体外骨髓基质干细胞中腺病毒介导的胶质细胞源性神经营养因子基因的表达及其生物学活性

背景骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是外源性目的基因的良好靶细胞,在脊髓损伤的修复中具有良好的应用前景.目的观察重组腺病毒介导的胶质细胞源性神经营养因子(glial cellline-derived neurotrophic factor,GDNF)基因在体外培养的骨髓基质干细胞中的表达,并探讨其生物学活性.设计以细胞为研究对象,对照观察性研究.单位一所大学医院骨科实验室.材料实验于2004-03/06在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成.SD大鼠24只,雌雄不限,体质量(180±20)g.干预用重组腺病毒载体Adv-GDNF感染体外培养的BMSCs,并与脊髓背根神经节共培养.免疫荧光化学的方法检测BMSCs中的GDNF的表达,提取细胞总RNA进行RT-PCR扩增GDNF基因,应用ELISA方法检测其培养上清中的GDNF含量,并通过与脊髓背根神经节共培养观测GDNF的活性.主要观察指标主要结局①RT-PCR.②免疫荧光结果.③GDNF的体外活性.次要结局①BMSCs的培养与鉴定.②ELISA检测蛋白表达与时间的关系.结果免疫荧光显示Adv-GDNF感染BMSCs 48 h后即有GDNF的表达,体外培养的BMSCs经Adv-GDNF转染后有GDNF的转录,其培养上清应用ELISA方法分析,在感染24 h后即有GDNF的表达,并可持续5～7 d的高峰.Adv-GDNF感染的BMSCs的培养液上清可以促进脊髓背根神经节大量轴突的生长.结论Adv-GDNF基因可以在BMSCs中稳定、高效表达,其表达的GDNF具有促进轴突生长的活性,为GDNF基因治疗脊髓损伤的研究奠定了基础.     

GDNF基因诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究

目的 观察在体外培养的经GDNF基因诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）向神经细胞分化的表达.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,选取第3代细胞,应用GDNF基因诱导BMSCs分化两周,观察诱导后细胞的形态学变化,免疫荧光方法验证及鉴定神经元特异性烯醇化酶（NSE）及髓磷脂酸性蛋白2（MAP-2）的表达.结果 镜下观察细胞形态学以及特异性荧光可见BMSCs向神经细胞分化明显.结论 GDNF基因转染的BMSCs在体外培养情况下可转化为神经细胞,并表达特定神经细胞标志蛋白.     

GDNF-Enhanced Axonal Regeneration and Myelination Following Spinal Cord Injury is Mediated by Primary Effects on Neurons

我们先前研究表明胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）联合施万细胞移植能促进脊髓损伤后轴突再生和髓鞘形成。然而,GDNF介导这一过程的细胞靶点尚不清楚。在此,我们报道了GDNF可增加在体再生轴突的数目和直径,并促进体外背根神经节神经元的轴突向外生长,提示GDNF对神经元有直接作用。在施万细胞一背根神经节神经元共培养下,GDNF显著增加施万细胞生成的髓鞘数目;GDNF处理对孤立培养的施万细胞增殖无作用,但可促进已与神经轴突有突触联系的施万细胞增殖;GDNF可增加孤立施万细胞中分子量为140kDa的神经细胞黏附分子（NCAM）的表达,但对黏附分子L1表达或神经营养因子NGF、NT3及BDNF分泌没有影响。总之,这些结果支持假设：GDNF提高轴突再生和施万细胞髓鞘形成主要是通过GDNF对神经元的直接作用介导的,并且提示GDNF联合施万细胞移植可能是促进脊髓损伤后轴突再生和髓鞘形成的有效策略之一。     

表达融合基因FCU1骨髓间充质干细胞自杀基因系统的建立及其对结肠癌抑制作用的体外验证

目的:构建腺病毒载体介导表达融合自杀基因FCU1的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),验证其对结肠癌CT-26细胞生长的抑制作用。方法:体外分离小鼠BMSCs,构建重组FCU1基因腺病毒表达载体,包装获取病毒上清并感染BMSCs,MTT法检测5-FC对感染重组腺病毒后的BMSCs的抑制作用。感染重组腺病毒后BMSCs与CT-26细胞共培养,MTT法检测5-FC对CT-26细胞增殖的影响。结果:成功构建FCU1融合基因重组腺病毒载体,包装获得病毒滴度为2.6×1010pfu/mL,可有效感染小鼠BMSCs,MOI为200时,可感染95%以上的BMSCs,并且对5-FC敏感。与CT-26细胞共培养后,重组腺病毒感染的BMSCs达到7%时,可对超过50%的CT-26细胞发挥旁观者效应。结论:研究建立的表达融合基因FCU1的骨髓间充质干细胞自杀基因系统,可有效实现对CT-26细胞的抑制作用。     

