促进包涵体蛋白复性的几种有效添加剂

利用大肠杆菌高水平表达重组蛋白时,由于缺乏翻译后加工过程,目的蛋白通常以无活性的包涵体的形式产生。在包涵体蛋白复性过程中,溶解的蛋白质容易相互聚集生成沉淀,成为复性技术中最难以克服的问题。目前通常的做法是在复性过程中加入适当的添加剂,使其在最佳反应条件下促进蛋白质重折叠为活性形式。本文旨在介绍几种有效的促进复性的添加剂及其最佳使用条件,为研究者提供一定的借鉴。     

表达于大肠杆菌中的人源性抗CTLA4单链抗体复性方法探索

探索表达于大肠杆菌中的人源性抗CTLA4单链抗体(Anti-CTLA4-scFv)的体外复性方法。采用稀释和透析两种复性方式,并分析影响复性得率的各种因素如复性时间、温度、适宜的氧化-还原体系对其的影响。通过非还原电泳确定复性效果,并测定蛋白含量。结果显示:含0.15mol·L-1NaCl、1μmol·L-1氧化型谷胱甘肽和3μmol·L-1还原型谷胱甘肽的50mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)缓冲液作为Anti-CTLA4-scFv的复性液,4℃下透析复性48~54h,可获得具有天然构象的蛋白质。该方法复性蛋白得率高,从3.9g菌体中可复性获得28mg蛋白。     

感光受体外周蛋白结合蛋白对虫荧光素酶体外折叠的促进作用

探讨感光受体外周蛋白结合(PBP)在体外是否有促进变性蛋白质复性的作用。虫荧光素酶用盐酸胍变性，然后在PBP，HSP70，HSP60存在下进行复性，用虫荧光素酶分析系统检测该酶的复性程度。结果显示PBP对虫荧光素酶的复性能力很低，当与HSP70同时作用时，酶活力明显高于BP或HSP70组，而PBP与HSP60组合对酶的复性能力较HSP60组未见有明显差异；当PBP，HSP70，HSP60三者同时存在时，酶活力恢复率最高。去除复性缓冲液中的ATP及其再生系统，酶活力的复性率明显下降。结果表明PBP具有协助HSP70，在ATP依赖的情况下促进变性虫荧光酶体外复性的分子伴侣功能。     

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv／鼠HSP70融合蛋白复性条件的研究

目的探讨大肠杆菌表达的卵巢癌抗独特型单链抗体／小鼠热休克蛋白70（6811ScFv／mHSP70）融合蛋白包涵体变性、复性条件,以确定其最佳体外复性条件。方法大肠杆菌表达大量融合蛋白6811ScFv／mHSP70：①比较不同的裂解液（8mol／L尿素和6mol／L盐酸胍）对包涵体的裂解效率及其对复性蛋白活性的影响;②探索序贯稀释方法,以及氧化还原环境和复性液中不同浓度L-精氨酸对蛋白稀释复性的影响;③比较稀释复性和柱。卜复性对融合蛋白复性效率及活性的影响。采用Bradford法测定包涵体裂解液与复性后蛋白浓度。所有复性蛋白活性的检测均采用ELISA方法。结果以包涵体形式表达6811ScFv／mHSP70蛋白：①经6mol／L盐酸胍裂解包涵体的效率远高于8mol/L尿素,但前者复性所得蛋白活性低,6mol／L盐酸胍彻底裂解的包涵体经8mol／L尿素透析后再复性,复性效率显著提高;②序贯稀释方法可提高蛋白复性效率;加入0．5mol／L L-精氨酸可降低稀释复性过程中蛋白聚集物的产生,提高复性效率;加入还原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSH）浓度比为1：5时,可提高复性后蛋白活性;③柱上复性可一步完成蛋白的复性和纯化,所得蛋白纯度较高,但复性效率和复性后蛋白活性较稀释复性低。结论本研究建立了6811ScFv／mHSP70融合蛋白的最佳复性条件：包涵体经6mol／L盐酸胍彻底裂解后,再经8mol／L尿素透析,然后进行序贯稀释复性,且复性液中加入0．5mol／L L-精氨酸和GSH：GSSH=1：5以提高复性效率和蛋白活性,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

蛋白质折叠与装配研究新进展

蛋白质折叠与装配成天然状态的机制,过去根据离体复性实验观察认为是自组装,而近几年来的研究表明体内蛋白质的折叠与装配并非如此,而是常常依赖于其它辅助因子和ATP水解供能,为辅助性组装。这些辅助因子基本可概括为分子内伴侣、酶类和分子伴侣三大类。     

