人胚神经干细胞植入脑出血大鼠的存活和分化状态

背景:研究证实外源性神经干细胞能修复神经,促进脑出血后神经功能障碍的恢复.然而,脑出血后局部内环境对移植神经干细胞存活分化的影响是一个复杂多变的过程.目的:观察人胚神经干细胞植入脑出血大鼠脑内的存活和分化状态.设计、时间及地点:免疫组织化学水平的开放性实验,于2007 05/2008 04在泸州医学院附属医院分子生物实验室完成.材料:纳入40只SD雌性大鼠,由中国医学科学院实验动物研究所提供;8周龄流产胚胎大脑由德阳市人民医院医院妇产科提供.方法:取8周龄流产人胚胎大脑皮质细胞,体外培养获得人胚神经干细胞.通过注射自体动脉血到尾状核制作大鼠脑出血模型,出血后2 d将标有5'-溴脱氧尿嘧啶的人胚神经干细胞悬液移植到血肿腔周围的4点,1,2周后处死大鼠,相邻脑组织切片行5'-溴脱氧尿嘧啶,微管相关蛋白2和5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染.主要观察指标:应用免疫组织化学及免疫荧光染色方法观察移植入脑出血大鼠脑内的人胚神经干细胞存活、分化状态和迁徙情况.结果:5'-溴脱氧尿嘧啶阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后1周及2周均可见其存活并向周围迁移,且移植后2周迁移的范围广.移植后1周,脑组织切片见5'-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2和5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞,且5' -溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2双阳性细胞多于5' -溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞.移植后2周,5' -溴脱氧尿嘧啶阳性细胞数明显减少,在脉络丛和微血管中可见,且5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于5'-溴脱氧尿嘧啶,微管相关蛋白2双阳性细胞.结论:人胚神经干细胞移植入脑出血大鼠脑内能够存活,移植后逐渐分化为神经细胞和星形胶质细胞.     

人胚神经干细胞植入脑损伤大鼠的存活和分化状态

背景:神经干细胞的发现为中枢神经系统损伤修复带来希望,但脑损伤后的内部环境对神经干细胞存活和分化的影响是一个复杂多变的过程。目的:观察大鼠脑液压冲击伤后植入的人胚神经干细胞存活情况和分化状态。设计:开放性实验。单位:广东省中医院神经外科,北京市神经外科研究所。材料:实验于2002-09/2003-03在北京市神经外科研究所神经干细胞室完成。选取SD雌性大鼠24只(购自中国医学科学院实验动物研究所,动物质量合格证号:SCXK(京)2002-2003),7周龄,体质量(250±10)g。8周龄流产胎儿大脑(产妇及其家属均同意提供),流产过程中B超监测胎儿的存活状况。BrdU单克隆抗体(Sigma公司),兔抗巢蛋白多克隆抗体(Chemicon公司),鼠抗微管相关蛋白2单克隆抗体(Neomarkers公司),兔抗胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体(Biogenex公司)。方法:①取8周龄流产胎儿大脑皮层细胞,体外培养获得人胚神经干细胞。②大鼠制作液压冲击伤模型。大脑皮质运动感觉区骨窗位置:以前囟为零点,向后2.5mm,中线右3.0mm。液压冲击参数:冲击压力0.3MPa,冲击时间25ms,冲击次数为1次。③伤后24h在损伤区移植标有BrdU的人胚神经干细胞,1周和4周后处死大鼠,邻片行BrdU/微管相关蛋白2和BrdU/胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染。主要观察指标:①人胚神经干细胞移植后的存活及迁移。②人胚神经干细胞移植后的分化。结果:①BrdU阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后1,4周均可见其存活并向周围迁移,且移植后4周迁移的范围更广。②移植后1周,皮质颗粒层和皮层下均见较多的BrdU阳性细胞,且BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞多于BrdU/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞;移植后4周,BrdU阳性细胞数明显减少,脉络丛和微血管中可见BrdU阳性细胞,且BrdU/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞。结论:人胚神经干细胞能够存活于脑损伤区域,移植后逐渐分化为星形胶质细胞,且易被内皮吞噬细胞所消化。提示免疫排斥反应可能影响人胚神经干细胞的存活。     

