构建兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型

背景:目前尚缺乏诱导骨髓间充质干细胞向髓核细胞转化的体外模型.目的:建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞分化为类髓核细胞的体外模型,为髓核细胞体内移植培养种子细胞提供实验依据.设计、时间及地点:对比观察,于2008-08/2009-03在青岛大学医学院附属医院骨科研究所和中心实验室完成.材料:8周龄新西兰大白兔2只用于兔髓核细胞的分离培养:人椎间盘髓核组织为术中取自16岁先天性脊柱侧弯患者T_(12)L_1、L_(1.2)椎间盘髓核组织,患者家属知情同意.人骨髓间充质干细胞株为广州赛业生物科技有限公司产品.方法:将人骨髓间充质干细胞和兔髓核细胞新式分层共培养(应用去掉挂臂、膜孔为0.4 μm的小室,膜底与贴壁细胞相接触,膜上下两种细胞比例为50%:50%)7 d,同时设立传统的分层培养(带有挂臂的小室)组、单独人骨髓间充质干细胞培养组和髓核细胞培养组为对照.主要观察指标:反转录-聚合酶链反应和Western blot检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达.结果:传统分层培养组及单独人骨髓间充质干细胞培养组不表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原.新式分层培养组、单独髓核细胞培养组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达均高于传统分层培养组、单独人骨髓间充质干细胞培养组(P＜0.01).新式分层培养组与单独髓核细胞培养组比较及传统分层培养组与单独人骨髓间充质干细胞培养组比较,差异无显著性意义(P＞0.05).结论:新式分层培养人骨髓间充质干细胞能较高的表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,接近椎间盘未退变人的髓核细胞表达水平,表明成功建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型,为椎间盘退变的细胞治疗奠定了基础.     

藻酸钠微球介导髓核细胞对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响

背景：椎间盘退行性变的理想治疗方法是利用组织工程技术修复退行性变的椎间盘,而修复所需的髓核细胞来源十分有限。目的：观察在藻酸盐微球的介导下,髓核细胞与骨髓间充质干细胞非接触共培养时,髓核细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用。设计、时间及地点：细胞学体外观察,实验于2007-10/2008-08在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和中心实验室进行。材料：4月龄健康新西兰大耳白兔5只,取髓核细胞与骨髓间充质干细胞原代培养,利用传代法分离纯化。方法：①将纯化的骨髓间充质干细胞经胰蛋白酶消化、收集,并与适量的藻酸钠溶液混合,形成109L-1的单细胞悬液,将混合好的单细胞悬液经注射器滴加至35g/L的CaCl2溶液中,形成海藻酸钙凝胶珠。②将海藻酸钠凝胶微球与髓核细胞共培养。在7d和15d时,分组溶解海藻酸钙凝胶珠,收集骨髓间充质干细胞。主要观察指标：利用免疫组化技术、RT-PCR技术和Westernblot技术检测骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达,用以判断髓核细胞对骨髓间充质干细胞在非接触条件下的诱导作用。结果：在骨髓间充质干细胞的细胞爬片免疫组化染色中可见,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖染色阳性,RT-PCR和Westernblot结果显示经诱导后骨髓间充质干细胞中已有Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖基因的表达,且诱导15d组的目的条带明显亮于诱导7d组的目的条带。结论：在藻酸盐微球的介导下,体外非接触共同培养时髓核细胞能够实现对骨髓间充质干细胞的诱导作用。     

