脑室移植骨髓基质细胞对脑缺血损伤后神经功能恢复的影响

目的:采用脑室系统注入体外培养的骨髓基质细胞,观察其对神经功能损伤修复的影响及其在脑内的存活、迁移、分化情况。方法:实验于2004-03/12在中国医科大学神经内科实验室完成。①将28只Wistar大鼠随机分为假手术组(n=6),模型组(n=8),梗死半球移植组(n=7),健侧半球移植组(n=7)。②除假手术组外,其他3组大鼠采取longa法制备大脑中动脉梗死模型,梗死后次日将培养的骨髓基质细胞悬液(10μL,约1×105个细胞)注入梗死半球移植组和健侧半球移植组大鼠侧脑室,模型组注入等量的磷酸盐缓冲液。③通过神经功能评分观察大鼠脑神经功能恢复情况,采用免疫组织化学方法观察移植入脑的骨髓基质细胞的存活、迁移及分化情况。结果:28只大鼠全部进入结果分析。①神经功能缺损评价:假手术组动物无神经功能缺损。移植前各组梗死后大鼠神经功能损害评分差异无显著性(P>0.05),移植2周后梗死大鼠神经功能均有不同程度恢复,但梗死半球移植组、健侧半球移植组评分明显低于模型组(6.71±0.49,6.86±0.38,8.63±0.52,P<0.05)。②大鼠脑病理改变:苏木精-伊红染色显示大脑中动脉梗死大鼠的缺血区脑组织稀疏,细胞数量明显减少且间隙增大。假手术组则无此表现,表明大鼠脑梗死模型制作成功。③脑组织切片免疫组织化学染色结果:可见来源于骨髓基质细胞的细胞(5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞经免疫组织化学染色呈暗棕色)在脑组织内存活,并且聚集于缺血梗死区域。在梗死半球移植组对侧半球脑组织内未发现5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞;在健侧半球移植组仅在移植损伤道周围发现少量5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞。应用免疫双标染色随机选取10个5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞区域计数发现大鼠脑梗死后14d约1.2%的5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞同时表达神经元标志蛋白特异性烯醇化酶,约6%的5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞同时表达神经胶质细胞标志蛋白神经胶质纤维酸性蛋白。结论:经脑室移植的骨髓基质细胞对梗死后大鼠神经功能的恢复有明显促进作用。不同脑脊液途径移植的骨髓基质细胞对神经功能缺损的修复无明显差异。经脑室系统途径移植的骨髓基质细胞可在脑组织内存活,血管下间隙为骨髓基质细胞在脑组织内迁移提供途径。脑损伤是骨髓基质细胞迁移、分化的主要原因。     

骨髓基质干细胞移植对脑梗死大鼠生长相关蛋白43表达的影响

背景:关于骨髓干细胞移植修复神经损伤的研究已有一些报道,但对细胞移植的时间、方式以及检测指标各有不同观点。目的:通过建立大鼠局灶性脑缺血模型,观察骨髓基质干细胞移植内源性轴突再生标志物生长相关蛋白43的表达变化。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-03/2007-10在武汉大学人民医院神经科实验室和丝宝药业有限公司博士后科研工作站完成。材料:选取清洁级成年SD大鼠60只,按随机数字表法分为3组,模型对照组、假手术组、干细胞移植组各20只。方法:另取2月龄SD大鼠4只用于制备骨髓基质细胞,骨髓基质干细胞悬液用5-溴脱氧尿嘧啶核苷法标记。假手术组大鼠麻醉后分离结扎右侧颈总动脉;其余大鼠制备右侧大脑中动脉缺血模型,造模后24h向干细胞移植组大鼠左侧侧脑室推注20μL5×105的骨髓基质干细胞,模型对照组推注等量磷酸盐缓冲液。主要观察指标:每组大鼠于移植前、移植后7,14,21和28d应用免疫组化法检测脑梗死灶周边区生长相关蛋白43的表达和移植细胞的存活及迁移情况,并记录神经功能缺损评分。结果:培养的骨髓基质干细胞经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记后移植到大鼠左侧侧脑室,可迁移到梗死灶周围,移植后7d在梗死灶能检测到5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性细胞,移植后14d增多达高峰,移植后28d逐渐减少并消失。免疫组化图像分析结果显示干细胞移植组大鼠在移植后7,14d脑梗死灶周边区生长相关蛋白43免疫活性显著高于模型对照组(P<0.05)。假手术组大鼠无神经损伤症状,神经功能评分均为0分;随时间的推移,模型对照组和干细胞移植组的神经功能评分逐渐降低,从移植后14d开始,干细胞移植组的神经功能评分都明显低于模型对照组(P<0.05)。结论:骨髓基质干细胞移植能上调局灶性脑缺血大鼠脑梗死灶周边区生长相关蛋白43的表达,与大鼠神经功能的恢复趋势相符。     