胍变性人胎盘碱性磷酸酶复性的研究

目的:检测胍变性人胎盘碱性磷酸酶复性过程中活力与构象的变化,探讨其折叠机制.材料与方法:应用分光光度法测定复性酶活力,荧光法检测其内源荧光发射光谱.结果:盐酸胍变性平衡态酶用直接稀释法及空气氧气法进行复性,其最适复性条件是:胍稀释浓度0.5 mol/L,温度4℃,复性液pH9.0,时间24小时.在此条件下,测得不同浓度盐酸胍变性酶经稀释复性后的酶活力及其内源荧光光谱显示:变性中间态酶复性后的酶活力及内源荧光光谱可恢复至天然态,而变性酶只能部分恢复,且随胍浓度的增加,恢复愈加困难,当胍浓度为6.0 mol/L时,变性态酶经复性后的酶活力与内源荧光光谱则完全不能恢复.结论:变性中间态酶可完全复性,而变性态酶仅部分复性,且与复性条件有关.     

大肠杆菌外源基因表达产物的下游技术

以大肠杆菌作为工程菌的外源基因产物常以包涵体形式存在，这使得这类基因工程下游工艺具有不同于其它蛋白质纯化的特点，下游工艺包括包涵体提取，重组蛋白变性、复性、纯性、活性检测等复杂技术环节。     

MMP9-PEX的原核表达、纯化与复性研究

目的 对人基质蛋白酶9(matrix metalloproteinase,MMP9)C端血红素结合蛋白样结构域(hemopexin domain,PEX)的原核表达条件、透析复性条件进行优化,以获得高表达的活性蛋白.方法 将构建好的原核表达载体PET-his-MMP9-PEX转化至大肠埃希菌菌株BL21(DE-3),异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后产生包涵体蛋白,探讨不同IPTG浓度、不同诱导时间、不同菌液密度值对目的 蛋白表达产量的影响;盐酸胍裂解包涵体,采用NI-NTA进行纯化,对纯化蛋白的透析复性条件进行优化;采用明胶酶谱的方法检测MMP9-PEX的活性.结果 经纯化透析复性后蛋白的纯度在95%以上,复性回收率为36.86%.结论 本研究优化了MMP9-PEX的原核表达、透析复性条件,获得了有活性的MMP9-PEX蛋白,为进一步研究MMP9-PEX的功能提供了实验基础.     

大肠杆菌表达的人源性抗CTLA4单链抗体三种复性方法比较

比较表达于大肠杆菌中的人源性抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4单链抗体(A n ti-CTLA 4 scFv)的三种体外复性方法的复性效率。稀释、透析和亲和柱上三种复性方式复性A n ti-CTLA 4 scFv,采用B rad ford法分析蛋白复性得率,采用间接细胞EL ISA法检测所得蛋白的活性。透析复性蛋白得率最高,稀释复性蛋白得率其次,亲和柱上复性蛋白得率最低;透析复性所得蛋白结合活性是稀释复性的1.95倍,是亲和柱上复性所得蛋白活性的4.13倍(无谷胱甘肽氧化还原对G SH/G SSH)及3.63倍(有G SH/G SSH)。结论:采用含0.15 m o l/L N aC、l1 mm o l/L G SSH和3 mm o l/L G SH的50 mm o l/L T ris-HC l(pH 8.0)缓冲液作为A n ti-CTLA 4 scFv的复性液,4℃下透析复性48 h,可获得较高复性得率和结合活性。     

大肠杆菌表达的新一代重组人内皮抑素复性条件的优化

目的优化新一代重组人内皮抑素(rhED)的复性方案并检测其抗血管生成活性。方法用6 mol/L盐酸胍溶解rhED包涵体后,用稀释法与透析法相结合的方法进行复性,优化最适复性条件。复性结束后用阳离子交换层析纯化。并用rhED特异性单抗和鸡胚绒毛尿囊膜实验检测复性后蛋白的活性。结果通过优化复性条件,rhED的复性率可达到46%。复性、纯化后的rhED能与rhED特异性单抗反应,并在鸡胚绒毛尿囊膜实验中显示出抑制血管生长的活性。结论提高rhED复性率的复性条件可极大地促进新一代rhED的临床前及临床研究。     

