伤寒减毒活疫苗Ty21a免疫前后小鼠肠细胞差异表达的基因

以基因表达谱芯片对Ty2 1a免疫前后小鼠肠细胞 (包括肠粘膜上皮细胞和肠上皮间淋巴细胞 )基因表达的差异性进行研究比较。将 490条经抑制消减杂交法筛选出的与小鼠Ty2 1a免疫相关的cDNA制备成表达谱芯片 ;利用免疫前后小鼠肠细胞的mRNA通过逆转录方法 ,将Cy3和Cy5两种荧光分别标记到两种组织的cDNA上 ,制备成cDNA探针 ,并与表达谱芯片进行杂交及扫描 ,单点重复 2次实验 ,通过计算机数据处理判定基因是否在上述两种细胞群中有表达差异。筛选出差异表达基因共 98条 ,其中 92条为表达上调基因 ,6条为表达降低基因。提示 ,基因表达谱芯片技术是高通量进行基因表达模式研究的方法 ,可同时定量研究大量的基因表达水平 ,从而鉴定可能参与免疫的基因。     

利用抑制性减数杂交技术(SSH)研究IL-10抑制表达的新基因

目的　利用抑制性减数杂交 (SSH)技术筛选IL 10抑制表达的新基因。方法　以PHA刺激的U937细胞为tester,以PHA刺激同时IL 10抑制的U937细胞为driver,提取mRNA ,反转录构建cDNA文库 ,利用SSH技术筛选IL 10抑制表达的新基因。结果　通过SSH技术 ,发现了 15个可能的IL 10抑制表达的基因 ,其中 6个与GenBank中已公布的表达序列检签 (expressedsequencetag ,EST)片段没有明显同源性 ,为新基因 ,其中之一经EST拼接 ,得到全长cDNA ,为一种新的C C家族趋化因子 ,已被GenBank收录 ,收录号码为AF0 96 985。挑选 4个新基因进行Northernblot分析 ,发现IL 10可抑制其中 3个新基因表达。结论　SSH技术是一种高效的差异基因筛选方法 ,IL 10可抑制多种包括新细胞因子基因的表达     

实验性肺纤维化相关基因的表达谱研究

目的：通过研究小鼠肺纤维化组织和正常肺组织基因的差异表达，寻找与纤维化相关的基因。方法：以包含4 096个cDNA基因表达谱芯片研究不同时间肺纤维化的基因表达谱。结果：共筛选出差异表达基因271条，包括高表达的炎性基因43条和与细胞外基质代谢有关的基因46条，112条基因表达下降。结论：基于cDNA微矩阵技术的肺纤维化基因表达谱能够高通量筛选与肺纤维化发生密切相关的基因。     

心肌成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ刺激下表达下调基因的分离和鉴定

目的：对成年大鼠心肌成纤维细胞（CF）受血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激后下调基因表达谱进行筛选及分析。 方法： 以受AngⅡ刺激CF为驱动方，未刺激CF为实验方，进行抑制消减杂交（SSH）建立消减cDNA文库。经斑点杂交筛选文库后将部分阳性克隆测序及进行同源性分析。 结果： 共获得17条下调表达基因，分别与胞内信号转导、转录抑制、纤维沉积和细胞骨架重构相关，并克隆到4条新基因表达序列标签（EST）。 结论： SSH有效地克隆了成年大鼠CF受AngⅡ刺激后下调表达基因，对这些基因的研究将有助于阐明心肌改建的分子机制。     

伤寒活疫苗Ty21a免疫相关新基因的克隆及其组织分布

粘膜免疫在机体的免疫防御系统中起着重要的作用。寻找粘膜免疫防御相关的分子，对于揭示粘膜免疫的规律具有重要的意义。在通过抑制消减杂交，建立cDNA消减文库的过程中，发现了几条在Ty21a免疫后基因表达发生改变的新的ESTs。为了揭示这些ESTs对应的基因在粘膜免疫中的作用，我们利用RACE-PCR技术扩增了其中1条EST对应基因的全长。     

重型乙型肝炎与无症状HBsAg携带者免疫相关基因表达差异的研究

目的：应用基因芯片研究重型乙型肝炎（FHB）与无症状HBsAg携带者（ASC）外周血单个核细胞（PBMC）免疫相关基因表达差异，方法：应用含8192条人cDNA的微阵列芯片和来自外周血单个核细胞标记的cDNA，分析了10例重型乙肝和10例无症状HBsAg携带者基因表达谱。通过应用GenePix4000扫描仪和ImaGene3.0分析软件比较Cy5标记的FHB来源cDNA与Cy3标记的ASC来源cDNA的杂交结果，获得个体基因的相对表达比值。结果：在8192个基因中，初筛出21个（0．25％）表达差异2倍以上的免疫相关基因。结论：在乙型肝炎病毒（HBV）感染机体致慢性重型肝炎过程中，全面改变了宿主细胞内免疫相关基因表达，这些差异表达基因可能与慢性重型肝炎的发生有关。     