骨髓基质干细胞移植对脑梗死大鼠生长相关蛋白43表达的影响

背景:目前生长相关蛋白43作为构建中枢神经系统可塑性的基本物质,是研究神经生长及损伤修复的首选分子标记物.目的:通过建立大鼠局灶性脑缺血模型,观察骨髓基质干细胞移植内源性轴突再生标志物生长相关蛋白43的表达变化.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-03/2007-10在武汉大学人民医院神经科实验室和丝宝药业有限公司博士后科研工作站完成.材料:选取清洁级成年SD大鼠60只,按随机数字表法分为模型对照组、假手术组和干细胞移植组,每组20只.方法:另取2月龄SD大鼠4只用于制备骨髓基质干细胞,骨髓基质干细胞悬液用5-溴脱氧尿嘧啶核苷法标记.假手术组大鼠麻醉后分离结扎右侧颈内总动脉;其余大鼠制备右侧大脑中动脉缺血模型,造模后24 h向干细胞移植组大鼠左侧侧脑室推注20 μL5×105的骨髓基质干细胞,模型对照组推注等量磷酸盐缓冲液.主要观察指标:每组大鼠于移植前、移植后7,14,21,28 d应用免疫组织化学法检测脑梗死灶周边区生长相关蛋白43的表达和移植细胞的存活及迁移情况,并记录神经功能缺损评分.结果:培养的骨髓基质干细胞经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记后移植到大鼠左侧侧脑室,可迁移到梗死灶周围,移植后7 d在梗死灶能检测到5溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性细胞,移植后14 d增多达高峰,移植后28 d逐渐减少并消失.免疫组织化学图像分析结果显示干细胞移植组大鼠在移植后7,14 d脑梗死灶周边区生长相关蛋白43免疫活性高于模型对照组(P<0.05).假手术组大鼠无神经损伤症状,神经功能评分均为0分;随时间的推移,模型对照组和干细胞移植组动物的神经功能评分逐渐降低,从移植后14 d开始,干细胞移植组的神经功能评分均明显低于模型对照组(P<0.05).结论:骨髓基质干细胞移植能上调局灶性脑缺血大鼠脑梗死灶周边区生长相关蛋白43的表达,与大鼠神经功能的恢复趋势相符.     

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点及可行性

背景：骨髓干细胞移植成功的定性指标是标记移植的细胞至组织器官后存活并发挥了正常的功能。目前细胞学研究方面采用的标记方法有酶联标记、氚胸腺嘧啶核苷标记、荧光标记和5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记等。目的：观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点。设计：单一样本观察。单位：华北煤炭医学院附属医院心胸外科。材料：实验于2003-07／2004-12在华北煤炭医学院中心实验室完成。取月龄3个月的日本大耳白兔6只，雌雄不限，体质量（3．00&;#177;0．25）kg。方法：①利用密度为1073g／L的Percoll分离骨髓的单核细胞，以含体积分数为0．1的胎牛血清的低糖Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基培养与扩增间充质干细胞，纯度可达95％左右。②用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞24，48，72，96h后的检测标记率（标记组）；阴性对照为未经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞；空白对照为以磷酸盐缓冲液或正常鼠血清替代一抗。主要观察指标：①3组各检测200个细胞，并在不同时间点观察。②5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的骨髓间充质干细胞免疫组织化学染色结果及细胞计数结果：结果：①标记组均见5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞，5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性反应物位于细胞核，呈棕色、颗粒状或弥漫性分布：对照组未见阳性细胞。②标记组24，48，72，96h5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞的数目分别为48&;#177;2，100&;#177;4，173&;#177;2，178&;#177;3．随着标记时间的延长，标记率逐渐增高，标记72h后标记率在85％以上。③阴性对照和空白对照组各时间点均为0。结论：①用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的最佳时间是72h。②标记后检测的敏感性好．在低倍镜中亦可见．适合于大块组织的定量研究。③结果表明5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞是可行的。     