hPDGF-A／hBD2双基因修饰骨髓源间充质干细胞外源基因体外与体内的表达

本研究观察腺病毒介导hPDGF—A／hBD2双基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（BM—MSC）体外以及移植后体内局部的外源基因表达情况。将已成功构建和包装的hPDGF—A／hBD2双基因共表达腺病毒体外感染原代分离培养的BM—MSC后,采用免疫荧光细胞化学法检测目的基因蛋白的表达。收集经重组腺病毒感染的BM—MSC的无血清培养上清,采用划痕试验检测培养上清中分泌的hPDGF—A的促迁移效应。将重组腺病毒感染的BM—MSC局部点状注射至大鼠放射创伤复合伤创面,在各时相点进行冰冻切片并观察创面移植的BMSC的分布,同时采用免疫组织化学的方法观察外源基因的表达。结果表明：在体外重组腺病毒感染后的大鼠BM—MSC表达报告基因EGFP。免疫荧光细胞化学检测显示双基因修饰的BM—MSC表达hPDGF—A和hBD2。划痕实验证实双基因修饰BMSC培养上清组在8、12、24和30小时的愈合面积百分比显著高于对照组（P〈0．05）。荧光显微镜观察大鼠创面移植的外源性基因修饰的BM—MSC显示,至少在移植后2周之内BM—MSC可以较高水平地表达以EGFP为指示的外源基因。创面免疫组织化学染色表明,外源基因从第3天开始表达,第7天达到高峰,第21天仍有少量表达。结论：hPDGF—A／hBD2双基因修饰BM—MSC在体外、体内均可使目的基因得到有效表达,成为hPDGF—A／hBD2双基因修饰BMSC促进难愈创面愈合的基础。     

胶质细胞源性神经营养因子修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的效果

目的观察胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法以载GDNF基因的重组腺病毒转染BMSCs以诱导其分化。选取36只SD大鼠制成脊髓损伤模型,随机分成3组。对36只大鼠于造模后1、2、3、4周行BBB评分,并于造模后第4周取材行HE染色及免疫组化染色,观察脊髓损伤修复情况。结果载GDNF基因重组腺病毒转染后,BMSCs可持续、稳定表达较高水平的GDNF,并能成功诱导BMSCs向神经元样细胞分化。术后1~4周,C组BBB评分均明显高于其他2组,A组最低且无明显变化;术后4周HE染色结果显示,A组脊髓空洞面积最大,C组空洞面积最小;术后4周,A组脊髓损伤部位出现少量NF200、GFAP阳性细胞,C组较B组和A组则明显增多。结论 GDNF基因修饰的BMSCs能成功分化为神经元样细胞,移植后对大鼠脊髓损伤具有一定的修复作用。     

间充质细胞与骨组织共培养条件下的成骨特性

目的：在与骨组织间接共培养的条件下，观察体外培养的兔骨髓间充质干细胞的成骨特性。方法：通过间接共培养模型的建立，将新鲜兔骨碎粒及骨块与BMSCs间接共培养，观察细胞的形态学变化，碱性磷酸酶（ALP）的活性及矿化能力，免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素。结果：共培养的BMSCs同期ALP活性及细胞的矿化能力均显著高于普通培养组(P&;lt;0．01)；经过共培养的BMSCs，其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性；对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性。结论：体外建立的共培养模型部分模拟了体内成骨环境，经过共培养的BMSCs呈现向成骨细胞转化的特点。     