新式分层共培养环境下人骨髓间充质干细胞诱导髓核细胞的分化

背景:诱导分化的骨髓间充质干细胞或髓核细胞移植都存在一定的局限性,抑制自体髓核细胞的退行性变有望成为未来治疗椎间盘退变的有效方法.目的:通过建立骨髓间充质干细胞和髓核细胞分层共培养模型,观察骨髓间充质干细胞对髓核细胞分化的影响.方法:取传至第4代的骨髓间充质干细胞,分为2组:新式分层培养组将髓核细胞接种于去掉挂臂的Transwell小室,膜孔0.4 μm,其与骨髓间充质干细胞比例为1∶1;传统分层培养组同法将髓核细胞接种于带有挂臂的Transwell小室.同时设立单独髓核细胞培养组,各组均培养7 d.免疫组织化学法检测Ⅱ型胶原的表达,~(35)S放射标记渗入放免定量检测蛋白多糖的合成.结果与结论:与单独髓核细胞培养组比较,传统分层培养组、新式分层培养组Ⅱ型胶原阳性细胞数、蛋白多糖合成量均明显增加(P < 0.05,P < 0.01),且新式分层培养组增高幅度大于传统分层培养组(P < 0.05).提示骨髓间充质干细胞与髓核细胞接触共培养后,能显著增加髓核细胞分化增殖和特征性物质的表达,且新式分层培养环境优于传统分层培养.     

共同培养骨髓基质干细胞对髓核细胞增殖分化的影响

目的:针对椎间盘退行性变的组织修复目前集中于细胞移植治疗,实验在体外联合培养条件下观察骨髓基质干细胞对髓核细胞增殖分化的影响。方法:实验于2005-12/2006-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和同济医院卫生部重点实验室进行。①实验方法:4月龄健康新西兰大耳白兔3只,麻醉后于髂嵴处作骨髓腔穿刺,抽吸6mL骨髓,分离骨髓基质干细胞;相同实验兔抽取骨髓后立即处死,取腰骶部脊柱之椎间盘,切开纤维环,取出髓核组织,分离椎间盘髓核细胞,同时设立单独髓核细胞培养组。②实验评估:在相同的培养条件下,定期观察两组髓核细胞在光镜下形态学变化及电镜下细胞超微结构的改变;于诱导培养7,14d通过RT-PCR法、Western blot法和免疫组化法法检测两组髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达。结果:①髓核细胞大体形态学及超微结构变化:髓核细胞与骨髓基质干细胞共同培养后,髓核细胞很快就呈现为圆形或多角形,且细胞形体变大、折光性好,贴壁时间早,数量增殖快,超微结构细胞表面可见许多短而粗的微绒毛突起,胞质内有大量扩张的粗面内质网、丰富的线粒体和高尔基体,细胞合成代谢旺盛。单独培养的髓核细胞胞体小,贴壁、增殖慢,细胞器不丰富。②髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白与聚集蛋白聚糖检测结果:RT-PCR和Western blot检测显示诱导培养7,14d骨髓基质干细胞与髓核细胞共同培养组的Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖条带均明显亮于单独髓核细胞培养组,吸光度值比较差异有显著性意义(P<0.01)。免疫组化检测显示骨髓基质干细胞与髓核细胞共同培养组中Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖在细胞胞浆中的表达随时间延长而逐渐增加,2周达到高峰,单独髓核细胞培养组中此两种蛋白表达很低,且培养第7,14天无明显变化。结论:骨髓基质干细胞在体外与髓核细胞共同培养时,能激活髓核细胞并促进其增殖分化,增加髓核细胞外基质的合成。提示骨髓基质干细胞与髓核细胞联合培养有利于退变椎间盘的髓核细胞修复、再生。     

髓核细胞诱导骨髓间充质干细胞向髓核方向的分化

背景：国内外已有很多文献相继报道了用骨髓间充质干细胞-藻酸盐复合植入材料来修复大鼠退变的腰椎间盘,但尚缺少对此复合物与正常髓核细胞之间的各项生物学指标的比较。目的：在Transwell非接触共培养条件下,研究髓核细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用。方法：全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞并鉴定,取第3代骨髓间充质干细胞及髓核细胞复合藻酸盐接种于Transwell共培养系统中,上室接种骨髓间充质干细胞藻酸盐复合物,下室接种髓核细胞藻酸盐复合物,共培养7d后回收上层骨髓间充质干细胞。结果与结论：RT-PCR方法检测共培养组Ⅱ型胶原、Sox-9和多功能蛋白聚糖的mRNA表达均接近正常髓核细胞。说明共培养条件下髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向髓核方向分化。     

骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养

背景:细胞移植治疗椎间盘退行性变目前尚处在实验室研究阶段.目的:通过SD大鼠骨髓间充质干细胞与退行性改变的髓核细胞体外共培养,探索骨髓间充质干细胞能否通过直接接触促进髓核细胞外基质的表达以及髓核细胞能否诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化.方法:取已自然退变的第6 代髓核细胞与生长良好的第4 代骨髓间充质干细胞按不同比例(75∶25,50∶50 和25∶75)体外共培养7 d,单独髓核细胞(100∶0)与单独骨髓间充质干细胞(0∶100)分别作为阳性对照和阴性对照.结果与结论:RT-PCR 检测显示共培养组(75∶25 和50∶50)蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白条带均明显亮于单独髓核细胞培养组(100∶0),吸光度值比较差异有显著性意义;免疫组织化学检测显示Ⅱ型胶原蛋白在共培养组(75∶25 和50∶50)胞浆内的表达明显高于单独髓核细胞培养组(100∶0).共培养组中可见骨髓间充质干细胞由长梭形向多角形、类圆形转变,胞浆内异染颗粒增多.提示通过体外直接接触共培养,骨髓间充质干细胞能逆转髓核细胞退变,而且髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转换.     

骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养

背景：细胞移植治疗椎间盘退行性变目前尚处在实验室研究阶段。目的：通过SD大鼠骨髓间充质干细胞与退行性改变的髓核细胞体外共培养,探索骨髓间充质干细胞能否通过直接接触促进髓核细胞外基质的表达以及髓核细胞能否诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化。方法：取已自然退变的第6代髓核细胞与生长良好的第4代骨髓间充质干细胞按不同比例（75：25,50：50和25：75）体外共培养7d,单独髓核细胞（100：0）与单独骨髓间充质干细胞（0：100）分别作为阳性对照和阴性对照。结果与结论：RT-PCR检测显示共培养组（75：25和50：50）蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白条带均明显亮于单独髓核细胞培养组（100：0）,吸光度值比较差异有显著性意义;免疫组织化学检测显示Ⅱ型胶原蛋白在共培养组（75：25和50：50）胞浆内的表达明显高于单独髓核细胞培养组（100：0）。共培养组中可见骨髓间充质干细胞由长梭形向多角形、类圆形转变,胞浆内异染颗粒增多。提示通过体外直接接触共培养,骨髓间充质干细胞能逆转髓核细胞退变,而且髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转换。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景:骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能.目的:体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件.方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3 代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1 的软骨分化诱导剂,2 周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达.结果与结论:可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖.经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性.10 μg/L 的转化生长因子β1 诱导成软骨分化能力最强.     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

背景:自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。目的:观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;取第3代骨髓间充质干细胞,分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养,观察其向成软骨细胞分化情况。结果与结论:分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形,传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44,而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原;实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞(P<0.01)。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。     

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂在大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导失巢凋亡过程中的作用

目的：利用预先铺被琼脂糖的方法抑制骨髓间充质千细胞贴壁，在体外模拟细胞离体后的悬浮状态，从而诱导细胞发生失巢凋亡，初步探讨半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂在骨髓间充质干细胞失巢凋亡过程中的作用。 方法：实验于2005—04/2006-01在华中科技大学同济医学院医学实验技术公共平台细胞工程实验室以及华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。取体质量约150g的SPF级大鼠，雌雄不限，颈椎脱臼法处死。用DMEM培养液冲洗股骨和胫骨髓腔。应用全骨髓贴壁法进行原代培养。细胞铺满整个培养瓶底面80％时，进行传代接种培养，实验选用传第2代细胞。收集细胞随机分为3组：诱导凋亡组、抑制凋亡组、对照组。诱导凋亡组进行实验前，将无菌培养皿预先铺被已消毒的琼脂糖溶液，并待其凝固；抑制凋亡组除预处理培养皿外，在植入细胞的同时，加入半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂；对照组无任何干预措施。于试验开始后2，6，12，24h分别收集三组细胞，应用荧光比色法和蛋白质印迹法检测各样本半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性和表达水平的变化；借助流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞失巢凋亡率的改变，实验重复两次。 结果：①在对照组和抑制凋亡组中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性维持在较低的水平（P〉0．05），两组间差异无显著性；诱导凋亡组中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性随着诱导持续时间的延长而明显增加，由2h的9．22上升到24h的22．74；诱导凋亡组与其他两组比较，差异具有显著性（P〈0．001）。②对照组半胱天冬酶3蛋白的表达水平稳定；抑制凋亡组半胱天冬酶3蛋白的表达维持在低水平略有升高趋势，两组间无显著性差异。诱导凋亡组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白的表达水平逐渐升高，12h     

