人源抗-HBs Fab优化表达条件的初步探讨

目的：利用含重组质粒pBAD/HBs Fab的Top10大肠杆菌，优化表达人源抗－HBs Fab。方法：选取含pBAD/HBs Fab载体的Top10大肠杆菌单个克隆分级培养，将制备的二级种子液接种于摇瓶和KLF2000发酵罐中，摇瓶培养表达采用不同的菌体诱导起始密度、诱导剂浓度、诱导表达温度和诱导表达时间。发酵罐培养表达采用不同的培养基和菌体诱导起始密度。诱导表达完毕后，纯化蛋白，比较表达量，并鉴定所获蛋白的抗原性和生物学活性。结果：用摇瓶优化表达后，Fab蛋白占菌体总蛋白的6％，为0.8%mg/g菌体，利用发酵培养可进一步增加菌量，使蛋白表达量达80mg/L。所获蛋白经鉴定显示有较好的生物学活性。结论：用重组质粒pBAD/HBsFab,Top10表达系统，可得到80mg/L的具有较好生物学活性的人源抗－HBs Fab蛋白，为批量生产作了准备。     

人源抗HBsAg 抗体Fd段和L链高效表达菌株的筛选

目的：选用高效表达载体分析高效表达人源抗HBsAg抗体的Fd段和L链，经体纯化和变性复性使Fd段和L链之间形成二硫键，最终制备有活性、高产量的人源抗HBsAg基因工程抗体Fab。方法：用PCR法从可溶性表达重组质粒抗HBsAg Fad Comb3扩增Fd段和L链后分别构建高效表达载体PQE32－Fd和PQE332－L，并分别导入大肠杆菌M15中进行表达，用SDS－PAGE筛选出高效表达克隆。结果：SDS-PAGE筛选的高效表达克隆M15－PQE32－Fd和M15－PQE32－L经IPTG诱导后以包涵体形式表达，其表达量很高。从高效表达克隆重新扩增Fd段和L链后进行测序鉴定发现所得的序列与已报道的抗HBsAg抗体Fab基因吻合率为97％。结论：虽然已有表达可溶性人源抗HBsAg基因工程抗体Fab的报道，但因其表达量低而不能实际应用。筛选出高效表人源抗HBsAg抗体Fd段和L链的克隆，因为包涵体形式表达需经变性复性，虽然变性复性后其产量会受影响，但因表达量很高，所以还是具有很高的实际应用价值。其包涵体变性复性条件仍需进一步探讨。     

抗甲型肝炎病毒抗体Fab在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中高效表达人源抗HAV抗体Fab，为进一步研究该抗体的功能奠定基础。方法 依次将抗HAV抗体的Fd及轻链基因克隆到表达载体pASK84的不同信号序列下，构建成Fab表达质粒，在大肠杆菌JM83中进行表达，并对表达产物进行复性。用SDS－PAGE、western blot和ELISA法检测Fab的表达及其与甲肝病毒抗原的结合活性。结果 构建了抗HAV Fab的重组表达质粒p84Fab，在大肠杆菌JM83中获得表达，表达的Fab占全菌的25％，主要以包涵体形式存在，复性后具有抗原结合活性；培养基、菌体可溶性蛋白部分也能检测到有抗原结合活性的Fab。结论 抗HAV抗体Fab在大肠杆菌中得到了表达，并具有良好的抗原结合活性。     

固相放免法测定工程化人源性抗—HBs Fab抗体含量

乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)是反映机体对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)免疫能力的指标。我们以基因工程技术获得表达人源性抗—HBs Fab片段的工程化大肠杆菌,发酵表达该抗体的可溶性Fab片段,用固相放射免疫分析(SPRIA)定量测定Fab纯化晶的抗-HBs活性,结果如下。 材料和方法 一、人源性抗-HBs Fab抗体的制备:工程化人源性抗-HBs Fab片段的制备参见文献报道,并用抗-HBs阳性病员血清同法纯化作为对照。     