Wnt信号通路对体外培养小鼠雪旺细胞增殖及其促进神经元轴突生长作用的研究

目的研究Wnt/β-catenin信号通路在加入GSK-3β抑制子后促雪旺细胞增殖过程中的作用,探讨雪旺细胞促进神经元轴突生长的可能的信号分子机制。方法体外培养纯化雪旺细胞,S-100免疫荧光鉴定;采用GSK-3β抑制子作用雪旺细胞,观察雪旺细胞的形态学改变并计数;培养小鼠背根神经节神经元,与活化的SCs细胞共培养,用Western blot检测β-catenin在与活化的雪旺细胞共培养的神经元内的表达情况,评价其促神经元轴突生长的功能特性。结果 GSK-3β抑制子可促使雪旺细胞发生形态学上的变化及增殖;Western blot的结果表明GSK-3β抑制子可使神经元内β-catenin表达增加。活化的SCs细胞与背根神经节神经元共培养,与未活化的SCs细胞共培养的神经元相比,其神经元轴突长度显著增长,差异有统计学意义(P0.05)。结论 Wnt信号通路活化后可使体外培养的雪旺细胞发生形态学变化及增殖,Wnt/β-catenin通路在促进雪旺细胞的生长过程中发挥作用;活化的雪旺细胞与神经元共培养,使神经元轴突增长及β-catenin表达增高。     

复方倍他米松局部注射后自体髓核移植模型大鼠脊髓及背根神经节中P物质和降钙素基因相关肽变化

背景：复方倍他米松注射液治疗椎间盘突出症临床应用广泛,但其具体作用机制尚不明确。目的：探讨局部注射复方倍他米松对自体髓核移植模型大鼠脊髓及背根神经节中P物质和降钙素基因相关肽的影响。方法：36只SD大鼠随机分为4组,即：空白组、模型组、假手术组、西药组,每组9只。模型组和西药组适应性喂养1周后手术制作大鼠自体髓核移植模型。于术后第3,7,12天,模型组和假手术组给予128.25μL生理盐水,西药组给予复方倍他米松注射液13.5μL＋2%利多卡因注射液67.5μL。末次给药12 h取L4-6节段脊髓及背根神经节,采用免疫荧光染色方法测定两种组织中P物质和降钙素基因相关肽的含量。结果与结论：各组大鼠脊髓、背根神经节中P物质和降钙素基因相关肽平均荧光强度比较,差异有显著性意义（P 〈0.01）,进一步两两比较：与空白组、假手术组相比较,模型组大鼠脊髓、背根神经节中P物质和降钙素基因相关肽含量显著性增高（P 〈0.01）,证明模型复制可靠;与模型组、假手术组相比较,西药组大鼠脊髓、背根神经节中P物质和降钙素基因相关肽含量显著性降低（P 〈0.01）。结果表明复方倍他米松治疗腰椎间盘突出症的作用机制,可能是通过抑制背根神经节神经元合成和分泌P物质,清除背根神经节中P物质和降钙素基因相关肽,减少其向脊髓传递,从而抑制和缓解疼痛。     

再造阴茎感觉重建过程中背根节胶质细胞源性神经营养因子基因表达的变化及意义

目的：研究兔再造阴茎感觉重建过程中背根节感觉神经元内胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的表达变化及其意义。方法：建立成年新西兰雄兔再造阴茎感觉重建的动物模型，分别于术后1，2周，1，3个月灌注取材S2节段背根节。用RT-PCR法检测不同时间背根节感觉神经元内GDNF mRNA的表达情况。结果：GDNF mRNA在正常背根节感觉神经元内存在少量表达；感觉重建早期背根节内GDNF mRNA的表达显著增强，1个月时轻度下调，至术后3个月恢复正常水平。结论：GDNF是再造阴茎感觉重建过程中参与“胞体-轴突-靶器官”途径恢复重建的重要保护性因素。     

神经巢蛋白抗原在兔骨髓源神经干细胞分化各阶段的表达

目的：检测神经巢蛋白抗原在兔骨髓基质细胞（hone marrow stromal cell，BMSCs)向神经细胞方向分化不同阶段的表达情况，为寻找骨髓基质细胞源性神经干细胞移植修复神经损伤最佳阶段提供体外实验依据。方法：以免BMSCs为实验对象，以“CYTOKINE&;#183;神经干细胞培养基”培养，并分作对照组胶质源性神经营养因子（GDNF，1μg/L)+维甲酸(0．5mg／L)组及“碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，10μg／L)组。免疫荧光细胞化学鉴定神经于细胞神经巢蛋白抗原、以流式细胞仪（FCM）鉴定分化各阶段表达神经巢蛋白的细胞比例结果。部分兔BMSCs在相应培养条件下分裂增殖为含粗大胞质颗粒的大圆形细胞，这些细胞表达神经巢蛋白，并能进一步分化成神经组织样细胞。FCM检测结果：经纯化的BMSCs中神经巢蛋白(+）细胞占了5．52％，随着分化的进行，在对照组分化第8天为1.56％，第16天为0．47％。GDNF+维甲酸组第8天为1.84％，第16天降至0.31％。而bFGF组，分化第8天神经巢蛋白(+）细胞比例升至6.18％，第16天则降至1．33％。结论：在以上实验条件下可诱导兔BMSCs向神经干细胞及神经组织样细胞转化的功能。在BMSCs向神经组织样细胞方向分化过程中，神经巢蛋白的表达呈下降趋势。而bFGF可使表达神经巢蛋白的细胞比例增高，可用千体外富集神经干细胞。     