大鼠脑损伤对移植人胚神经干细胞存活和分化的影响

目的 探讨大鼠脑液压冲击伤(FPI)后对植入的人胚神经干细胞(HNSCs)存活和分化的影响。方法 取8周龄人胎儿大脑皮层细胞，体外培养获得神经干细胞(NSCs)，巢蛋白免疫荧光染色；SD大鼠制作FPI模型．于伤后24h在损伤区移植标有5-溴脱氧脲嘧啶(BrdU)的HNSCs，1周和4周后处死大鼠，邻片行BrdU／微管相关蛋白-2(MAP-2)和BrdU胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学双染。结果 HNSCs移植后1周可见BrdU阳性细胞向周围迁移，且BrdU／MAP-2双阳性细胞多于BrdU GFAP双阳性细胞；移植后4周BrdU阳性细胞迁移的范围更广，但细胞数量明显减少，脉络丛和微血管中可见BrdU阳性细胞．BrdU／GFAP双阳性细胞多于BrdU／MAP-2双阳性细胞。结论 HNSCs能存活于损伤区域，移植后逐渐分化为星形胶质细胞．且易被内皮吞噬细胞吞噬。     

地塞米松对人胚神经干细胞移植治疗大鼠脑液压损伤的影响

目的:有较多的学者提出,中枢神经系统是一个部分免疫豁免区,仍然存在干细胞移植后的排异问题,为求证免疫排异的存在与否,实验拟探讨人胚神经干细胞移植治疗脑液压损伤大鼠的移植免疫及其对策。方法:实验于2003-01/2003-07在北京神经外科研究所神经干细胞室完成。①实验材料:人胚来源:12周龄死胎大脑,产妇及家属知情同意,来自北京天坛医院产科。SD雌性大鼠30只,体质量(290±10)g,购自中国医学科学院实验动物研究所。②实验方法:体外培养人胚神经干细胞,并用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记,液压冲击大鼠右侧大脑皮质运动感觉区制作脑损伤模型,将其分为实验组与对照组。实验组在移植人胚神经干细胞后使用地塞米松腹腔注射,对照组移植人胚神经干细胞后仅使用生理盐水腹腔注射。③实验评估:脑外伤后24h移植人胚神经干细胞,于人胚神经干细胞移植后1周脑组织切片免疫组织化学染色检测BrdU、巢蛋白、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白蛋白表达。采用流式细胞仪计数分析检测大鼠脑组织CD4 T细胞淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比。结果:两组移植后1周,均见BrdU阳性细胞从移植区域向周围扩散,切片巢蛋白、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白均为阳性,且微管相关蛋白2阳性细胞较多;实验组侧脑室脉络丛和脑实质的微血管中只见有少量的BrdU阳性细胞,对照组脉络丛中见大量聚集的BrdU阳性细胞。两组CD4 T淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比差异有显著意义(P<0.05)。结论:异种神经干细胞移植治疗脑损伤可能存在免疫排斥反应,地塞米松对其存在抑制作用。     