大肠杆菌外源基因表达产物的下游技术

以大肠杆菌作为工程菌的外源基因产物常以包涵体形式存在，这使得这类基因工程下游工艺具有不同于其它蛋白质纯化的特点。下游工艺包括包涵体提取，重组蛋白变性、复性、纯性、活性检测等复杂技术环节。本文主要对活性检测之外的各技术环节要点进行综述。     

scFv-DEC205-Trap重组包涵体靶向抗原复性及过程的优化北大核心CSCD

目的:疫苗防治将成为金黄色葡萄球菌防控的主要方式,如何解决靶向亚单位疫苗生产中包涵体靶向抗原的复性问题,将是蛋白亚单位疫苗生产的核心问题。方法:构建靶向树突状细胞DEC205受体的金黄色葡萄球菌重组scFv-DEC205-Trap质粒进行PCR、测序鉴定,IPTG诱导表达。对表达后形成的包涵体各项溶解条件:溶液、溶解温度、溶解时间以及是否振荡进行单因素优化;对复性缓冲液的不同添加剂和稀释浓度进行条件优化,最大限度提高包涵体蛋白复性率,Western blot检测复性蛋白抗原性。结果:离心力大于400 g,离心3 min以上,96%的包涵体蛋白沉降;含8 mol/L的尿素溶液在4~40℃溶解0.5 h以上可使包涵体蛋白充分溶解;3 mol/L精氨酸的100 mmol/L Tris-HCl缓冲液稀释5倍复性率最高,抗原性好。结论:实验证明通过适宜的溶解条件和复性条件可以从表达包涵体中获得良好抗原性的重组靶向抗原。     

比较蛋白质组学在肝癌研究中的进展

随着人类全基因组计划的完成,生命科学的研究重点由基因转移到蛋白质上来,蛋白质组学(proteomics)应运而生.后者以蛋白质组为研究对象,以全面蛋白质的性质为研究基础,在蛋白质水平探讨对疾病机制、细胞模式和功能联系的科学[1].采用高分辨率的蛋白质分离手段,结合高通量的蛋白质鉴定技术,全面研究特定情况下蛋白质的表达谱.蛋白质具有动态性、多样性、时间性、空间性和特异性,其合成受多因素的调控.不同的组织细胞蛋白质的合成、表达的种类和数量有很大的差异,即使细胞发育的不同阶段,其蛋白质组的构成也在不断的变化.因此,蛋白质组是在空间和时间上动态变化着的整体,分析不同条件下蛋白质组的变化,发现和鉴定不同生理条件下蛋白质组的成分差异,是比较蛋白质组学的研究内容[2,3],即比较不同蛋白质组之间蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异.本文就比较蛋白质组学及其在肝细胞癌研究中的进展进行综述.     

重组人骨形成蛋白－2在大肠杆菌中的表达、纯化和复性

目的:通过对大肠杆菌表达重组人骨形成蛋白－2的复性研究,得到高活性的重组人骨形成蛋白－2。方法:在大肠杆菌中通过温度诱导表达重组人骨形成蛋白－2经过Triton X-100清洗之后,又通过DEAE离子交换层析纯化包涵体,包涵体在8 mol/L 尿素变性溶解,在氧化－还原(还原型和氧化型谷胱甘肽)复性系统中,通过简单的稀释复性,通过肝素亲和层析一步纯化法纯化重组人骨形成蛋白－2,最后通过诱导C2C12细胞产生碱性磷酸酶检测重组人骨形成蛋白－2活性。结果:温度诱导表达重组人骨形成蛋白－2是以包涵体单体的形式存在,经过几步纯化后,得到高纯度的包涵体。重组人骨形成蛋白－2在不同氧化－还原剂比例,和不同小分子化学辅助剂浓度中复性,得到复性的效率也不同。亲和层析纯化后,本实验得到重组人骨形成蛋白－2的生物学活性比商业化的重组人骨形成蛋白－2更高。结论:重组人骨形成蛋白－2属于转化因子－β家族,此复性方法可能应用于此家族的其他成员同时得到成本低、产量高的重组人骨形成蛋白－2,可能为临床应用创造了良好的条件。     

人胎盘碱性磷酸酶复性效率的影响因素探讨

目的:研究人胎盘碱性磷酸酶(HPAP)在盐酸胍变性态酶复性过程中加入巯基乙醇对其复性的影响,旨在探讨变性态酶的最适复性条件.方法:应用分光光度法和荧光法进行HPAP的盐酸胍变性及其加入巯基乙醇后变性态酶的复性.结果:在HPAP变性态酶复性过程中加入巯基乙醇,变性中间态酶仍可完全复性:变性态酶的复性率有明显的提高.复性率由27%增加到了68.5%,荧光发射波长由358 nm进而蓝移到347.5nm.结论:巯基乙醇可以提高HPAP胍变性酶的复性效率,从而更深入地阐明了HPAP结构与功能的关系.     

