照组转染pGenesil-1的细胞系相比,转染pGenesil-1-Beclin1细胞系的Beclin1mRNA表达下降71.28%±1.45%(P0.05),Beclin1蛋白表达下降75.50%±2.63%(P0.05)。提示已经成功构建pGenesil-1-Beclin1真核表达载体并建立了Beclin1基因稳定沉默的SH-SY5Y细胞系,为研究Beclin1功能提供了细胞模型。     

Bcl-xl基因克隆及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的研究Bcl-xl基因在SH-SY5Y细胞中的表达。方法构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,采用脂质体介导将重组质粒导入SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western-blot检测外源基因表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,并用脂质体介导的方法高效转染SH-SY5Y细胞,RT-PCR显示有Bcl-xlmRNA表达增加,Western-blot显示有32kD的蛋白质表达增加。结论重组质粒pIRES2-EGFP/Bcl-xl经转染能够在SH-SY5Y细胞中高效表达,为进一步研究Bcl-xl对SH-SY5Y细胞的生物学功能奠定了基础。     

核小体Th表位和CTLA4Ig双基因共表达真核表达载体的构建

目的将核小体Th表位与CTLA4Ig融合基因融合，研究CTLA4Ig作为真核表达载体的可行性。方法用touchdown PCR法扩增CTLA4Ig基因，同时引入核小体Th表位（H2B14-28）。将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B。将表达质粒转染COS-7细胞，Western blot检测转染细胞裂解上清中融合蛋白的表达。将构建表达CTLA4Ig—H2B的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207喂饲BALB／c小鼠，取脾脏进行免疫组化鉴定重组蛋白在动物体内的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B质粒转染后48h细胞裂解上清中，检测到CTLA4Ig融合蛋白的表达，该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。重组蛋白在BALB／c小鼠脾脏免疫细胞胞浆中有阳性表达。结论成功构建了能稳定表达核小体Th表位和CTLA4Ig融合基因的真核表达载体。     

α-synuclein-pEGFP真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达

为了构建 α-synuclein-p EGFP真核表达载体 ,检测其在 SH-SY5 Y细胞内的表达 ,本研究应用下述方法 :PCR扩增 α-synuclein基因并消除终止密码子 ;PCR产物连入 p GEM T-easy载体 ,经测序确认无误后 ,亚克隆入 p EGFP-N1,构建α-synucle-in-p EGF P真核表达载体 ;Lipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ;荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,原位杂交和免疫荧光细胞化学法检测α-synuclein m RNA及其蛋白表达。结果显示 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,可在细胞内观察到报告基因和目的基因的表达产物。结论 :α-synuclein-p EGFP真核表达载体构建成功 ,并可在细胞内表达。本工作为今后动态观察研究α-synu-clein致 Parkinson病多巴胺能神经细胞损伤机制奠定基础     

人AMPKα2基因pEGFP-N1-AMPKα2表达载体的构建和鉴定

目的 构建表达人单磷酸腺苷激活的蛋白激酶催化亚单位α2(AMPKα2)基因的pEGFP-N1-AMPKα2载体,转染SH-SY5Y细胞系,观测其上调AMPKα2基因的效果.方法 PCR法扩增AMPKα2基因片段,克隆到pEGFP-N1质粒载体上.对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析.用质脂体将重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染到SH-SY5Y细胞系,经G418筛选阳性克隆后,用RT-PCR和Western blot法检测AMPKα2的mRNA和蛋白表达.流式细胞仪检测转染重组质粒细胞内ROS变化.结果 经DNA测序和酶切鉴定表明,pEGFP-N1-AMPKα2表达载体构建成功.重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染SH-SY5Y细胞系后,细胞中AMPKα2蛋白表达量明显增高.SH-SY5Y细胞转染pEGFP-N1-AMPKα2后,ROS含量增多.结论 成功构建了人AMPKα2基因的pEGFP-N1-AMPKα2表达载体.pEGFP-N1-AMPKα2能有效上调AMPKα2基因在SH-SY5Y细胞系中的表达,为将来应用其研究AMPK在局麻药致细胞损伤中的作用奠定了基础.     

禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白真核表达载体的构建与表达

目的:构建禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白HA真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏H5N1流感病毒毒株(A/Jiangsu/07-4(H5N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-HA质粒,双酶切pMD18-T-HA与PXJ40-MYC后,构建真核表达载体PXJ40-MYC-HA,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过West-ern blot鉴定HA蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实HA基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见HA基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H5N1血凝素真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达HA蛋白的细胞模型和HA蛋白功能研究奠定了基础。     

新型呼肠病毒S1基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建新型呼肠病毒主要抗原蛋白盯1蛋白的真核表达质粒,研究其在真核细胞内的表达。方法将s1基因克隆人真核表达载体pCAGGS／MCS,构建真核表达质粒pc—s并转染~ero细胞。通过SDS—PAGE和Western—Blot试验,对转染后24,48及72h的细胞内蛋白表达进行研究。结果酶切分析表明重组质粒构建成功。SDS—PAGE和Western—Blot的检测结果一致表明,转染后s1基因可在Vero细胞内表达且72h的细胞内蛋白表达量最高。结论通过构建重组真核表达质粒,可使s1基因在真核细胞内高效表达,为进一步研究新型呼肠病毒与宿主受体的相互作用打下基础。     

小鼠子宫珠蛋白结合蛋白真核表达载体构建及其在COS-1细胞的表达

目的:构建小鼠子宫珠蛋白结合蛋白(mouse uteroglobin binding protein,mUGBP)真核表达载体,观察其在COS-1细胞中的表达和定位.方法:用RT-PCR方法扩增mUGBP的cDNA序列,将其插入pEGFP-N1载体的多克隆位点构建pEGFP-UGBP重组质粒.采用脂质体转染法将重组质粒转染到无内源性mUGBP表达的非洲绿猴肾成纤维细胞株COS-1中,观察其在细胞内的表达,并用Western免疫印迹方法进行验证.结果:pEGFP-UGBP重组质粒经酶切鉴定以及测序证实,插入的目的基因序列完全正确.激光共聚焦显微镜观察发现,转染了pEGFP-UGBP重组质粒的细胞株可见绿色萤光蛋白的表达;Western免疫印迹检测发现细胞膜组分中可检获上述转染了重组质粒的细胞所表达的融合蛋白.结论:成功构建了pEGFP-UGBP重组质粒并进行了真核表达.     

人Gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建人Gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-Gax质粒中扩增出人Gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定后通过梭华-Sofast转染试剂介导重组质粒转染至兔血管平滑肌细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达和RT-PCR扩增转染细胞的cDNA来鉴定Gax在兔血管平滑肌细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物人Gax基因片段约915bp,与预期分子量相符;酶切分析和测序鉴定证明人Gax真核表达载体pEGFP-N1-Gax连接正确;荧光显微镜观察到重组质粒转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,及RT-PCR证明转染细胞有人GaxmRNA表达。结论:成功构建人Gax基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-Gax,并证实在兔血管平滑肌细胞中表达,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2的真核表达及定位

目的 构建无精症相关蛋白2（DAZAP2）真核表达重组载体, 对基因进行细胞定位. 方法提取1例正常人骨髓单个核细胞总RNA, 以逆转录产物作为模板,PCR扩增DAZAP2的开放阅读框（ORF）.采用定向克隆法与真核表达载体pEGFP-N1连接,转染大肠杆菌DH5α,经双酶切及测序证实.脂质体法转染COS7细胞后,运用Western 印迹及免疫定位技术检测表达产物.结果 测序证实真核表达重组质粒的阅读框没有发生改变,转染重组质粒的细胞表达融合蛋白DAZAP2-EGFP,主要在COS7细胞质中表达.结论 成功获得了DAZAP2真核表达重组质粒并有效地表达重组融合蛋白,DAZAP2主要定位在细胞质中的泡状分泌结构上.     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...     

口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的:构建口蹄疫病毒VP1基因的真核表达载体, 转染并筛选稳定表达VP1的树突状细胞(dendritic cell, DC).方法:将pMD-18-VP1克隆于pcDNA3.1(+)中, 构建重组质粒, 酶切鉴定, DNA测序证实序列正确后, 利用脂质体将重组质粒转染DC, 经含G418培养基筛选获得抗G418细胞克隆, 用Western blot鉴定FMDV VP1基因在DC中的表达.结果:构建的pcDNA3.1-VP1真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性, SDS-PAGE和Western blot结果显示G418筛选获得DC稳定表达VP1.结论:成功地构建了重组质粒pcDNA3.1- VP1真核表达载体, 并在DC中得到稳定表达.     