人胚神经干细胞植入大鼠脑梗死区后的存活和分化

背景:神经干细胞移植可明显改善受损的神经功能,但在体内外多种因素的影响下,移植的神经干细胞其分化数量和分化方向受到限制.目的:观察人胚神经干细胞植入大鼠脑梗死区后的存活、迁移和分化情况.设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2007-04/2008-04在泸州医学院附属医院分子生物实验室完成.材料:SD雌性大鼠30只,由中国医学科学院实验动物研究提供.流产胎儿由泸州医学院附属医院妇产科提供.方法:取流产胎儿大脑皮质,剪碎后消化离心,过滤后取沉淀细胞重新悬浮,加入含成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、白血病抑制冈子的DMEM/F12培养基,体外培养获得人胚神经干细胞.30只大鼠通过结扎颈外动脉建立脑梗死模型,行走时向右侧转圈者为成功模型,剔除5只无上述明显症状的失败模型鼠.于造模后24 h,以前囟尾侧0.8 mm,中线右外侧1.2 mm为注射点,每只大鼠移植行BrdU标记的1×109 L-1人胚神经干细胞悬液10 μL,深度为硬脑膜下3.0～3.2 mm.主要观察指标:免疫组织化学及免疫荧光染色观察植入的人胚神经干细胞在脑梗死区的存活、迁移和分化状态.结果:人胚神经干细胞体外培养48 h后聚集成球悬浮生长,传三四代后加入血清诱导可见巢蛋白免疫荧光染色呈阳性,发出绿色荧光并聚集成球.BrdU阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后第2,4 周均可见其在脑梗化区存活片向周围迁移,且第4周时迁移的范围更广.移植后2周,皮质颗粒层和皮质下均见较多的BrdU阳性细胞,目BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞多于BrdU/胶质纤维酸件蛋白双阳性细胞;移植后4周脑梗死区BrdU阳性细胞数明显减少,主要存在于脉络丛和微血管中,且BrdU/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞.结论:人胚神经干细胞能存活于脑梗死的环境中,并逐渐分化成神经元或星形胶质细胞.移植后期脑实质内存活的神经干细胞明显减少,大量迁移到侧脑室脉络丛和脑表面微血管内,被内皮吞噬系统消化.     

神经干细胞移植对脑出血模型大鼠神经功能的影响

背景:外源性神经干细胞具有神经修复作用,可能对脑出血后的神经功能恢复起到一定的作用.目的:观察胎鼠神经干细胞的体外生长、分化及移植到脑出血大鼠后的存活、迁徙、分化情况,探讨神经干细胞对脑出血模型大鼠受损神经功能的修复作用.设计:完全随机分组设计,对照动物实验.单位:复旦大学附属华山医院神经外科材料:选用健康雄性成年SD大鼠18只为受体,体质量280～320 g,由中国科学院上海实验动物中心提供.实验用鼠抗BrdU为Neomarkers产品,鼠抗胶质纤维酸性蛋白和兔抗微管相关蛋白2为Chemicon产品.方法:实验于2006-02/12在复旦大学附属上海医学院解剖组胚实验室完成.从胎龄14 d的胎鼠海马中分离、培养、鉴定神经干细胞.16只受体SD大鼠被随机分为3组:对照组,PBS组和移植神经干细胞组.均通过尾状核内注射自体动脉血制作大鼠脑出血模型.移植NSC组在造模后30min在血肿腔周围四点分别移植浓度为2X1011L-1神经干细胞悬液5μ L;PBS组于相同时间点在脑内相同部位注射PBS:PBS和神经干细胞的移植方法同自体血的移植方法.对照组大鼠在造模后30 min只造成四点损伤,不注射任何物质.主要观察指标:在造模后立即,1,3,5,14,21.28 d采用前肢评分和转身评分对大鼠神经功能进行评估.大鼠于造模后28 d麻醉后取脑,并通过双标胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2、BrdU免疫组化来检测移植入脑的神经干细胞在体内的分化情况.结果:①神经功能评分:造模后5 d,各组差异无显著性意义(P＞0.05).造模后14～28 d,干细胞移植组较其他3组明显改善(P＜0.05).②脑组织切片双免疫组织学双标染色结果:干细胞移植组血肿周围凋亡细胞少于PBS组.受体大鼠脑组织切片显示有BrdU,微管相关蛋白2,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞,说明神经干细胞可以在宿主脑内存活、迁徙和分化,可以分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞.结论:神经干细胞移植可能通过分化为神经元样细胞和神经胶质细胞促进大鼠脑出血的神经功能恢复.     