硬膜外腔植入髓核对大鼠脊髓背根神经节TNF-α和IL-1表达的影响

目的：观察硬膜外腔植入异体髓核对大鼠L6-S1脊髓背根神经节细胞TNF-α和IL-1表达的影响,以期为椎间盘源性疼痛发病机制提供细胞生物学基础。方法：雄性SD大鼠（体重260—280g）随机分为4组：脂肪＋生理盐水组（FS组）、脂肪＋胶原酶组（FE）、髓核＋生理盐水组（NS）、髓核＋胶原酶组（NE组）,每组6只。术后第15天取L6-S1脊髓背根神经节,采用免疫组织化学染色方法观察髓核对背根神经节细胞炎性介质TNF-α和IL-1表达的影响。结果：术后15天FE组大鼠与FS组相比,背根神经节细胞TNF-α表达差异没有显著性意义（P〉0.05）;NS组与FE组相比背根神经节细胞TNF-α表达显著增加（P〈0.05）;NE组与NS组相比背根神经节细胞TNF-α表达显著降低（P〈0.05）,接近于FS组水平（P〉0.05）。IL-1在各组大鼠背根神经节中未染色。结论：硬膜外腔植入异体髓核可引起背根神经节细胞TNF-α表达增加。     

重组腺病毒介导神经营养因子基因转染对体外培养脊髓神经元存活和分化的影响

目的观察神经营养因子对体外培养脊髓神经元存活和分化的影响。方法选取新生1 d的大鼠,无菌条件下分离脊髓背根神经节神经元,在培养过程中分别用Ad-BDNF和Ad-NT3转染细胞,细胞纯度鉴定采用细胞形态学和免疫荧光染色方法进行,在转染后的不同时间观察培养细胞中NSE阳性细胞率。结果 Ad-BDNF和Ad-NT3转染后脊髓神经元持续培养15 d,脊髓神经元的存活率明显高于单纯脊髓神经元培养对照组。BDNF和NT3能够增加神经元的数目,联合应用效果更好。结论 BDNF和NT3基因转染对原代培养的脊髓神经元存活有较强的促进作用。     

肢体负压对周围动脉闭塞犬脊髓及背根神经节降钙素基因相关肽免疫反应性神经的影响

背景：伤害性刺激可引起脊髓及背根神经节降钙素基因相关肽分泌的增多，及其微血管的强烈扩张。应用肢体负压治疗周围动脉闭塞性病变时，其扩张血管，减轻肢体疼痛症状的作用是否伴随着降钙素基因相关肽合成增多。目的：对周围动脉闭塞性病变犬行肢体负压干预后，检测脊髓及背根神经节中降钙素基因相关肽免疫反应阳性神经纤维的变化、设计：随机分组，实验组及空白组对照的验证性研究。单位：一所军医大学医院普外科，材料：实验于2003-01／08在第四军医大学西京医院完成。成年健康杂种犬17只，体质量(12～18)kg，雌雄不限、干预：犬17只，随机分为3组。①治疗组10只：将动物制作左后肢缺血模型，制作后14d，开始行患肢负压治疗10d，结束后，取L1-5的脊髓及背根神经节，行免疫组化染色，检测降钙素基因相关肽免疫反应阳性纤维。②单纯造模组5只：造模后不进行患肢负压治疗．处理、检查均同治疗组。③正常对照组2只：不行缺血模型制作及负压治疗，仅行免疫组化染色检测。主要观察指标：3组犬脊髓及背根神经节中降钙素基因相关肽免疫反应阳性纤维分布。结果：17只犬均进入结果分析。①脊髓及背根神经节中降钙素基因相关肽免疫反应阳性纤维单纯造模组明显高于治疗组和正常对照组[(75．00&;#177;4．30)％，(68．20&;#177;2．60)％；(58．20&;#177;5.10)％．(52．20&;#177;6．20)％；(37．00&;#177;4．20)％，(34．00&;#177;1．40)％，P&;lt;0．01]②阳性神经纤维检测结果：治疗组比单纯造模组染色变浅，但仍较正常对照组加深，3组比较差异意义显著(P均&;lt;0．01]结论：肢体负压疗法可以减少周围动脉闭塞性病变后脊髓及背根神经节中降钙素基因相关肽免疫反应阳性纤维的合成与痛觉的传递，即减少伤害性刺激的传入，从而达到缓解肢体疼痛的效果。     