亲和层析纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体

目的：纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体，建立稳定、适于生产应用的纯化工艺。方法：以原核表达的重组人源性抗HBs scFv免疫BALB／c小鼠，经杂交瘤技术制备大量分泌mAb的杂交瘤细胞株14F7。将该细胞株注入小鼠腹腔制备mAb腹水，经辛酸沉淀纯化后，制备亲和层析柱。纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体。结果：用抗scFv mAb亲和层析柱纯化的重组人源性抗HBsAg Fab的纯度可达95％以上，回收率可达70％～85％。结论：人源性抗HBs scFv制备mAb作为亲和层析的介质，可有效地从酵母发酵上清中纯化重组人源性抗HBsAg Fab，适用于大规模生产重组人源性抗HBsAg Fab。     

小鼠FcγRⅢ原核表达、纯化及鉴定

目的: 制备纯化重组蛋白mFcγRⅢ,并鉴定其生物学活性.方法: 从克隆载体mRⅢ-T中扩增mFcγRⅢ胞外区,构建原核表达载体pETmRⅢ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot对重组表达蛋白进行鉴定;表达产物通过包涵体纯化后用稀释方法复性;ELISA检测复性蛋白活性.结果: 成功构建了重组表达质粒pETmRⅢ,纯化和复性了重组蛋白mFcγRⅢ;复性的重组蛋白mFcγRⅢ具有较强的体外活性.结论: 原核重组蛋白mFcγRⅢ复性后具有较强的体外结合配体特性,为探索重组蛋白治疗自身免疫病奠定了基础.     

BAC5-scFv的表达、复性及活性检测

目的探讨以包涵体形式表达的抗鼻咽癌单克隆抗体(mAb)BAC5的单链抗体(BAC5-scFv)的纯化、复性方法,并对其活性进行检测。方法扩增pET-22b-scFv质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株,培养、破菌后,分离和变性包涵体,用Ni-NTA His Bind层析柱纯化变性的scFv。经稀释、透析及尿素梯度凝胶层析柱3种方法进行复性。用细胞免疫组化染色和蛋白印迹法(Western blot),鉴定复性后的BAC5-scFv的免疫活性。结果Ni-NTA His Bind亲和层析柱能有效纯化变性的scFv。以尿素梯度凝胶层析柱复性的蛋白回收率最高。免疫细胞化学染色法检测及Western blot分析证实,复性后的BAC5-scFv可与CNE2细胞上的抗原特异性结合。结论以包涵体形式表达的BAC5-scFv经变性、纯化及复性后,获得良好的免疫活性,为大量制备具有活性的BAC5-scFv,并用于鼻咽癌的放射免疫显像和治疗研究奠定了基础。     

人白细胞介素4的原核表达、复性、纯化及生物学活性鉴定

用PCR方法从pORF-hIL4质粒中扩增重组人白细胞介素4(hIL-4)的基因,构建PQE60原核表达载体并诱导其目的蛋白的表达。对表达的目的蛋白的可溶性进行鉴定,发现hIL-4基因表达产物在大肠杆菌中主要以不溶性包涵体形式存在,经过超声波破细菌、包涵体提取、洗涤处理后,用5mol/L盐酸胍变性溶解包涵体沉淀,上清稀释复性后透析,再经镍亲和层析进行纯化。纯化后的hIL-4进行TF-1细胞体外增生实验检测其生物学活性后,可用于人外周血树突状细胞的体外诱导培养。     

人TRAIL分子胞外区的纯化及活性检测

目的：利用大肠杆菌表达hTRAIL41-281蛋白，并纯化复性成生物活性形式。方法：以IPTG诱导表达，使用Ni-NTA层析柱分离纯化蛋白，透析法复性，SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定，DNA断裂实验检测hTRAIL41-281蛋白的凋亡诱导活性。结果：表达的蛋白以包涵体的形式存在，纯化后得到分子量为30.5kD、纯度在90％以上的蛋白，Western blot证实为hTRARIL41-281分子。经复性，DNA断裂实验检测出该蛋白有较好的诱导肿瘤细胞凋亡活性。结论：成功地利用大肠杆菌表达、Ni—NTA层析柱分离纯化、透析法复性hTRAIL41-281蛋白，并证实其具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性。     

