醉香含笑树皮提取物诱导HepG2细胞凋亡的作用机制

目的 探讨醉香含笑树皮提取物（extrat of barks of Michelia macclurei Dandy.,EBMMD）诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的作用及相关机理。方法 采用倒置生物显微镜、流式细胞仪、Western-blotting等技术,考察EBMMD对HepG2细胞凋亡及COX-2蛋白表达的影响。结果 流式细胞术分析可见,EBMMD能明显诱导HepG2细胞凋亡,且呈浓度依赖关系;倒置生物显微镜观察可见细胞凋亡的形态学改变;随EBMMD浓度增高,细胞内COX-2蛋白的表达逐渐减少,且当EBMMD浓度达25.00μg.mL 1时,能明显抑制COX-2蛋白表达。结论 EBMMD可以明显诱导HepG2细胞凋亡,其作用机理可能与下调细胞内COX-2蛋白表达进而诱导其凋亡有关。     

金钗石斛生物总碱对脂多糖激活星形胶质细胞产生炎症因子的影响

目的观察金钗石斛生物总碱对外源性内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活大鼠大脑皮层星形胶质细胞(astrocyte)及诱导其产生和释放炎症介质的影响,探讨石斛生物总碱对星形胶质细胞的抗炎作用。方法通过MTS检测细胞存活率,ELISA法检测TNF-α炎性因子蛋白的表达,实时定量多聚酶链反应(real time RT-PCR)检测炎症相关基因TNF-α、IL-6 mRNA的表达。结果①LPS刺激星形胶质细胞后,MTS检测吸光度明显升高,与正常组比较差异有显著性;②金钗石斛生物总碱能够降低LPS所致的TNF-α蛋白的高表达(P<0.05);③金钗石斛生物总碱能够降低LPS诱导的星形胶质细胞吸光度的升高,同时明显抑制LPS所致的TNF-α、IL-6 mRNA的高表达。结论金钗石斛生物总碱能够拮抗LPS所引起的炎症反应,其作用与抑制星形胶质细胞的激活及其炎症因子的释放密切相关。     

植物生物反应器生产药物蛋白的研究进展

利用植物生物反应器生产药物蛋白已成为目前研究的热点.随着分子生物学新技术的发展,植物生物反应器将会成为抗体、血液替代品、疫苗生产的有效途径.本文综述了植物生物反应器生产药物蛋白的研究进展,并对提高药物重组蛋白在转基因植物中表达的研究策略进行了探讨.     

原花青素对H2O2致PC12细胞氧化损伤作用的保护研究

目的：探讨原花青素对H2O2致PC12细胞氧化损伤的保护作用。方法：使用H2O2造成PC12细胞损伤,MTT法测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫组化法检测细胞中Bax与Bcl-2的蛋白表达。结果：原花青素能提高H2O2损伤后细胞的活性;能减少细胞凋亡;能够增加Bcl-2蛋白表达,减少Bax蛋白表达。结论：原花青素对H2O2致细胞损伤具有保护作用,能够减少细胞凋亡,其机制可能与其增加Bcl-2蛋白表达,减少Bax蛋白表达有关。     

转录因子Snail促进结直肠癌细胞对奥沙利铂耐药的机制研究

目的 研究转录因子Snail促进结直肠癌细胞HCT116对奥沙利铂产生耐药性的分子机制.方法 采用MTT法分别检测过表达Snail蛋白和空载质粒的HCT116细胞对奥沙利铂的敏感性差别,以及RNA敲除-糖蛋白(P-gp,编码基因ABCB1)蛋白的HCT116细胞对奥沙利铂的敏感性的影响.实时定量PCR方法检测过表达Snail对耐药相关基因表达的影响.蛋白质免疫印迹技术Western blot检测过表达Snail对P-gp蛋白表达的影响.结果 过表达转录因子Snail可以明显促进结直肠癌细胞HCT116对奥沙利铂产生耐药性.实时定量PCR结果表明:过表达Snail明显提高了P-gp蛋白编码基因ABCB1的表达,而对其它耐药基因如ABCC1、ERCC1等没有明显影响.Western blot结果显示过表达Snail可以促进P-gp蛋白的表达.敲除P-gp蛋白可以明显提高HCT116细胞对于奥沙利铂的敏感性.结论 过表达Snail可以明显促进结直肠癌细胞HCT116对奥沙利铂的耐药性,其机制与Snail促进耐药蛋白P-gp的表达有关.     

非小细胞肺癌RRM1蛋白表达与吉西他滨体外药敏相关性的研究

目的探讨非小细胞肺癌组织核苷酸还原酶M1亚基（RRM1）蛋白表达水平与吉西他滨体外药敏的关系。方法用ATP生物荧光法（ATP—TCA）对44例非小细胞肺癌患者手术切除的新鲜标本进行吉西他滨体外药敏检测．并用免疫组织化学检测其RRM1蛋白表达水平,比较分析RRM1表达与吉西他滨耐药的相关性。结果RRM1高表达20例（45．5％1．低表达24例（54．5％）;结合吉西他滨体外药敏结果得出。RRM1蛋白低表达组吉西他滨有效为17例（70．8％）;RRM1蛋白高表达组有效6例（30．0％）,即RRM1蛋白低表达组对吉两他滨的体外疗效明显优于高表达组,（P〈0．05）。结论RRM1蛋白表达水平可用于以吉西他滨为化疗基础的非小细胞肺癌患者的疗效预测指标。     

P170蛋白测定对白血病耐药监测的意义

目的：探讨白血病细胞P170蛋白表达的变化对白血病耐药监测的意义。方法：运用流式细胞术测定非淋巴细胞性白血病患者外周血中幼稚细胞的P170蛋白表达,并同步测定淋巴细胞的P170蛋白表达水平。结果：白血病患者的P170蛋白表达率存在个体差异,一些患者在化疗前已有P170蛋白部分表达。而且P170表达率随化疗进程而逐渐提高;淋巴细胞P170表达与白血病细胞P170表达相关,存在同步的趋势相。结论：流式细胞术测定白血病细胞P170蛋白表达,是监测白血病患者差异耐药、动态耐药的有效实验方法;在化疗后期外周血中自血病细胞缺失时,淋巴细胞P170表达水平的测定对于有效监测白血病的耐药具有重要的参考价值。     

马甲子提取物调控HCG18对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响

摘要：目的:探索马甲子提取物对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响及其分子机制。方法:分别使用0,25,50,75μg·ml-1马甲子提取物处理宫颈癌细胞SiHa,噻唑蓝（MTT）检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、P21、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达,实时荧光定量PCR（qPCR）检测长链非编码RNA（lncRNA）人类白细胞抗原复合体18（HCG18）表达。在细胞中转染si-HCG18,观察抑制HCG18对细胞SiHa增殖、凋亡的影响。在细胞中转染pc DNA 3.1-HCG18,并使用75μg·ml-1马甲子提取物进行处理,探讨过表达HCG18对马甲子提取物诱导的SiHa增殖、凋亡的影响。结果:与0μg·ml-1马甲子提取物组比较,25,50,75μg·ml-1马甲子提取物显著提高SiHa细胞的增殖抑制率、凋亡率、P21、Bax蛋白水平,显著减少Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量及HCG18表达量,且呈浓度依赖性（P<0.05）。抑制HCG18显著减少SiHa细胞HCG18表达量及Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量,显著提高P21、Bax蛋白水平、细胞增殖抑制率、凋亡率（P<0.05）。过表达HCG18能逆转马甲子提取物抑制细胞SiHa增殖、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达,以及促进细胞SiHa凋亡、P21、Bax蛋白表达的作用。结论:马甲子提取物通过调控lnc RNA HCG18表达抑制宫颈癌细胞增殖和诱导细胞凋亡。     

小窝蛋白-1与特发性肺纤维化

小窝蛋白作为小窝膜内的支架蛋白,能够组织和浓缩特异性的脂质,修饰信号转导分子以及负性调控许多信号转导通路和生物过程。生物体内小窝蛋白表达异常可引起疾病,特发性肺纤维化就是其中一种。大量研究表明,小窝蛋白-1在特发性肺纤维化发病过程中表达明显下调,大大降低了其对多条信号传导通路如TGF-β/SMAD、ERK/MAPK、JNK/MAPK和PKC等的负性调控作用,进而导致肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞增殖及表型转化、细胞外基质(ECM)重塑,加速了肺纤维化发病进程。因此该文就小窝蛋白-1在特发性肺纤维化中的作用进行了综述。     

甲基苯丙胺致PC12细胞的差异蛋白表达

目的探讨甲基苯丙胺(METH)作用于PC12细胞后的蛋白质表达变化。方法 METH2.5 mmol·L-1作用PC12细胞24 h后,提取细胞总蛋白质,丙酮沉淀法纯化蛋白,Braford法对蛋白质进行定量,并对蛋白质进行双向凝胶电泳,Image scannerⅢ透射扫描仪获取凝胶电泳图谱。应用Image Master 7.0软件对获得的双向凝胶电泳图谱进行差异性蛋白质点分析,并对相应差异蛋白点用高端基质辅助激光解析-飞行时间(MALDI-TOF)串联质谱仪进行差异蛋白质鉴定。结果应用双向凝胶电泳结合质谱分析技术,METH作用PC12细胞24 h后,共鉴定出18个差异表达蛋白质点,其中8个差异蛋白点在METH作用后表达增强,10个蛋白点表达减弱。这些蛋白质主要包括细胞骨架相关蛋白、分子伴侣、氧化应激和凋亡相关的蛋白以及与能量代谢相关的酶类。结论 METH诱导PC12细胞18个蛋白差异表达。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的体内体外抗人肝细胞癌的作用

目的：研究Bcl-2蛋白的过表达对Trail诱导肝癌细胞凋亡的影响,以及Trail蛋白体内和体外对人肝癌细胞的杀伤作用。方法：克隆Trail基因并在大肠杆菌中表达Trail重组蛋白。检测Trail重组蛋白在体内和体外对肿瘤的杀伤作用。用台盼蓝拒染法检测细胞的凋亡率。将真核细胞表达质粒pcDNA3-Bcl-2转染到人肝癌细胞BEL－7404细胞中,并通过G418 400mg/L筛选得到Bcl-2蛋白稳定表达的细胞株。结果：重组蛋白Trail能够有效地杀死人肝癌细胞（包括BEL－7404,SMMC－7721,和BEL－7402等细胞）。在体外,过量表达的Bcl-2蛋白能抑制Trail重组蛋白对人肝癌细胞BEL－7404的杀伤作用。重组蛋白Trail能够有效地抑制人肝癌细胞BEL－7404在裸鼠中形成实体瘤。结论：在体内和体外,Trail重组蛋白能够杀死肝癌细胞,Bcl-2蛋白过表达可以抑制Trail重组蛋白对肝癌细胞BEL－7404的杀伤作用。Trail蛋白是一种潜在的肝癌治疗剂。     

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）可溶性胞外区在大肠杆菌中的高效表达

肿瘤坏死相关凋亡诱导配体（TNF－related apoptosis-inducing ligand,TRAIL),也称为凋亡素2配体（Apoptosisin 2 Ligand,Apo2L),是肿瘤坏死因子超家族成员,能够激发肿瘤细胞选择性地发生凋亡,并对正常组织细胞几乎无毒性。TRAIL通过细胞表达受体,即死亡受体4和5（Death Receptor 4,DR4 and Death Receptor5)发挥作用,而大多数肿瘤细胞表面表达这2种受体。为了深入研究TRAIL在肿瘤治疗中的价值,我们采用RT－PCR方法克隆了TRAIL基因,并对其细胞外可溶性区域（114－281氨基酸残基）在大肠杆菌中进行了表达。重组的TRAIL可溶性蛋白占细菌总蛋白的45％以上,初步分析具有TRAIL的生物学活性。     

Lentivirus‐mediated RNA Interference Targeting LAPTM4B Inhibits Human Ovarian Cancer Cell Invasion In Vitro

LAPTM4B (lysosome‐associated protein transmembrane 4 beta) play an important role in several human carcinomas. We examines the effects of RNA interference mediated downregulation of human lysosomal‐associated protein transmembrane 4 beta expression on the biological behavior of the human serous adenocarcinoma cell line NIH:OVCAR3. This study investigated the expression level of lysosomal‐associated protein transmembrane 4 beta in several ovarian cancer cell lines. RNA interference mediated by recombinant lentiviral vectors expressing an artificial lysosomal‐associated protein transmembrane 4 beta miRNA was used to induce long‐lasting downregulation of lysosomal‐associated protein transmembrane 4 beta gene expression in NIH:OVCAR3 cells. Lysosomal‐associated protein transmembrane 4 beta expression as well as the motility, migration potential, and proliferation of the tumor cells was measured by flow cytometry, real‐time polymerase chain reaction, Western blot analysis, transwell migration assays, wound healing assays, and cell counting kit‐8 assays. In addition, the cell cycle analysis utilized fluorescence‐activated cell sorting. Four recombinant plasmid expression vectors encoding premiRNAs against lysosomal‐associated protein transmembrane 4 beta (pcDNA‐LAPTM4B‐miR‐1, ‐2, ‐3, and‐4) were constructed and transfected into 293T cells, which overexpress lysosomal‐associated protein transmembrane 4 beta. The recombinant lentiviral vector for lysosomal‐associated protein transmembrane 4 beta RNA interference was packaged with pcDNA‐LAPTM4B‐miR‐3, which had the highest interfering efficiency, thereby successfully generating stable transfectants. Compared with the control cells, the LAPTM4B‐miRNA‐transfected NIH:OVCAR3 cells exhibited significant decreases in cell motility and invasion. Furthermore, LAPTM4B depletion resulted in a significant decrease in proliferating cell nuclear antigen, vascular endothelial growth factor, MMP2, MMP9, and CDK12 expression. We propose that lysosomal‐associated protein transmembrane 4 beta expression may be an oncogene‐inducing feature of invasive ovarian cancer cells and may be a potential therapeutic target for ovarian cancer treatment.     

Purification of proteins produced by biotechnological process

Proteins maintain functions important to life. Faulty functioning or deficiency gives rise to pathological reactions. These proteins can now be produced, using the methods of recombinant DNA technology and administered to patients for replacement therapy. Many proteins as active ingredients are already available for use as immunomodulators, agents for tumour treatment, plasma proteins and hormones. They are in various stages of development, ranging from cloning of the producing cells to marketing of the finished products. Since the active substances are proteins synthesized by recombinant cells, their purification presents a particular challenge to protein chemists. Purification of recombinant DNA-derived proteins intended for human use is an essential part of the biotechnical process. It starts immediately after the fermentation of the host cell. The characteristics of the protein determine which microorganisms or cell cultures are used and this in turn defines the first purification step. The microorganisms are disrupted, and the insoluble protein, desposited in "inclusion bodies" has to be renatured, or the proteins secreted by cells and have to be concentrated. The subsequent strategy for purification of the protein does not depend on the fermentation process but is entirely determined by the physiochemical properties of the proteins. The goal of the first purification step is to isolate as fast and quantitatively as possible the recombinant protein from the culture filtrate, in order to minimize potential changes brought about by proteases or glycosidases. Immunoaffinity or ligand-affinity chromatography is used preferentially for this purpose. The concentration of protein and buffer changes are carried out by precipitation followed by reconstitution or, preferably, by dialysis and ultrafiltration/diafiltration.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

重组CD_(13)单链抗体和蝎毒素多肽AGAP融合蛋白真核表达及对NB4细胞的靶向杀伤作用

目的:本研究应用基因工程技术方法,构建含重组编码CD13单链抗体和蝎毒素镇痛抗肿瘤缬精甘肽(analgesic antitumoral peptide,AGAP)融合蛋白基因的表达载体,并研究CD13-AGAP融合蛋白对CD13阳性白血病细胞NB4影响。方法:克隆东亚钳蝎活性肽AGAP的基因,插入真核表达载体pSecTag2/CD13/RFP,得到pSecTag2/CD13/AGAP重组真核表达载体。酶切及测序鉴定后,脂质体介导重组质粒转染293T细胞,通过RT-PCR和免疫印迹方法检测融合基因和蛋白的表达。纯化融合蛋白,作用NB4细胞,CCK8检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期。结果:酶切及测序结果证实pSecTag2/CD13/AGAP重组真核表达载体构建成功,转染293T细胞后,RT-PCR和免疫印迹方法结果证实重组质粒得到有效表达,并纯化真核表达融合蛋白CD13-AGAP对血液肿瘤CD13阳性白血病细胞NB4有一定的生长抑制作用,并且使细胞周期G1期阻滞,S期减少。结论:成功构建了融合蛋白真核表达载体pSecTag2/CD13/AGAP,并在293T细胞中成功表达,进一步证实融合蛋白对CD13阳性白...     

重组人乳头瘤病毒58型L1蛋白在Sf9细胞中的表达条件优化

目的 采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统扩增人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型L1蛋白基因,确定L1蛋白表达的最佳条件.方法 取处于埘数生长期的S19细胞以不同的感染复数(MOI)值扩增病毒,用噬斑试验检测病毒滴度,确定扩增重组病毒的最适条件;用间接免疫荧光法判断目的蛋白表达情况;通过蛋白印迹法测定不同的表达时间和MOI值条件下目的蛋白表达量,确定目的蛋白的最佳表达条件.结果 处于对数生长期的细胞以MOI值为0.5表达48 h条件下扩增含HPV58 LI基因的重组杆状病毒,滴度最高,可达5×108pfu/ml;以MOI值为5.0表达72 h获得最佳的目的蛋白表达量.结论 确定了扩增病毒和表达相应目的蛋白的最佳条件.     

Specific Delivery of Corroles to Cells via Noncovalent Conjugates with Viral Proteins

Purpose Corroles are amphiphilic macrocycles that can bind and transport metal ions, and thus may be toxic to cells. We predicted that anionic corroles would poorly enter cells due to the negatively charged cell membrane, but could be ideal tumor-targeted drugs if appropriate carriers enabled delivery into tumor cells. In this work, we test the hypothesis that recombinant cell penetrating proteins of the adenovirus (Ad) capsid form noncovalent conjugates with corroles to facilitate target-specific delivery and cell death. Methods Corroles mixed with recombinant proteins were tested for conjugate assembly, cell penetration, stability, targeted binding, and cell killing in vitro. Results Sulfonated corroles entered cells only with carrier proteins, and formed stable complexes with recombinant Ad capsid proteins. ErbB receptor-targeted conjugates were cytotoxic to ErbB2-positive but not ErbB2-negative breast cancer cells, whereas molar equivalents of free corrole had no effect on these cells. Conclusions Sulfonated corroles are cytotoxic to ErbB2-positive breast cancer cells when delivered by a targeted cell penetrating protein. The relatively low dose required to accomplish this compared to untargeted compounds suggests that corroles may lend themselves to targeted therapy. Importantly, the amphiphilicity of corroles enables a unique approach to bioconjugate formation whereby the carrier and drug form a stable complex by noncovalent assembly.     

sMICA基因的克隆表达及其纯化

目的构建重组MICA原核表达载体并探讨MICA对NK细胞毒效应的影响。方法经RT-PCR从Hela细胞获取MICA基因,经适当酶切后构建表达载体pBV220-MICA,转入大肠杆菌DH5α进行表达。重组MICA蛋白经纯化后与NK92细胞孵育观察对NK细胞毒效应的影响。结果带有重组质粒pBV220-MICA的大肠杆菌经热诱导后,以可溶性形式表达重组MICA蛋白,纯化后的重组MICA蛋白纯度为95%。经重组MICA处理的NK92细胞对MICA表达阳性的肿瘤细胞的杀伤作用明显降低。结论构建了pBV220-MICA重组质粒,并在大肠杆菌中获得可溶性表达,为研究MICA与NK细胞受体的相互作用机制奠定了基础。     

用酵母载体pPIC9k重组构建表达sCR1

目的采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western Blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

稳定高效表达人血栓调节蛋白的CHO细胞株的建立

目的:构建稳定高效表达人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的CHO细胞株,以便于大量生产纯化hTM蛋白。方法:利用脂质体li-pofectamine 2000将包含hTM基因全长序列的重组表达质粒pThr402转染CHO细胞。转染后用G418的选择性培养液筛选、挑取抗性克隆。采用流式细胞术和Western blotting检测hTM在CHO细胞膜表面的表达情况,筛选建立稳定高效表达hTM的CHO细胞株并对其稳定性进行观察。结果:重组表达质粒pThr402转染CHO细胞后,流式细胞术证实hTM稳定高效表达于随机挑选的5个抗性克隆细胞株的细胞膜表面,但表达量有差异。Western blotting分析检测显示hTM表达量较高的CHO-TM1、CHO-TM4与CHO-TM5细胞株的细胞裂解液出现了与预期值相符的约105000的特异性条带。CHO-TM5已经经过冻存复苏前后各20次传代,且无论有无G418选择压力存在,hTM表达水平无明显差异。结论:成功构建了稳定高效表达hTM的CHO细胞株,可望获得大量蛋白,为进一步研究hTM的生物学功能以及制备和筛选抗hTM的单抗开辟新的途径。