细胞共培养体系在观察骨髓间充质干细胞对损伤脊髓神经元生长存活影响中的应用

目的:建立细胞共培养体系,观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)对正常及损伤的脊髓神经元的影响。方法:选取新生7d的大鼠,无菌条件下分离骨髓间充质干细胞。选取新生24h的大鼠,无菌条件下分离脊髓背根神经节神经元,并制备机械损伤的模型细胞。用Transwell可渗透培养皿构建共培养体系,通过细胞形态学,免疫细胞化学方法进行细胞纯度鉴定,观察不同条件作用下神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞的存活。结果:共培养组神经元细胞NSE阳性率较相应对照组高。在BMSCs与神经元共培养到第6天,计数神经元的存活率,单纯神经元细胞培养组仅有40%的神经元存活,而共培养组神经元的存活率达到65%。单纯损伤神经元细胞培养组仅有26%的神经元存活,共培养组神经元的存活达到51%,细胞凋亡的数量较对照组明显低。结论:BMSCs可促进正常的脊髓神经元存活,对损伤的脊髓神经元有保护作用,并能诱导神经前体细胞分化为脊髓神经元。     

大鼠背根神经节持续受压后脊髓背角TRPV4蛋白表达及分布的变化

目的:探讨大鼠背根神经节持续受压(chronic compression of the dorsal root ganglion,CCD)后瞬时感受器电位离子通道香草素亚族受体4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)在脊髓背角中的蛋白表达及分布规律。方法:选取清洁级雄性Wistar大鼠30只,按随机数字表法分组:空白对照组5只,手术组25只(术后4天、7天、14天、28天各5只;免疫荧光组5只)。制备大鼠背根神经节持续受压模型,于术后4天,7天,14天及28天,测量机械刺激缩爪反应痛阈,观察机械痛阈的变化;利用western blot技术检测空白对照组及术后4天,7天,14天及28天,手术侧及对侧脊髓背角TRPV4蛋白表达的变化;利用免疫荧光技术检测术后4天,手术侧与对侧脊髓背角TRPV4阳性细胞分布。结果:大鼠背根神经节持续受压后4—14天,机械痛阈值明显下降(P0.001);术后4—7天,手术侧脊髓背角TRPV4表达升高(P0.01),对侧无明显变化;手术侧脊髓背角内TRPV4阳性细胞数目高于对侧(P=0.0008)。结论:大鼠背根神经节持续受压后,机械痛阈下降的同时,手术侧脊髓背角内TRPV4蛋白表达上调及阳性数目增多,TRPV4可能参与CCD后病理性神经痛的中枢敏化机制。     

不同浓度血清对大鼠骨骺干细胞向软骨细胞分化的诱导效果比较

背景：血清成分复杂，其中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细胞生长抑制因子，因此合适的血清浓度对于体外培养细胞的增殖和分化至关重要。目的：比较不同浓度的胎牛血清对大鼠骨骺干细胞向软骨细胞分化的影响。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007—03／10在华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科研究室完成。材料：纯系清洁级新生24h内的SD大鼠8只，用于制备骨骺干细胞。胎牛血清为Gibco公司产品。方法：免疫磁珠分离纯化FGFR-3阳性的骨骺干细胞，稳定传至第3代后，分别用含1．25％，2．5％，5％，10％胎牛血清的软骨诱导培养基进行干预，诱导14d。主要观察指标：BrdU．ELISA法检测细胞增殖活性。应用免疫荧光染色和RT—PCR法检测细胞Ⅱ型胶原的表达。结果：骨骺干细胞向软骨细胞诱导14d后，10％胎牛血清组细胞增殖活性显著高于1．25％，2．5％，5％胎牛血清组（P〈0．05）：10％胎牛血清组Ⅱ型胶原免疫荧光染色阳性程度及Ⅱ型胶原mRNA的表达均明显强于其他3组。结论：含10％胎牛血清的软骨诱导液更有利于骨骺干细胞向软骨细胞方向分化。     