重组人源抗HBsAg单链抗体的纯化及亲和常数测定

目的:对融合6×His标签的人源抗乙型肝炎表面抗原单链抗体的包涵体进行纯化和复性, 并对复性产物的抗原结合性质进行鉴定。方法:工程菌表达的包涵体裂解后, 金属螯合亲合层析纯化, 然后以尿素透析、盐酸胍透析和金属螯合亲和层析柱原位复性3种方法进行复性;复性产物以免疫亲和层析精制, 非竞争酶免疫法测定亲和常数结果:盐酸胍透析复性产物的比活性最高, 蛋白回收率为(61.08±1.45)%;精制后的重组单链抗体的亲和常数为(2.30±0.32)×10⁷L/mol.结论:本株单链抗体可以应用优化的透析复性技术, 在体外高效复性, 其抗原结合性质不受N末端纯化标签的影响。     

2003年(第25卷)主题词索引

(按汉语拼音排序 )　　　　Ａ阿尔茨海默病　 318艾滋病　 6 5　　Ｂ白细胞介素类　 2 5 7,2 6 0半胱氨酸　 1苯丙氨酸　 2 4 8变性高效液相色谱法　 30 3ＥＢ病毒　 330病毒载体　 188,2 31　　Ｃ成骨细胞　 37雌激素　 112存活素　 2 0 9　　Ｄ单核苷酸多态性　 30 3,333Ｇ蛋白　 2 79ＬＩＭ蛋白　 131ＳＲ蛋白　 343蛋白质复性　 35 8蛋白激酶ＣＫ2　 2 5 4蛋白激酶家族　 2 11,2 5 4Ｓｍａｄｓ蛋白家族　 89,2 0 3,2 0 6蛋白水解酶复合体　 2 0 3蛋白质微阵列　 19蛋白质芯片　 19,137蛋白质组　 12 9,36 0ＣｐＧ岛　 12 1,2 91低氧诱导…     

免疫组化技术标准化的探讨

免疫组织化学技术由Coons首创于1950年,刘彦仿等[1]于1965年在国内首先建立了免疫组织化学技术.该技术经历了4个发展阶段:免疫组织化学各种方法不断建立和发展阶段;推广普及阶段;用于临床病理诊断及广泛应用阶段;该技术标准化、规范化及质量控制阶段.该技术具有很高的特异性、灵敏性、简便性,能将形态和功能代谢相结合,定性、定位和定量相结合,基因水平和蛋白质水平检测相结合,细胞水平和超微结构水平相结合.     

HIV-1型整合酶蛋白的表达、纯化及复性研究

目的对HIV-1整合酶蛋白进行原核表达、纯化以及复性研究。方法从HIV-1HXB2中PCR扩增出全长的整合酶基因，连入原核表达载体pET-30a中，得到pET-30a整合酶表达质粒。再将质粒转入大肠杆菌BL21中诱导表达，经镍柱纯化后得到整合酶蛋白。纯化后蛋白在FoldIt复性液中进行稀释复性确定最佳复性液，然后蛋白在此条件下复性并用反相柱回收，最后通过对复性蛋白抽干及再溶分析复性蛋白的物理稳定性。结果HIV-1整合酶蛋白主要以包涵体形式表达，表达量占菌体总量的10％。经镍柱纯化后蛋白的总浓度为0．9mg／ml。蛋白的最佳复性液是：Tris—Cl55mrnol／L，NaCl264mmol／L，KCl11mmol／L，Gu—HCl550mmol／L，EDTA1．1mmol／L，以及附加成分中的GSH、GSSG。复性后蛋白抽干后再溶，溶液清亮透明，SDS-PAGE可见有寡聚体状态的蛋白。结论成功构建了pET-30a整合酶表达质粒。纯化后蛋白的浓度较高。确定了最佳的蛋白复性液。并且初步检测了复性蛋白的物理稳定性。这为蛋白体外活性研究和AIDS药物研究打下了基础。     

抗H5N1禽流感病毒羊驼重链单域抗体的制备和功能鉴定

目的:获得具有中和活性、高特异性和稳定性的抗H5N1禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的羊驼重链单域(VHH)抗体。方法:利用pET-22b表达载体诱导表达抗H5N1禽流感病毒HA VHH抗体蛋白,以包涵体形式表达的VHH抗体蛋白采用最优复性方法进行复性后,获得高纯度的VHH抗体,分别采用ELISA法鉴定VHH抗体的亲和力和热稳定性,采用血凝抑制实验鉴定抗体的特异性和体外中和活性。结果:经复性的抗H5N1禽流感HA VHH抗体对H5N1禽流感病毒HA具有良好的特异性。通过对三种不同复性方法比较,利用柱上复性的VHH23抗体具有较好的热稳定性,亲和力为9.1×10-7mol/L,同时对H5N1禽流感病毒HA具有良好的体外中和活性。结论:实验结果表明通过原核表达获得具有较好中和活性、特异性及稳定性的抗H5N1禽流感病毒VHH抗体,为进一步开展抗体的体内病毒中和试验奠定良好基础。