干细胞因子促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

背景:骨髓间质干细胞体内、外均能分化为心肌细胞,但数量少且定向分化率较低。目的:探讨干细胞因子促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的作用。设计:开放性实验。单位:咸宁学院心血管疾病研究所,华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科。材料:实验于2003-10/2004-08在咸宁学院心血管疾病研究所实验中心完成。选取出生1～2d的SD新生大鼠20只,用于心肌细胞的培养。另选取清洁级成年SD大鼠25只,随机数字表法分为干细胞因子组、空白对照组,12只/组,剩余1只大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取、培养及纯化。方法:①在共培养前用4,6-联脒-2-苯基吲哚标记骨髓间充质干细胞。干细胞因子组对大鼠进行体内动员,连续5d皮下注射重组鼠干细胞因子,20μg/(kg·d),然后提取其骨髓间充质干细胞于心肌细胞培养第3天进行共培养。空白对照组皮下注射相等剂量的生理盐水,未施加任何干预的骨髓间充质干细胞于心肌细胞培养第3天进行共培养。②用数码显微摄像及免疫荧光技术分别记录和检测MHCα/β、肌钙蛋白T的表达,测定4,6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的百分率。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞生长情况。②检测4,6-联脒-2-苯基吲哚对骨髓间充质干细胞的核标记率。③拟做共培养的心肌细胞活力、纯度分析。④共培养后骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化情况。结果:①骨髓细胞悬液接种于塑料培养皿,细胞呈圆形散在分布于瓶底,24h换液后可见稀少的长梭形贴壁细胞,4d后梭形贴壁细胞开始增多,进入对数增长期,8～12d达到80%的融合。传代细胞增殖更加迅速,随着换液与传代,骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化。②4,6-联脒-2-苯基吲哚对骨髓间充质干细胞的胞核标记率为100%。③心肌细胞体外培养第3天,搏动细胞的百分比为63%,搏动频率40～60次/min。免疫细胞化学技术检测肌钙蛋白T表达的阳性细胞百分比为75%。④在共培养的第2,3天,干细胞因子组4,6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞表达MHCα/β的阳性百分率均显著高于空白对照组(P<0.01);在共培养的第3,4,5天,干细胞因子组4,6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞表达肌钙蛋白T的阳性百分率亦均显著高于空白对照组(P<0.01)。结论:干细胞因子对骨髓间充质干细胞具有明显的促增殖分化作用。     

神经营养素3基因转染神经干细胞及其表达

背景:应用包括神经营养素3的神经营养因子促进周围神经再生是当今周围神经再生研究的热点之一,但是临床应用上缺乏安全、有效的给药途径.基因转染技术为神经营养因子的临床应用提供了新的思路和途径.目的:用神经营养素3基因修饰神经干细胞,并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况.设计:完全随机试验.单位:广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科和华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科.材料:实验选用健康SD大鼠3只,鼠龄4个月,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院动物房提供.用于转染神经干细胞的重组腺病毒表达载体由华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室构建,浓度为0.15 g/L.方法:实验于2002-12/2004-03在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成.采用阳离子脂质体介入法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的组组质粒pAd-神经营养素3转染原代培养的神经干细胞,转染72 h后采用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白在神经干细胞上的表达,测定转染率.采用免疫细胞化学染色法和反转录-聚合酶链反应检测转染72 h,1,5周后神经营养素3基因在神经干细胞中的表达和转录情况.主要观察指标:神经营养素3基因在转染后的神经干细胞内的表达情况.结果:①重组质粒pAd-神经营养素3转染神经干细胞:转染72h绿色荧光蛋白在部分神经干细胞上有表达,转染率为40%.5周后仍可见绿色荧光蛋白的表达.②神经营养素3基因在神经干细胞中的转录与表达:转染72 h,1,5周后神经干细胞中均有神经营养素3 mRNA的转录,转染5周后仍有神经营养素3 mRNA的表达.结论:神经营养素3基因以阳离子脂质体为载体,通过腺病毒的介导,可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达.     

绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能

背景:为便于进一步追踪骨髓间充质干细胞,常需对其进行标记.目的:采用绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞,观察标记后其诱导成骨及成脂能力.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行.材料:4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心.方法:无菌条件下取兔双侧股骨,应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞.取传至第3代细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选得到稳定转染的细胞,分别进行成骨、成脂诱导.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态、表面标志表达、绿色荧光蛋白标记情况,骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化潜能.结果:经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞多呈纺锤形或梭形,成纤维细胞样,流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.经G418筛选后,镜下可见大量发出绿色荧光的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后有较多的钙盐沉积,茜素红染色呈红色;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,2周后油红O染色示有大量脂质沉积.结论:绿色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能.     

人嗜铬细胞微囊化处理对大鼠异种移植的免疫隔离作用

背景:课题组前期在建立海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊包裹活细胞制备技术的基础上,已证明微囊化嗜铬细胞有良好的镇痛效果,而该微囊包被材料的免疫隔离作用尚需明确.目的:观察海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化嗜铬细胞移植到大鼠眼前房和足胝部的免疫排斥反应,评价微囊化技术的免疫隔离作用.设计:随机对照动物实验.单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室.材料:选用雌性 SD大鼠48只,鼠龄3个月,由华中科技大学同济医学院实验动物部提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.实验所用海藻酸钠、多聚赖氨酸为美国Sigma公司产品,微囊发生器为德国赠送.方法:实验于2002-09/2003-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学实验室完成.①取6名脑死亡健康成人的肾上腺髓质,经分离、消化、培养后,制备成人嗜铬细胞悬液.供者家属对实验知情同意,实验方案通过医院伦理委员会批准.采用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠法制作空微囊和微囊化细胞.②48只大鼠被随机分为3组:人嗜铬细胞移植组、空微囊移植组、微囊化人嗜铬细胞移植组,每组分眼前房和足胝部两个部位进行移植,每个部位8只.人嗜铬细胞移植组分别将2×1010 L-1细胞悬液注入大鼠右眼前房和左足胝部.空微囊移植组和微囊化人嗜铬细胞组分别吸取空微囊(100个微囊)或ME-HCC(100个微囊,每个微囊包裹400～500个细胞)注入大鼠右眼前房和左足胝部.主要观察指标:于移植术后第7天采用ELISA法测定血清白细胞介素2水平.采用激光散射比浊仪测定血清IgG和IgM水平.移植术后第28天取大鼠右侧眼球及左侧足组织作常规切片,苏木精-伊红染色,40倍光镜下观察组织形态.结果:大鼠48只均进入结果分析.①血清白细胞介素2,IgG,IgM水平:空微囊移植组和微囊化人嗜铬细胞移植组均低于人嗜铬细胞移植组,差异有显著性意义(t=8.544～21.64,P < 0.01).②大鼠眼前房和足胝部组织形态:人嗜铬细胞移植组大鼠的眼前房内和足胝部可见大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润.空微囊移植组和微囊化人嗜铬细胞移植组大鼠眼前房和足胝部仅见少量淋巴细胞和中性粒细胞.结论:海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化所产生的良好生物相容性及其机械稳定性,使之有效地发挥了免疫排斥隔离作用.     