神经营养因子对成年大鼠脊髓损伤后皮质脊髓束再生的影响

背景：胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对脊髓运动神经元的存活有明显的保护作用，但GDNF对成年大鼠脊髓损伤后皮质脊髓束再生是否有促进作用仍不清楚。目的：研究胶质细胞源性神经营养因子对脊髓损伤后皮质脊髓束再生的保护作用。设计：随机对照实验。地点和材料：本实验在第二军医大学神经生物实验室完成。实验动物采用雄性成年SD大鼠64只，体质量250～300g。干预：采用Nystrδm法制备大鼠胸髓后路压迫损伤模型，压迫质量为50g，时间为5min，造成大鼠胸段脊髓急性重度损伤。脊髓损伤后24h，对照组注射6μL阳离子脂质体DC-Chol和2μg pCDNA3的混合物，实验组将6μL DC-Chol和2μg重组质粒pEGFP-GDNF cDNA混合后注入大鼠损伤脊髓。主要观察指标：应用RT-PCR技术和荧光显微镜检测GDNF体内转基因后在局部的表达，通过辣根过氧化物酶(HRP)顺行追踪技术和神经微丝(NF)免疫组化活性的变化来评价GDNF基因体内转染对大鼠皮质脊髓束再生的影响。结果：GDNF基因体内转染1周后发现在基因注射局部有转录和蛋白水平表达，4周后在脊髓损伤周围仍检测到GDNF蛋白表达。脊髓损伤后4周，实验组脊髓损伤区皮质脊髓束HRP标记明显多于对照组，仅在实验组可见部分神经纤维穿过损伤区至远端5～9mm。损伤区NF阳性轴突数(524．33&;#177;80．55／低倍视野)较对照组(309．84&;#177;56．65／低倍视野)明显增多(P&;lt;O．01)，GFAP阳性细胞数(186．68&;#177;16．25)明显少于对照组(239．78&;#177;21．44)(P&;lt;O．01)。结论：阳离子脂质体介导GDNF体内转基因能促进近端皮质脊髓束再生和神经骨架蛋白的修复，提示神经营养因子基因治疗可用来治疗创伤性脊髓损伤。     

动物模型中人骨形态发生蛋白2重组腺病毒活性观测

目的：利用基因工程技术构建人骨形态发生蛋白2重组腺病毒，并进行体内表达，测定活性；为深入开展的基因治疗研究创造条件。方法：实验于2000—05／2002—06在西安交通大学第一附属医院骨科实验室完成。应用PcR技术扩增出人骨形态发生蛋白2全长基因，体外同源重组构建重组腺病毒后，随机将30只SD大鼠分为治疗组和对照组，每组15只，将纯化后的重组腺病毒50μL注入sD大鼠股部肌肉陷窝病损处，通过组织学染色、X射线片对动物模型的组织变化进行观测。结果：6周后治疗组可见明显骨诱导形成，2周时治疗组碱性磷酸酶活性明显高于对照组，重组腺病毒治疗组有明显的诱导成骨活性。结论：应用于动物实验中目的基因表达，并具有生物学活性。本研究是在骨缺损基因治疗的一次尝试，且人骨形态发生蛋白2重组腺病毒的构建成功，也为国内骨科疾病基因治疗的进一步研究提供了基础。     

腺病毒介导hRAMP1基因转染血管平滑肌细胞的增殖和凋亡

背景：外源性受体活性修饰蛋白1基因转染可能对血管平滑肌细胞增殖调控具有重要的作用。目的：探讨腺病毒载体介导人受体活性修饰蛋白1基因对体外培养的兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法：分离培养获得兔主动脉血管平滑肌细胞,分别以携带人受体活性修饰蛋白1基因的腺病毒和空腺病毒转染后,分成人受体活性修饰蛋白1组、空病毒组和对照组。结果与结论：腺病毒转染细胞后随时间延长,报告基因绿色荧光蛋白表达逐渐增加,72h表达最强,感染率达80%,96h时仍有绿色荧光蛋白表达。人受体活性修饰蛋白1组的受体活性修饰蛋白1蛋白表达增加,血管平滑肌细胞凋亡率增加,细胞增殖明显抑制,与空病毒组和对照组比较差异有显著性意义（P〈0.05）。提示人受体活性修饰蛋白1基因感染血管平滑肌细胞后明显抑制血管平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡。