蓝藻抗病毒蛋白-N的制备、生物活性鉴定及其多克隆抗体的制备和修饰

目的:纯化CVN重组蛋白,检测其抗病毒活性,制备CVN多克隆抗体,并对其进行纯化和修饰。方法:利用两步Ni-NTA亲和层析和一步SUMO酶切制备CVN抗原,CPE法观察其抗病毒活性,活性抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot鉴定其效价和特异性,抗血清经硫酸铵初步沉淀和DEAE离子交换层析获得纯化抗体,纯化抗体通过辣根过氧化物酶(HRP)标记获得修饰抗体。结果:纯化获得纯度达95%以上且具有明显抗流感病毒作用的非融合CVN,利用所得CVN抗原成功制备CVN多克隆抗体,酶联免疫分析显示其效价达到1∶16 000以上,Western blot分析表明其具明显特异性。抗血清经盐析和DEAE离子柱层析后获得效价为1∶6 400高纯度纯化抗体,经HRP修饰后获得具有较高生物活性的标记抗体。结论:获得高纯度,高效价兔抗CVN多克隆抗体,以及HRP标记的兔抗CVN多克隆抗体,为后续研究奠定了基础。     

多角度激光散射测定重组人核苷二磷酸激酶A在溶液中的聚集状态

目的和方法 :对重组人核苷二磷酸激酶A(rhNDPK -A)进行纯化 ,并对重组产物的理化性质及在溶液中的聚集状态进行测定。NDPK -A工程菌发酵后的菌体高压匀浆 ,然后微滤、超滤处理 ,所得样品经DEAE阴离子交换、Cibacronblue亲和层析、分子筛层析 3步纯化后 ,以SDS -PAGE和RP -HPLC分析纯化产物的纯度 ,RP -HPLC测定酶活性。合格制品以基质辅助激光解析飞行时间质谱测定分子量 ;Edman降解法测定N末端序列 ;多角度激光散射法测定重组产物在溶液中的表观分子量。结果 :rhNDPK -A纯化产物的SDS -PAGE纯度为 97 3% ,RP -HPLC纯…     

NDPK-A诊断试剂盒的研制

目的 建立一种灵敏、特异检测血清中二磷酸核苷激酶(NDPK-A)含量的酶联免疫吸附试验(ELISA)法和试剂盒,分析血清中的NDPK-A含量与血液病之间的关系.方法 筛选NDPK-A多株单克隆抗体和多克隆抗体,以建立检测NDPK-A的双抗体夹心ELISA方法.测定了84例健康人,35例白血病与淋巴瘤等血液病患者血清的NDPK-A含量.结果 单抗-多抗夹心ELISA法可测最适范围为1.56～100 μg/L,回归方程为y=-0.000 5x2 0.017 8x 0.089 2, 相关系数r2=0.999 3(y为A490 nm,x为 [NDPK-A]),批内变异系数4.75%～6.32%,批间变异系数11.06%～13.84%,回收率为90.52%～105.16%.84例健康人血清NDPK-A含量为1.75±0.92 μg/L,35例白血病与淋巴瘤患者血清的阳性检出率为16例.急性白血病,尤其是急性单核细胞白血病(M5)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者血清中NDPK-A水平与健康对照差异较大,分别为12.97±9.73、20.00±18.55 μg/L.结论 建立了一种可应用于临床检测NDPK-A 的ELISA方法,初步展示了NDPK-A含量检测的临床意义,NDPK-A含量检测可发展为白血病的辅助诊断和疗效判断指标.     

吗替麦考酚酯治疗重叠综合征的效果

目的：观察吗替麦考酚酯治疗重叠综合征的临床疗效、安全性,探讨吗替麦考酚酯对重叠综合征的治疗前景。方法将107例重叠综合征患者随机分为两组,对照组（54例）应用泼尼松治疗,观察组（53例）应用吗替麦考酚酯治疗,连用3个月为一疗程,通过治疗前后的临床表现、免疫学指标、肌酶及肝肾功能等多项实验室指标的对照研究,比较两组的疗效和安全性。结果观察组的总有效率为94.34％,对照组的总有效率为74.07％,观察组的总有效率明显高于对照组（ P＜0.05）。观察组的不良反应发生率为5.66％,对照组的不良反应发生率为25.93％,观察组的不良反应发生率明显少于对照组（ P＜0.05）。结论吗替麦考酚酯治疗重叠综合征疗效明显,安全性好。     

灭活SARS病毒的纯化鉴定及初步应用

为制备纯化的灭活SARS病毒,取广东省CDC提供的灭活SARS-CoV病毒培养液进行超滤,收集相对分子质量介于100000至500000之间的组分,并浓缩。对纯化过程中各组分进行抗原活性鉴定和蛋白质含量测定,并加佐剂后免疫动物,测定抗体免疫应答。结果表明,超滤后活性抗原蛋白质回收率7.6%,纯化倍数为9,抗原活性达到1:480。免疫家兔获得的血清ELISA效价达到1:10000以上,中和抗体效价达到1:2000以上。表明该纯化工艺能获得较高纯度的灭活SARS-CoV病毒颗粒。     

含有纯化标签的重组人表皮生长因子的构建及表达

目的:高效表达和制备有活性的人表皮生长因子(hum an ep iderm al growth factor,hEGF)。方法:用DNA重组技术构建EGF基因并插入表达载体pQE-40,与载体上的6×H is标签融合,获得的表达质粒pQE-EGF转化E.coliM15[pREP4],得工程菌M15[pQE-EGF]。MTT法测定活性,培养工程菌M15[pQE-EGF]并诱导目的蛋白表达,镍离子螯合亲和层析纯化重组EGF。结果:所构建的EGF序列正确,重组EGF在大肠杆菌中以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的21.2%,经镍离子亲和层析一步纯化后的重组EGF纯度达90%,得率为94%。复性后的重组EGF具有促Hela细胞生长活性。结论:以E.coliM15[pREP4]/pQE-40系统表达EGF具有技术路线简单、目的蛋白得率高、成本低等优点,是一种制备活性hEGF的有效手段。     

血清核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)含量测定及其临床意义初探

[目的]研究血清核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)含量与白血病的相关性,探讨血清NDPK-A含量检测对于白血病早期诊断和疗效判断意义。[方法]应用重组人NDPK-A及相应抗体建立双抗体夹心ELISA测定NDPK-A含量方法,应用此方法测定正常人和血液病患者血清NDPK-A含量。[结果]20例正常人血清NDPK-A含量为3.89±0.39μg/L,16例白血病患者血清NDPK-A含量为11.06±18.03μg/L,5例骨髓瘤患者患者血清NDPK-A含量为4.80±0.96μg/L,5例淋巴瘤患者血清NDPK-A含量为24.31±5.65μg/L。白血病患者治疗前后血清NDPK-A含量差异显著,7例治疗前患者NDPK-A含量为16.23±26.61g/L,治疗后患者NDPK-A含量为7.05±6.10g/L。[结论]建立的ELISA方法简单,灵敏、准确地测定血清NDPK-A含量;NDPK-A含量检测可发展为白血病的早期诊断和疗效判断指标。     

重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究表达重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺。方法首先采用摇瓶培养,对培养基配方、pH值、诱导表达时机和诱导剂量进行优化,确定基本发酵参数,然后在30L发酵罐上进行中试规模发酵培养。结果在摇瓶培养时,发现含有甘油和微量元素等成分的改良培养基效果明显优于LB培养基和2×YT培养基,另外,工程茵的最佳pH值为7.0,最佳诱导时机为对数中期,最佳诱导剂浓度为0.4mmoL/L异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖,最佳诱导时间为4h,将摇瓶培养确定的关键参数应用到30L发酵罐中,控制溶氧大于30%,进行3批发酵试验,发现发酵产物的湿菌产量可达58-61.9g/L,目的蛋白质表达量可达28.9%-31.2%以上。结论建立了工程菌M15[pQE-scFv]的中试发酵工艺,为进一步开发打下良好基础。     

热休克蛋白90抑制剂17-AAG对K562/ADR耐药细胞株生长和凋亡的影响

目的研究热休克蛋白90抑制剂17-AAG对耐药白血病细胞生长的影响及其诱导的细胞凋亡作用,为白血病的治疗提供新的研究思路。方法采用MTT法检测17-AAG对细胞增殖抑制的剂量-时间-效应关系;激光共聚焦DA-PI染色法观察细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞凋亡、周期及P-糖蛋白(P-gp)的变化,Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的变化。结果 17-AAG能够明显抑制K562/ADR细胞的生长,大量细胞的核内DNA发生断裂,细胞核边缘化,加药组细胞凋亡率与对照组相比明显增高;加药后细胞被阻滞在G1期,procaspase-3和cleaved Caspase-3表达升高。结论 17-AAG可以通过诱导耐药细胞株K562/ADR的凋亡而抑制细胞生长。P-gp和Caspase-3的表达与凋亡事件的发生具有一定的相关性。     

孔石莼抗病毒蛋白多糖的提取分离及抗柯萨奇病毒B3活性

目的 从绿藻孔石莼中分离具有抗病毒活性蛋白多糖提取物. 方法 新鲜孔石莼经pH 7.0的磷酸盐缓冲液提取和硫酸铵沉淀得到粗提取物,大孔树脂层析分离得到蛋白多糖.经紫外扫描、高温高压处理(121℃,15min)和糖苷酶水解测定提取物的性质.MTT法检测蛋白多糖对Hela细胞的毒性,细胞病变法(CPE)检测蛋白对柯萨奇病毒B3(CVB3)引起的细胞病变抑制作用.通过样品对细胞的保护作用、对CVB3增殖的影响、对CVB3感染细胞的综合作用,初步研究了样品抗病毒作用的机理.结果 从孔石莼中提取了蛋白多糖,得率为0.5%.毒性试验结果表明,孔石莼蛋白多糖对HeLa细胞的半数中毒浓度TC50大于8mg·ml-1.孔石莼蛋白多糖具有显著的抗CVB3活性,通过试验测得孔石莼蛋白多糖对CVB3主要是预防作用和直接杀灭作用,其IC50为3.7μg·ml-1.结论 从孔石莼中分离到具有抗病毒活性的蛋白多糖,具有很好的抗CVB3活性.