脉冲电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化的影响

背景:间充质干细胞的增殖分化缺乏可调控性,结合适当载体后不能高效增殖分化是阻碍其进入临床的瓶颈.脉冲电磁场若能有效调控干细胞向骨源细胞分化将具有重要的临床价值.目的:观察脉冲电磁场刺激后,小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2004-0512007-10在华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨科实验室完成.材料:BALB/C小鼠20只,由同济医学院实验动物中心提供.脉冲电磁场发生器由海军工程大学电机系设计与制造.方法:无菌分离小鼠双侧股骨,Percoll密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,再用贴壁筛选法纯化扩增.取生长良好的第3代细胞,调整细胞密度为2×10~7L~(-1)接种于6孔板,分成4组:空白对照组加入完全培养基组;脉冲电磁场组给予50 Hz、正弦波形、强度1 mT的脉冲电磁场辐射,2次/d,30 min/次,间隔12 h,共10 d;成骨诱导组加入含地塞米松、甘油磷酸钠、VitC的完全诱导培养基;脉冲电磁场+成骨诱导组给予相同的脉冲电磁场辐射后加入完全诱导培养基.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的分化情况.结果:碱性磷酸酶染色结果显示,干预10 d后,空白对照组为阴性;脉冲电磁场组呈弱阳性:成骨诱导组呈阳性;脉冲电磁场+成骨诱导组呈强阳性.与空白对照组比较,成骨诱导组、脉冲电磁场+成骨诱导组I型胶原免疫组化染色吸光度值均明显升高(P<0.05,P<0.01).结论:50 Hz、正弦波形、强度1 mT脉冲电磁场干预一定时间后,能够增强小鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶及I型胶原的表达,促进其分化成骨.     

脉冲电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

背景:脉冲电磁场作为一种非侵入性疗法治疗骨不连及其他的骨科疾病已被证实有确切的临床疗效。但由于认识的局限性,骨髓间充质干细胞在脉冲电磁场治疗骨折中的作用未被充分重视。目的:观察小鼠骨髓间充质干细胞在50Hz、正弦波形、不同强度、不同作用时间脉冲电磁场干预下的增殖情况,以及其细胞周期变化,以寻求最佳干预窗口。设计:单一样本、区组设计,观察对比体外细胞培养实验。单位:华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨科。材料:选用BALB/C小鼠20只,鼠龄4～5周,体质量18～22g,雌雄不拘,由同济医学院实验动物中心提供。此动物实验符合动物伦理学要求。脉冲电磁场发生器(海军工程大学电机系设计与制造)。方法:实验于2005-02/12在华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨外科实验室完成。用密度梯度离心法分离小鼠骨髓间充质干细胞,再用贴壁筛选法筛选,对生长良好的第3代的小鼠骨髓间充质干细胞分别给予50Hz、强度分别为4,3,2,1mT的正弦波形脉冲电磁场,2次/d,每次30min,间隔12h,以不加电磁场干预的干细胞为对照组。主要观察指标:在照射第24,48,72h后采用MTT法测定骨髓间充质干细胞增殖水平;采用流式细胞仪分析细胞周期,以增殖指数(prolifera-tionindex,PI)表示脉冲电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞分裂增殖的影响。结果:脉冲电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响:脉冲电磁场照射24,48h后各干预组与对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。脉冲电磁场照射72h后各干预组骨髓间充质干细胞增殖数目多于对照组,差异有显著性意义(P<0.05～0.01),其中以1mT强度照射最为明显(P<0.01)。脉冲电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞细胞周期的影响:在检测的所有细胞样本中均未发现有DNA倍体异常的细胞(diploid:100%)。骨髓间充质干细胞经过72h的强度为1,2,3,4mT的脉冲电磁场干预后PI值高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05～0.01),其中以1mT最为明显(P<0.01)。结论:50Hz、正弦波形、强度为1mT的脉冲电磁场照射72h能明显促进体外小鼠骨髓间充质干细胞增殖,是最佳干预窗口。     