脑室移植骨髓基质细胞对脑缺血损伤后神经功能恢复的影响

目的：采用脑室系统注入体外培养的骨髓基质细胞，观察其对神经功能损伤修复的影响及其在脑内的存活、迁移、分化情况。 方法：实验于2004-03／12在中国医科大学神经内科实验室完成。①将28只Wistar大鼠随机分为假手术组（n=6），模型组（n=8），梗死半球移植组（n=7），健侧半球移植组（n=7）。②除假手术组外，其他3组大鼠采取longa法制备大脑中动脉梗死模型，梗死后次日将培养的骨髓基质细胞悬液（10μL，约1&;#215;10^5个细胞）注入梗死半球移植组和健侧半球移植组大鼠侧脑室，模型组注入等量的磷酸盐缓冲液。③通过神经功能评分观察大鼠脑神经功能恢复情况，采用免疫组织化学方法观察移植入脑的骨髓基质细胞的存活、迁移及分化情况。 结果：28只大鼠全部进入结果分析。①神经功能缺损评价：假手术组动物无神经功能缺损。移植前各组梗死后大鼠神经功能损害评分差异无显著性（P〉0．05），移植2周后梗死大鼠神经功能均有不同程度恢复，但梗死半球移植组、健侧半球移植组评分明显低于模型组（6．7l&;#177;0．49，6．86&;#177;0．38，8．63&;#177;0．52，P〈0．05）。②大鼠脑病理改变：苏木精-伊红染色显示大脑中动脉梗死大鼠的缺血区脑组织稀疏，细胞数量明显减少且间隙增大。假手术组则无此表现，表明大鼠脑梗死模型制作成功。③脑组织切片免疫组织化学染色结果：可见来源于骨髓基质细胞的细胞（5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞经免疫组织化学染色呈暗棕色）在脑组织内存活，并且聚集于缺血梗死区域。在梗死半球移植组对侧半球脑组织内未发现5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞；在健侧半球移植组仅在移植损伤道周围发现少量5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞。应用免疫双标染色随机选取10个5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞区域计数发现大鼠脑梗死后14d约1．2％的5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞同时表达神经元标志蛋白特异性烯醇化酶，约6％的5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞同时表达神经胶质细胞标志蛋白神经胶质纤维酸性蛋白。 结论：经脑室移植的骨髓基质细胞对梗死后大鼠神经功能的恢复有明显促进作用。不同脑脊液途径移植的骨髓基质细胞对神经功能缺损的修复无明显差异。经脑室系统途径移植的骨髓基质细胞可在脑组织内存活，血管下间隙为骨髓基质细胞在脑组织内迁移提供途径。脑损伤是骨髓基质细胞迁移、分化的主要原因。     

双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化术

背景：碱性成纤维细胞生长因子可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和向神经细胞方向分化，并被认为是胶质细胞的分裂原。目的：以双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化情况，及其向神经元样细胞和神经胶质细胞分化的趋势。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-07/2006—03在中南大学实验动物中心实验室完成。材料：选用50只SD大鼠，按随机数字表法分为4组：假手术组（n=10），脑缺血，再灌注损伤模型组（n=10），骨髓间充质干细胞治疗组（n=15），碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗组（n=15）。方法：除假手术组外，其余3组制备局灶性脑缺血再灌注模型。分别将骨髓间充质干细胞或碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞通过静脉移植至实验性脑缺血大鼠体内，脑缺血再灌注损伤组大鼠注入相同体积的DMEM培养基。主要观察指标：应用5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白及5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双重荧光标记法观察移植细胞在脑内的存活和分化情况，比较各组大鼠脑缺血后的神经功能评分及脑梗死体积变化。结果：移植7d后，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞组大鼠脑内5-溴-2脱氧尿苷阳性细胞数、5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白双标阳性细胞数均高于骨髓间充质干细胞治疗组（P〈0．05），两组间5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双标阳性细胞数差异无显著性意义（P〉0．05）。再灌注7d后，静脉移植骨髓间充质干细胞和碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞均能改善脑缺血后大鼠的神经功能、减少脑梗死体积，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的作用明显优于骨髓间充质干细胞。结论：碱性成纤维细胞生长因子诱导的骨髓间充质干细胞静脉移植后可在脑内缺血区存活，并分化为比例更合适的神经元和神经胶质细胞，发挥神经修复作用。     