Trim22缺失突变体真核表达载体的构建

目的构建Trim22缺失突变体的真核表达载体,为进一步研究Trim22与HIV-1衣壳蛋白的相互作用奠定基础。方法以野生型Trim22真核表达质粒为模板,用PCR方法扩增出5种类型Trim22缺失突变体的基因片段,克隆到5`-Flag-pcDNA3.1(+)真核表达载体,通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定。将该载体转染HEK293T细胞,用蛋白印迹及免疫沉淀检测Trim22缺失突变体的蛋白表达。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建5种人Trim22缺失突变体的表达载体,载体均可以在HEK293T细胞中表达。结论成功构建5种人Trim22缺失突变体的真核表达载体,为探寻Trim22与HIV-1衣壳蛋白相互作用的关键结构域奠定了基础。     

顶体素结合蛋白真核表达载体的构建及其在肝癌细胞株的表达

目的:构建ACRBP真棱表达载体,建立稳定表达ACRBP的人肝癌细胞株,为后继研究该基因的功能奠定基础.方法:以pMAL-C2/ACRBP重组质粒作为模板进行PCR,扩增出ACRBP编码区cDNA,并与真核表达载体pEGFP-N1连接,构建pEGFP-N1/ACRBP重组质粒.通过Fugene HD将该重组质粒转染至ACRBP表达阴性的肝癌细胞株HepG2,经G418筛选阳性克隆获得稳定转染株.RT-PCR和免疫组织化学方法检测HepC-2细胞中ACRBP的表达情况.结果:pEGFP-N1/ACRBP真核表达载体经测序证实插入序列完全正确;ACRBP基因已经稳定转染至HepG2细胞中并获得表达.结论:成功构建了pEGFP-N1/ACRBP真核表达载体并将其转染HepG2后,能稳定地表达ACRBP.     

重组分泌型人CREG/myc-His融合糖蛋白的表达及功能分析

目的：构建人E1A激活基因阻遏子（Human cellular repressor of E1A-stimulated gene，hCREG）基因的真核表达载体并转染人293F细胞株，筛选稳定转染细胞克隆，鉴定重组的分泌型hCREG／myc．His融合蛋白的糖基修饰和生物学功能。方法：用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框并构建pcDNA4myc．His／hCREG真核表达载体；Lipofeetamine2000转染人293F细胞株并筛选稳定表达细胞克隆，去血清法诱导重组蛋白表达；应用Westernblot方法鉴定分泌型hCREG／myc-His融合蛋白的表达，糖苷酶法及Westernblot行hCREG／myc-His融合蛋白的糖基化分析；用流式细胞周期分析分泌型hCREG／myc．His融合蛋白对体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞（HITASY）增殖能力的影响。结果：RT-PCR扩增含终止密码突变的hCREGeDNA片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切构建了pcDNA4myc．His／hCREG真核表达载体，酶切及测序结果证实构建的重组质粒正确；Westernblot证实转染pcDNA4myc．His／hCREG的293F细胞克隆可以稳定表达并分泌hCREG／myc-His融合蛋白；糖苷酶分析证实分泌型hCREG／myc-His融合蛋白是糖基化蛋白；流式细胞周期分析证实与正常培养HITASY细胞比较，添加含有分泌型hCREG／myc-His糖蛋白上清的H1TASY细胞出现明显的G1期细胞周期阻滞现象（58．88％vs62．89％，P〈0．005）。结论：构建了pcDNA4myc-His／hCREG真核表达载体并表达了具有生物学功能的分泌型重组hCREG／myc-His糖蛋白。     

细胞周期蛋白E siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的构建细胞周期蛋白E(Cyclin E)小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,并检测其抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Cyclin E表达的效果。方法根据基因文库中Cyclin E的cDNA序列,设计并合成两段siRNA,分别转入到pGENESIL-1质粒中,并对重组质粒(命名为pGENESIL/Cyclin E-1和pGENESIL/Cyclin E-2)进行测序鉴定。脂质体介导下转染MCF-7细胞株,RT-PCR检测转染后Cyclin E的表达。结果Cyclin E siRNA真核表达载体构建成功,测序结果显示插入片段的方向和序列与预想一致。RT-PCR检测显示Cyclin E的表达显著降低。结论Cyclin E siRNA真核表达载体的成功构建为进一步研究以Cyclin E为靶位点对乳腺癌进行基因治疗奠定了重要的实验基础。