猪主动脉内皮细胞在血管紧张素作用下血管活性物质变化及丹参酮ⅡA的保护效应

背景:导致血管内皮细胞损伤的因素中,肾素-血管紧张素系统、尤其是局部肾素-血管紧张素系统所产生的血管紧张素Ⅱ起着重要的病理生理作用。目的:观察丹参酮ⅡA对血管紧张素Ⅱ作用下的血管内皮细胞分泌一氧化氮及其内皮型一氧化氮合酶基因表达的影响和细胞内游离钙离子浓度水平的改变,探讨丹参酮ⅡA对血管内皮细胞的保护作用。设计:观察对比实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊内科。材料:实验于2006-03/10在华中科技大学同济医学院基础医学实验中心完成。实验用猪主动脉由同济医学院病理生理教研室提供。方法:采用硝酸还原法、逆转录聚合酶链反应,分别检测不同浓度(10-8～10-6mol/L)作用不同时间(1,6,24h)的血管紧张素Ⅱ对培养的猪主动脉内皮细胞产生一氧化氮及其内皮型一氧化氮合酶mRNA表达的影响;然后比较在10-6mol/L的血管紧张素Ⅱ作用的不同点(0,6h)加入50mg/L浓度的丹参酮ⅡA,分别检测作用1,6,24h后内皮细胞的一氧化氮生成和内皮型一氧化氮合酶的基因表达变化。用激光共聚焦扫描显像系统检测内皮细胞内游离钙离子浓度水平的变化。主要观察指标:①一氧化氮含量。②内皮型一氧化氮合酶mRNA表达。③游离钙离子浓度。结果:①随着血管紧张素Ⅱ浓度的增加、作用时间的延长,内皮细胞一氧化氮的产生及内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达呈顺序下降(P<0.01)。②丹参酮ⅡA各组一氧化氮的产生及内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达明显高于血管紧张素Ⅱ组,在丹参酮ⅡA作用1,6h,血管紧张素Ⅱ 丹参酮ⅡA组一氧化氮的产生及内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达明显高于血管紧张素Ⅱ6h 丹参酮ⅡA组(P<0.05);随着作用时间延长至24h,两组间差异无显著性(P>0.05)。③主动脉内皮细胞游离钙离子浓度:血管紧张素Ⅱ组显著高于空白对照组(P<0.01),丹参酮 血管紧张素Ⅱ组显著低于血管紧张素Ⅱ组(P<0.05)。结论:丹参酮ⅡA可抑制血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞分泌一氧化氮以及细胞内皮型一氧化氮合酶基因表达的负性作用,可能通过多种途径对血管内皮细胞及其功能起到保护作用。     

单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及对骨肉瘤细胞增殖的抑制

背景：以往的研究表明，ADp14ARF转染p53阳性的肿瘤细胞系，可以发现明显的细胞增殖受阻现象。而转染p53阴性的肿瘤细胞系，尽管也可见肿瘤细胞增殖受阻，但在程度上明显轻于前者。同时转染p14ARF和p53两种基因，既增强p53表达又加强p53积累，能否更易促进肿瘤细胞凋亡？目的：利用基因工程技术构建双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53，并观察其对骨肉瘤细胞增殖生长的抑制作用。设计：随机对照观察。单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科。材料：实验于2005—01／2006—10于华中科技大学同济医学院基础医学院免疫教研室公共实验平台完成。人骨肉瘤MG-63细胞有华中科技大学同济医学院免疫教研室细胞室提供。含p53全长基因序列的质粒pIRES-p53和pIRES载体均购自武汉晶赛生物公司。方法：利用基因工程技术，将从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增出的p14cDNA（0．5kb）亚克隆至pIRES载体中，通过PCR、限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pIRES-p14ARF-p53。通过脂质体介导转染入骨肉瘤MG-63细胞中，并筛选出阳性克隆，将细胞分为3组：空白对照组（MG-63细胞），空载体对照组（稳定转染pIRES-neo细胞），p14ARF-p53组（稳定转染pIRES-p14ARF-p53细胞）。①采用流式细胞仪测定转染前后瘤细胞DNA含量和细胞周期。②逆转录PCR（RT-PCR）和Westem bolt对稳定转染后的瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达进行定性和半定量检测。③采用噻唑蓝比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。主要观察指标：①骨肉瘤细胞DNA含量和细胞周期。②瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达。③细胞增殖情况。结果：成功构建出双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53。①骨肉瘤细胞DNA含量和细胞周期：流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞多停滞于G1期。②蛋白表达检测结果：RT-PCR与Western blot检测证实p14ARF、p53基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达。③细胞生长情况：转染MG-63后24，48，72，96h瘤细胞生长抑制率分别为33．43％、69．37％、66．19％、75．26％，与空载体对照组差异显著（P〈0．01）。结论：野生型p53和p14ARF可协同抑制骨肉瘤细胞的增殖促进瘤细胞的凋亡。