脑室移植骨髓基质细胞对脑缺血损伤后神经功能恢复的影响

目的:采用脑室系统注入体外培养的骨髓基质细胞,观察其对神经功能损伤修复的影响及其在脑内的存活、迁移、分化情况。方法:实验于2004-03/12在中国医科大学神经内科实验室完成。①将28只Wistar大鼠随机分为假手术组(n=6),模型组(n=8),梗死半球移植组(n=7),健侧半球移植组(n=7)。②除假手术组外,其他3组大鼠采取longa法制备大脑中动脉梗死模型,梗死后次日将培养的骨髓基质细胞悬液(10μL,约1×105个细胞)注入梗死半球移植组和健侧半球移植组大鼠侧脑室,模型组注入等量的磷酸盐缓冲液。③通过神经功能评分观察大鼠脑神经功能恢复情况,采用免疫组织化学方法观察移植入脑的骨髓基质细胞的存活、迁移及分化情况。结果:28只大鼠全部进入结果分析。①神经功能缺损评价:假手术组动物无神经功能缺损。移植前各组梗死后大鼠神经功能损害评分差异无显著性(P>0.05),移植2周后梗死大鼠神经功能均有不同程度恢复,但梗死半球移植组、健侧半球移植组评分明显低于模型组(6.71±0.49,6.86±0.38,8.63±0.52,P<0.05)。②大鼠脑病理改变:苏木精-伊红染色显示大脑中动脉梗死大鼠的缺血区脑组织稀疏,细胞数量明显减少且间隙增大。假手术组则无此表现,表明大鼠脑梗死模型制作成功。③脑组织切片免疫组织化学染色结果:可见来源于骨髓基质细胞的细胞(5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞经免疫组织化学染色呈暗棕色)在脑组织内存活,并且聚集于缺血梗死区域。在梗死半球移植组对侧半球脑组织内未发现5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞;在健侧半球移植组仅在移植损伤道周围发现少量5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞。应用免疫双标染色随机选取10个5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞区域计数发现大鼠脑梗死后14d约1.2%的5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞同时表达神经元标志蛋白特异性烯醇化酶,约6%的5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞同时表达神经胶质细胞标志蛋白神经胶质纤维酸性蛋白。结论:经脑室移植的骨髓基质细胞对梗死后大鼠神经功能的恢复有明显促进作用。不同脑脊液途径移植的骨髓基质细胞对神经功能缺损的修复无明显差异。经脑室系统途径移植的骨髓基质细胞可在脑组织内存活,血管下间隙为骨髓基质细胞在脑组织内迁移提供途径。脑损伤是骨髓基质细胞迁移、分化的主要原因。     

大鼠脑室膜管下区神经干细胞的贴壁培养及其分化特征

目的:探索大鼠脑室管膜下区神经干细胞的贴壁培养方法及其体外分化特性。方法:实验于2004-10/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科实验室进行。取出生24h内的SD大鼠,分离其室管膜下区神经干细胞,应用无血清Neurobasal培养基(含20g/LB27,20μg/L碱性成纤维生长因子、20μg/L表皮生长因子)进行贴壁培养。采用巢蛋白抗体鉴定培养细胞,以5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入法检测细胞增殖能力。体积分数为0.05胎牛血清诱导神经干细胞分化后,用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞标志物微管相关蛋白、胶质纤维酸性蛋白和2,3-环核苷酸磷酸二酯酶相应抗体检测神经干细胞分化情况。结果:①在细胞培养第4,5天即可见培养基中出现大量的由几十个细胞构成的结构紧密、大小不等的悬浮细胞球,即神经球。②神经球贴壁培养24～48h后形成片状细胞克隆,细胞呈梭形或多角形。③细胞一般七八天传代一次,经七八次传代,培养2个月左右,细胞进入生长停滞状态。④贴壁培养的细胞巢蛋白染色及5-溴脱氧尿嘧啶核苷染色均为阳性。在培养基中加入血清后,免疫细胞化学检测分化后细胞包括微管相关蛋白阳性、胶质纤维酸性蛋白阳性和2,3-环核苷酸磷酸二酯酶阳性细胞,巢蛋白表达均为阴性。结论:贴壁培养的神经干细胞在体外经多次传代培养后仍可保持较强的增殖能力,仍保持了其本身的特性,同时具有多分化潜能的特性,因此可以认为贴壁培养法可作为一种理想的神经干细胞的培养方法。     