K562细胞VEGF基因表达下调后的基因表达谱改变

目的探讨血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因VEGF表达下调对白血病K562细胞株基因表达谱的影响。方法采用脂质体介导的方法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ转染白血病细胞株K562、G418抗性筛选获得阳性克隆；抽提基因组DNA，用PCR方法验证核酶基因已转入K562细胞；荧光定量PCR和免疫印迹反应检测白血病细胞中VEGF mRNA和蛋白表达量的改变；应用cDNA微阵列技术检测VEGF基因表达下调对白血病K562细胞株基因表达谱的影响。并用逆转录PCR验证PCNA、GSN基因的表达改变。结果抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体pcDNARZ转入白血病细胞株K562、G418筛选两周获得阳性克隆，PCR检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组DNA；与K562及K562／PC细胞（转染空质粒的K562细胞）相比，转染VEGF核酶基因的K562／RZ细胞VEGF mRNA和蛋白的表达量明显降低，芯片中共有表达差异的基因191条，包括周期相关基因、细胞凋亡相关基因、癌基因以及细胞信号和传递蛋白等基因，其中104条表达下调，87条表达上调。逆转录PCR证实GSN基因表达上调，PCNA基因表达下调。结论VEGF基因表达下调能引起白血病K562细胞株基因表达谱的改变，这些基因的改变可能对白血病细胞增殖、分化和凋亡等生物学行为产生了一定的影响。     

应用基因芯片筛选抑郁症相关基因的初步研究

目的 筛选与抑郁症相关的差异表达基因.方法 采用人8000条cDNA表达谱基因芯片技术,研究抑郁症患者及健康对照组外周血淋巴细胞基因表达差异,从而筛选抑郁症相关基因.结果 与对照组相比,抑郁症组中存在显著性表达差异的基因有138个,其中上调有78个,下调有60个基因.结论 离子通道、免疫活性、蛋白代谢、能量代谢(糖脂代谢)、细胞增殖、细胞黏附以及信号传导等相关基因类型可能与抑郁症密切相关.     

应用抑制性消减杂交技术研究哮喘发作外周血嗜酸细胞与细胞粘附及免疫调节相关基因的差异表达

目的：研究哮喘发作时外周血嗜酸细胞(EOS)与细胞粘附及免疫调节相关基因的差异表达。 方法:利用Percoll密度梯度离心分离哮喘患者发作时与治疗缓解外周血嗜酸性粒细胞，提取总RNA，并利用Super SMART cDNA Synthesis技术合成cDNA第1链及优化扩增第2链。按照SSH常规方法构建cDNA消减文库，筛选阳性克隆并加以鉴定以得到带有差异表达的基因克隆。 结果:成功构建具有高消减效率的哮喘发作患者外周血EOS　cDNA文库，筛选鉴定后确认15个差异表达基因，测序并同源性比对分别为夏科-莱登结晶蛋白（CLC protein, galectin-10）、假定mRNA前剪接调节子female-lethal(2D)［putative pre-mRNA splicing regulator female-lethal(2D)］、水通道蛋白9（AQP-9）、IL-8、slingshot磷酸酶(SSH-2L)、蛋白磷酸酶1催化亚基β亚型（PP1CB）、RNA解旋酶HELZ、β2-微球蛋白（β2-MG）及一个线粒体相关基因。 结论:这些基因的差异表达证明了EOS的趋化、迁移、粘附及免疫调节功能参与了哮喘病理生理调节，对这些途径的干预可能为未来哮喘靶向性治疗提供依据。     

免疫相关基因在同一膀胱癌亚克隆细胞株中的差异表达

目的:筛选和鉴定同一膀胱癌亚克隆细胞株中差异表达的与BCG免疫相关的基因。方法:以已建立的两株同一来源、不同生物学表型的膀胱移行细胞癌细胞系BLX和BLS211为材料,采用抑制性削减杂交技术(SSH)筛选差异表达的基因片段。结果:在BLX细胞中获得9个高表达的基因,在BLS211细胞中获得15个高表达的基因。BLX细胞中有3个基因,即与卡介苗(BCG)免疫治疗相关的基因BCG诱导的膜蛋白(BIGM103)基因、纤维连接蛋白(FN)基因和补体因子B(BF)基因;BLS211细胞中有8个基因均为新的表达序列标签(EST),已被GenBank登录(登录号为DY50570813,DY2304478)。结论:SSH技术筛选表明,BIGM103等免疫相关基因的不同,可能与不同膀胱癌细胞对BCG免疫治疗的差异性有关;新的EST的获得,为进一步克隆全长、研究基因的功能创造了条件。     

热适应差异表达基因消减文库的筛选

目的：研究热适应大鼠的肝细胞基因差异表达，探讨热适应的分子机制。 方法： 构建热适应差异表达基因消减文库［1］，扩增并克隆T/A载体形成重组质粒，转化感受态细胞后分离获得目的基因，采用PCR-select differential screening技术筛选差异表达基因，测序后所得序列与GenBank中的已知序列进行比对，确定其可能的功能。 结果： 确认8个上调表达基因，与GenBank中已知序列进行比较，证实其中有3种已知基因，5个新序列表达标签（EST）。 结论： 相关基因表达水平上调可能参与生物体热适应的信号转导通路，而p53可能是热适应分子环路的又一节点。     

大鼠小脑部分表达序列标签的鉴定

目的:为了获取大鼠小脑特异表达的cDNA序列,筛选新的EST基因片段,以便进一步获取有意义的cDNA全基因。方法:以大鼠大脑、脑干mRNA逆转录cDNA作为driver(驱动)cDNA,大鼠小脑mRNA逆转录cDNA作为tester(测试)cDNA,经消减杂交法,消除与大脑及脑干相同的cDNA,并富集低丰度基因,从而获得大鼠小脑特异表达基因片段,以及低表达基因片段,克隆制备成大鼠小脑特异表达cDNA文库。结果:共挑选出32个阳性克隆质粒,测序得到34个不同基因片段的序列。最后用反Northern杂交去除假阳性,筛选出8个有意义的差异表达cDNA基因片段。同时,将测序结果与Genbank进行同源性比较,发现13个新的EST序列,并申请获得基因序列号(AW288461-AW288474)。结论:抑制消减杂交法是一种筛选特异表达基因的有效方法。本结果可为研究脑功能的分子机制提供有益的资料。     

Improved subtractive suppression hybridization combined with high density cDNA array screening identifies differentially expressed viral and cellular genes

Suppression subtractive hybridization (SSH) combines normalization and suppression PCR effect step in a single cycle to isolate differentially expressed genes in two cDNA samples. The PCR suppression effect is mediated by long inverted terminal repeats. The efficiency of the restriction enzyme digestion and the adapter ligation are crucial in the success of the SSH. We modified the original SSH protocol in order to improve the efficiency of the subtraction. A magnetic bead based separation step has been included after the ligation step, to purify the successfully ligated fraction of the tester. EBV(NEO) infected Akata(-) Burkitt's lymphoma cell line was compared with the EBV(-) Akata(-) cell line to isolate differentially expressed genes with the improved SSH protocol. Some 44 cDNA clones that showed the greatest differences in expression have been sequenced. Of them, 20 showed more than 3-fold difference in expression. Seven of the 20 genes were EBV genes. To quantitate the expression levels, high density nylon cDNA array hybridization was optimized. Statistical analysis of the data revealed that the spotting of the arrayer is exceptionally reproducible, which makes the comparison of the hybridization of parallel filters possible.     

肝癌组织差异表达基因cDNA序列的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定肝癌组织特异表达基因。方法：通过菌落原位杂交技术筛选用抑制消减杂交法构建肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库，用PCR方法进一步筛选出有插入片段的阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序和同源性比较分析，用Northern印迹方法对新的cDNA序列进行初步鉴定。结果：从消减文库中随机挑取的100个白色克隆中筛选出13个阳性克隆，DNA测序获得11个不同的cDNA序列；同源性比较分析表明，6个cDNA片段与在基因高度同源，5个cDNA片段为新的序列。其长度大于300bp的3个新序列，Norther印迹证实它都来源于肝癌组织。结论：用抑制消减杂交方法构建的肝癌差异表达基因消减cDNA文库富含肝癌特异表达基因，经验证的3个新的cDNA序列可能为肝癌特异的基因序列。     

Detection of genes expressed in primary colon cancers by in situ hybridisation: overexpression of RACK 1

Aims: The isolation of various genes that are expressed in a region specific manner is considered useful for research in molecular pathology. In situ hybridisation (ISH) was used in a screening procedure to isolate these genes efficiently, using colon cancer as a model.

Methods: Suppression subtractive hybridisation (SSH) between colon cancer tissue samples and corresponding non-cancerous tissues was performed. Genes showing high expression in the cancers were selected using macro-DNA array analysis. As a final screening procedure, conventional ISH was performed to isolate genes expressed specifically in colon cancers.

Results: Sixty nine clones were selected by SSH and macro-DNA array analyses. These clones were then analysed by ISH to examine their expression patterns. ISH screening revealed that all the clones screened showed more intense signals in colon cancers than in non-cancerous tissues. Among them, RACK 1, which is a protein kinase C receptor and a homologue of the G protein β subunit, was expressed intensely in colon cancer cells. RACK 1 expression was evaluated in multiple samples by ISH, and the results confirmed that RACK 1 was universally overexpressed in cells of all 11 colon cancers examined.

Conclusions: Many genes, including RACK 1, expressed in colon cancer cells can be isolated efficiently by this method, and their precise expression pattern can be evaluated. These results indicate that ISH is an excellent technique for systemic screening of genes expressed in a region specific manner.

     

抑制性消减杂交技术筛选重组IFNβ下调HepG2细胞靶基因

目的利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建重组干扰素β（IFNβ）刺激人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库，筛选IFNβ下凋HepG2相关基因。方法重组IFNβ2000U／ml刺激对数生长期HepG2细胞，以生理盐水作用的HepG2细胞为阴性对照；制备细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分成两份，分别与两种不同的接头连接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建重组IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后，得到58个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。随机挑选其中35个插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得12种编码基因。结论应用SSH技术成功构建了IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库，为进一步了解IFNβ在肝细胞内的免疫调节机制提供了依据。