人源抗癌胚抗原单克隆抗体的获得与鉴定

目的：获得抗癌胚抗原（CEA）的单克隆抗体（mAb）。方法：采用特殊的5轮筛选法（逐轮降低抗原包被量，严格洗脱条件），以固相化的人源CEA抗原淘筛本室构建的人源特异性噬菌体抗体库。获得有特异结合活性的CEA噬菌体抗体，酶切鉴定插入的抗体基因。切去噬菌粒上衣壳蛋白gⅢ基因，构建表达载体，在大肠杆菌中可溶性表达抗CEA抗体Fab段，ELISA、Western blot检测抗体免疫学活性，测序分析抗体基因。结果：筛选出4株与CEA抗原特异结合而与BSA、HBsAg无交叉结合反应的噬菌体抗体。切去gⅢ基因，在大肠杆菌中表达可溶性抗体Fab段，表达量在细菌培养液上清和细菌裂解液中无统计学意义。可溶性抗体与人CEA抗原有特异结合活性，与BSA、HBsAg无交叉结合反应。Western blot显示在略大于相对分子质量（Mr）45000处有一明显条带，与Mr48000的Fab大小一致。DNA测序分析表明Fab段VH属于IgGVH3基因家族，VL属于VK1基因家族。结论：抗CEA噬菌体抗体库的构建和人源抗CEAmAb的制备，为CEA阳性表达肿瘤的靶向治疗奠定基础。     

胰淀素Fab抗体的筛选及初步鉴定

目的:从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选胰淀素(amylin又称为胰岛淀粉样多肽)Fab抗体,测定其特异性及抗原结合活性.方法:以胰淀素为抗原,对抗体库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选;将从人源噬菌体抗体库中筛选出的阳性克隆,提取其质粒、切除gⅢ、自身环化并转入大肠杆菌中,以IPTG诱导表达可溶性抗体,最后用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定抗原结合活性和特异性.结果:成功筛选并表达了抗胰淀素的可溶性Fab抗体,经SDS-PAGE蛋白电泳,在相对分子质量约为47 kD处可见一蛋白条带.ELISA和Western blot证实了该Fab片段与胰淀素抗原的结合活性和特异性.结论:利用噬菌体抗体库技术获得了人源性的特异抗胰淀素Fab抗体,为临床进行下一步研究奠定了基础.     

Stx1-A亚单位的原核表达、复性及抗原性鉴定

目的构建志贺毒素1-A亚单位(Stx1-A)原核表达质粒,使其在大肠埃希菌中表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其抗原性及应用价值。方法以大肠埃希菌O157DNA为模板扩增Stx1-A基因,重组克隆入原核表达载体pET32a( ),转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,包涵体经镍柱柱上复性和纯化,并对纯化产物进行Western印迹鉴定。结果重组质粒经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。重组蛋白经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,其表达量占细菌总蛋白量的15%左右,主要以包涵体形式存在,通过镍柱柱上复性获得纯化的可溶性Stx1-A蛋白,纯度达95%以上,Western印迹检测显示特异性条带。结论成功构建了pET32a( )/Stx1-A重组质粒,并获得了具有抗原特异性的可溶性Stx1-A蛋白,为进一步制备抗Stx1-A抗体和研究其生物学功能奠定了基础。     

抗角蛋白Fab抗体在大肠杆菌中的表达与复性研究

目的 :用大肠杆菌分别表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,体外复性得到Fab抗体。方法 :从已构建的质粒p3MH/Fab中 ,亚克隆抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段基因 ,并分别插入载体pET32a中 ,构建重组质粒。以重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下进行表达。SDS PAGE分析发现 ,在相对分子量 (Mr)为 2 5 0 0 0处有外源蛋白表达。轻链和Fd片段变性后等量混合于折叠液中 ,复性后形成Mr 约为4 5 0 0 0的蛋白。结果 :成功地表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,ELISA和Westernblot证实 ,复性产物具有与角蛋白结合的能力。结论 :获得了具有活性的抗角蛋白的Fab抗体 ,为其应用研究打下了基础 ,也表明包涵体表达基因工程抗体技术是可行的。     

工程化人源性抗-HBs Fab抗体的制备、纯化和鉴定

用获得的表达人源性抗 ＨＢｓＦａｂ片段的大肠杆菌,发酵表达该抗体的可溶Ｆａｂ片段。以羊抗人Ｆａｂ抗体偶联ＨｉＴｒａｐ柱,用Ａｃｔｉｓｅｐｅｌｕｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ作为洗脱液,在ＦＰＬＣ上纯化。用ＳＤＳ ＰＡＧＥ及蛋白印迹法分析、鉴定,用固相放兔法检测其活性单位。蛋白印迹及ＥＬＩＳＡ显示转化菌株有抗 ＨＢｓＦａｂ片段的表达。经ＦＰＬＣ纯化的抗体Ｆａｂ片段呈单一峰,与抗 ＨＢｓ阳性血清相似。纯化后的抗体Ｆａｂ片段达到电泳纯,具有较高的活性。     