嗅鞘细胞和神经干细胞联合移植阿尔茨海默病大鼠脑内的增殖和定向分化

背景:阿尔茨海默病大鼠脑内神经元减少,神经干细胞移植后增殖和向神经元分化能力有限。目的:观察联合移植嗅鞘细胞和神经干细胞在阿尔茨海默病大鼠脑内,嗅鞘细胞对神经干细胞的增殖和向胆碱能神经元分化的影响。方法:体外培养嗅鞘细胞和神经干细胞,移植前用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记神经干细胞。将生理盐水,神经干细胞和神经干细胞+嗅鞘细胞分别移植入阿尔茨海默病模型大鼠海马。移植7,14,21,28d后,进行大鼠脑组织切片免疫组织化学染色检测BrdU和ChAT阳性表达。结果与结论:联合移植组神经干细胞的增殖和分化情况明显优于其他两组,联合移植组BrdU阳性细胞数和ChAT阳性细胞数明显高于神经干细胞移植组和生理盐水组(P<0.01)。提示嗅鞘细胞能促进移植的神经干细胞在阿尔茨海默病大鼠脑内增殖和向胆碱能神经元的分化。     

电针对局灶性脑缺血成年大鼠内源性神经干细胞增殖的影响

目的：研究成年大鼠脑缺血后缺血脑区神经干细胞增殖情况及电针干预对其影响,探讨电针治疗缺血性脑损伤的作用机制。方法：采用开颅热凝闭法制作大脑中动脉闭阻（MCAO）模型,随机分为模型组与电针组,缺血后用溴脱氧尿苷（BrdU）腹腔注射标记增殖的神经细胞。选用“大椎”、“百会”行电针干预,采用BrdU免疫组化观察脑缺血后第3d、7d、14d与21d四个不同时相BrdU阳性细胞数量的变化情况。结果：脑缺血后不同时相缺血侧皮质、齿状回、纹状体和SVZ均有BrdU阳性细胞,其中第7d的阳性细胞数量增加最为显著（P〈0．01）;而且电针组在不同时相的细胞数量均较同时相模型组有明显的增加（P〈0．05或P〈0．01）。结论：缺血可激发相关脑区神经干细胞的增殖。电针可起到促进作用,推论这种作用可能是电针治疗脑缺血的重要作用机制之一。     

不同数量神经干细胞移植治疗实验性脑梗死

背景：研究已经确证脑梗死后进行神经干细胞移植可以促进动物神经功能恢复。目的：观察在大鼠实验性脑梗死后移植不同数量神经干细胞的效果,以期寻找出能有效促进神经功能恢复的最小移植数量。方法：提取Wistar胚胎鼠脑组织,体外培养神经干细胞。利用线栓法制作Wistar大鼠脑梗死模型。在大鼠脑梗死第7天,取培养第12天的神经干细胞,预标记BrdU后通过立体定向、微量注射泵方法,分别移植低6×105、中8×105、高10×105数量的神经干细胞,并设立假移植组,通过抓握牵引实验、斜板实验评价移植3个月时4组动物的行为学变化,以及BrdU、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白等免疫组织化学染色方法检测移植后神经干细胞与周围宿主整合及向神经元、神经元胶质细胞分化情况。结果与结论：神经干细胞移植后能在宿主脑内存活,并分化为神经元和胶质细胞促进功能恢复。移植神经干细胞后3个月时,各移植组与假移植组相比行为学评分均有显著性升高;中等数量移植组大鼠各项行为学评分明显优于低等数量移植组,而中、高等数量移植组两组之间差异没有显著性意义。提示脑梗死后移植不同数量神经干细胞可改善因脑梗死造成的功能障碍,8×105数量神经干细胞移植可以较少的数量发挥较好移植效果。     

功能性电刺激促进脑梗死大鼠肢体功能恢复的神经再生机制

目的:观察功能性电刺激(FES)对急性脑梗死大鼠神经功能和梗死侧室管膜下区(SVZ)神经干细胞(NSC)增殖的影响,探讨FES治疗脑梗死后神经功能恢复的可能机制.方法:将大脑中动脉阻塞(MCAO)模型大鼠随机分为FES治疗组、安慰电刺激组和假手术组,于造模后第2天开始进行FES治疗.采用改良神经功能损害评分(mNSS)评定大鼠神经功能,运用免疫荧光染色检测梗死侧SVZ区溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)及BrdU/巢蛋白(nestin)、BrdU/神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)双标阳性细胞表达数量.结果:各时间点FES治疗组大鼠mNSS评分显著低于安慰电刺激组和假手术组(P＜0.05).治疗后FES治疗组大鼠脑梗死侧SVZ区BrdU+细胞数较安慰电刺激组和假手术组明显增加(P＜0.05),但各组BrdU+/nestin+细胞数占BrdU+细胞数比率无显著性差异(P＞0.05).结论:FES能显著促进脑梗死大鼠神经功能恢复,其中一个重要机制是通过促进梗死侧SVZ区NSC的增殖.     

新生小鼠海马源性神经干细胞体外分离培养细胞群的增殖分化

目的：从新生小鼠脑海马部取材进行大量细胞克隆，对体外分离培养的神经干细胞进行鉴定．检测所分离细胞群的增殖分化特性。 方法：实验于2005-07／10在解放军第三军医大学解剖学教研室实验完成。选用清洁级昆明种新生24h内小鼠12只，利用神经于细胞条件培养基和单细胞克隆技术，从小鼠脑海马分离并体外培养神经干细胞。连续传代20代后，以免疫荧光细胞化学方法及免疫组织化学方法检测克隆细胞Nestin、BrdU、NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白的表达。 结果：实验选用昆明种新生24h内小鼠12只，全部进入结果分析。①神经干细胞的培养及分化：神经干细胞以神经球的方式悬浮生长。无明显突起，原代细胞接种后于第3天开始形成神经球。组成细胞球的细胞圆润饱满，活力状态好，绝大多数在1d内贴壁，并从细胞球边缘伸出突起，加入含血清的培养基后克隆球48h内即可见到明显的细胞分化，克隆球周围有细胞移出，7d后原有的细胞球消失。②神经干细胞的鉴定结果：原代克隆及其亚克隆行Nestin免疫荧光染色。证实克隆内细胞均为Nestin抗原阳性；细胞经BrdU标记后，行BrdU免疫细胞化学染色，部分细胞呈阳性。③神经干细胞的分化鉴定：对诱导分化的细胞分别行NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学检测，表达均呈阳性。 结论：成功分离并获得新生小鼠脑海马神经于细胞，该细胞可连续传代，具备多向分化潜能。     

人胚神经干细胞在大鼠脊髓内的分化研究

目的　人胚神经干细胞 (neuralstemcellsNSCs)经全反式维甲酸 (retinoicacid)预处理后移植入大鼠脊髓内 ,观察细胞的分化情况。方法　分离 10周左右流产人胚皮层组织中的神经干细胞 ,进行体外增殖 ,部分细胞在移植前 6d加入全反式维甲酸共培养。SD大鼠 3 0只 ,随机分为 2组 :实验组移植经维甲酸预处理后的NSCs ;对照组移植未经维甲酸预处理后的NSCs。移植后 5周取出脊髓 ,应用免疫组化技术检测Brd U标记的NSCs在大鼠脊髓内的生存和分化情况。结果　大鼠脊髓内可见大量Brd U阳性细胞 ,部分能够分裂增殖 ,向注射点远处迁移。实验组的NSCs能分化出NF、GFAP、Gal c阳性细胞 ;对照组的NSCs不能分化出NF阳性细胞。结论　人胚NSCs可在宿主脊髓内生存、分裂、迁移 ;经维甲酸预处理后的NSCs能分化成神经元和神经胶质细胞 ;人胚神经干细胞可作为 1种理想的移植材料 ,而具有重要临床应用价值