HLA-A*0203-BSP的表达和复性及其四聚体的鉴定

目的：优化诱导条件大批量表达生物素化酶BirA底物肽（BSP）与HLA-A＊0203重链胞外域的融合蛋白（HLA—A＊0203、BSP），并制备负载HLA-A＊0203限制性EB病毒抗原肽EBNA3 596-604的四聚体（HIA—A}0203／SVR）。方法：以HLA—A＊0203-BSP原核表达载体转化E．coli BL21（DE3）菌株，优化诱导条件进行大批量重组蛋白的表达。通过稀释法复性可溶性HLA-A＊0203／SVR单体，然后以BirA对其进行生物素化，并以阴离子交换树脂纯化。将纯化的HLA-A＊0203／SVR单体与荧光素标记的链亲和素按4：1的比例混合形成四聚体，通过对特异性CTL进行染色验证其结合活性。结果：当IPTG的浓度为0．4mmol／L，于37℃诱导过夜后，融合蛋白的表达最多。该重组蛋白相对分子质量（Mr）为34003，与HLA—A＊0203-BSP的理论Mr相一致。该重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀部分，约占菌体总蛋白的30％。负载抗原肽的可溶性HLA-A＊0203／SVR单体是在同时存在HLA-A＊0203，BSP、β2微球蛋白及HLA-A＊0203限制性抗原肽SVR的情况下通过稀释法复性而获得。该单体生物素化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4：1的比例混合后即形成四聚体。流式细胞术（FCM）分析证实，该四聚体具有与HLA—A2^＋供者特异性CTL结合的活性。结论：HLA—A＊0203-BSP融合蛋白在优化条件下获得高效表达。以此蛋白制备的HLA-A＊0203／SVR四聚体具有与HLA-A2^＋供者特异性CTL结合的活性，为研究HLA—A＊0203个体EB病毒特异性CTL的免疫应答打下了基础。     

人胆固醇酯转运蛋白的eDNA克隆、原核表达及抗血清制备

目的:克隆人胆固醇酯转运蛋白(CETP)eDNA序列,利用大肠杆菌表达人CETP,制备兔抗人CETP的多克隆抗血清.方法:采用RT-PCR方法,将人CETP基因克隆到pET-30b( )上,构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备CETP抗血清,以ELISA、Western blot、细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定.结果:SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CETP基因在大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为4 h.将切胶纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶5.12×105.Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示,抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合.结论:成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、高特异性的兔抗人CETP抗血清,为进一步研究CETP的结构与功能奠定了基础.     

基因工程技术制备人源抗HBsAg抗体Fab片段

将从抗体文库中筛选出的抗HBsAg Fab阳性克隆转化大肠肝杆菌 ,IPTG诱导表达 ,经Western blot鉴定 ,证实上清中含有可溶性抗HBsAg Fab片段 ,应用自制的羊抗人免疫球蛋白片段抗体 (anti Fab )与Gama bind交联制备的亲和层析柱纯化表达产物 ,所得纯化产物在SDS PAGE中形成单一条带 ,经Western blot证实具备良好抗原特异性 ,Dot blot证实具备良好抗原结合活性。     

乙肝多表位抗原基因非融合表达载体的构建和表达

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)多表位基因的在原核载体中的克隆、游离表达及其产物的抗原性.方法:设计、并合成HBV多表位抗原基因BPT, 克隆入原核表达载体pBAD/gIIIA, 进而转化Top10大肠杆菌, 阿拉伯糖诱导表达出HBV多表位抗原蛋白(B-BPT), 并用Western blot方法初步检测该抗原蛋白的抗原性.结果:成功构建了原核表达载体pBAD/BPT, 在大肠杆菌中表达出HBV多表位抗原蛋白B-BPT, Western blot 检测显示该蛋白具有良好抗原性.结论:HBV多表位抗原基因的设计是成功的, 其在大肠杆菌中表达的非融合蛋白具有良好的抗原性, 可能是较理想的HBV治疗性疫苗候选物.