亚低温处理大鼠脑缺血再灌注损伤后神经干细胞增殖的动态变化

目的 探讨亚低温处理大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血侧脑组织神经干细胞（NSC）增殖的动态变化。方法 采用大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，大脑中动脉阻塞2 h，再灌注损伤3，7，11，14，18，28 d，用免疫组织化学方法分别检测假手术组、对照组和亚低温组缺血侧脑组织5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）阳性细胞数。结果 假手术组缺血侧脑组织存在少量BrdU阳性细胞，亚低温组在缺血再灌注损伤3，7，11，14，18，28 d时缺血侧脑组织Brdu阳性细胞数均明显多于对照组，且亚低温组缺血侧脑组织NSC的增殖高峰期茹对照组延长．结论 亚低温促进大鼠腩缺血再灌注损伤后缺血侧脑组织NSC的进一步增强.     

人胚神经干细胞植入脑出血大鼠的存活和分化状态（英文）

背景：研究证实外源性神经干细胞能修复神经,促进脑出血后神经功能障碍的恢复。然而,脑出血后局部内环境对移植神经干细胞存活分化的影响是一个复杂多变的过程。目的：观察人胚神经干细胞植入脑出血大鼠脑内的存活和分化状态。设计、时间及地点：免疫组织化学水平的开放性实验,于2007-05/2008-04在泸州医学院附属医院分子生物实验室完成。材料：纳入40只SD雌性大鼠,由中国医学科学院实验动物研究所提供;8周龄流产胚胎大脑由德阳市人民医院医院妇产科提供。方法：取8周龄流产人胚胎大脑皮质细胞,体外培养获得人胚神经干细胞。通过注射自体动脉血到尾状核制作大鼠脑出血模型,出血后2d将标有5＇-溴脱氧尿嘧啶的人胚神经干细胞悬液移植到血肿腔周围的4点,1,2周后处死大鼠,相邻脑组织切片行5＇-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2和5＇-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染。主要观察指标：应用免疫组织化学及免疫荧光染色方法观察移植入脑出血大鼠脑内的人胚神经干细胞存活、分化状态和迁徙情况。结果：5＇-溴脱氧尿嘧啶阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后1周及2周均可见其存活并向周围迁移,且移植后2周迁移的范围广。移植后1周,脑组织切片见5＇-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2和5＇-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞,且5＇-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2双阳性细胞多于5＇-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞。移植后2周,5＇-溴脱氧尿嘧啶阳性细胞数明显减少,在脉络丛和微血管中可见,且5＇-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于5＇-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2双阳性细胞。结论：人胚神经干细胞移植入脑出血大鼠脑内能够存活,移植后逐渐分化为神经细胞和星形胶质细胞。     

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点及可行性

背景:骨髓干细胞移植成功的定性指标是标记移植的细胞至组织器官后存活并发挥了正常的功能。目前细胞学研究方面采用的标记方法有酶联标记、氚胸腺嘧啶核苷标记、荧光标记和5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记等。目的:观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点。设计:单一样本观察。单位:华北煤炭医学院附属医院心胸外科。材料:实验于2003-07/2004-12在华北煤炭医学院中心实验室完成。取月龄3个月的日本大耳白兔6只,雌雄不限,体质量(3.00±0.25)kg。方法:①利用密度为1073g/L的Percoll分离骨髓的单核细胞,以含体积分数为0.1的胎牛血清的低糖Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基培养与扩增间充质干细胞,纯度可达95%左右。②用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞24,48,72,96h后的检测标记率(标记组);阴性对照为未经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞;空白对照为以磷酸盐缓冲液或正常鼠血清替代一抗。主要观察指标:①3组各检测200个细胞,并在不同时间点观察。②5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的骨髓间充质干细胞免疫组织化学染色结果及细胞计数结果。结果:①标记组均见5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞,5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性反应物位于细胞核,呈棕色、颗粒状或弥漫性分布;对照组未见阳性细胞。②标记组24,48,72,96h5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞的数目分别为48±2,100±4,173±2,178±3,随着标记时间的延长,标记率逐渐增高,标记72h后标记率在85%以上。③阴性对照和空白对照组各时间点均为0。结论:①用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的最佳时间是72h。②标记后检测的敏感性好,在低倍镜中亦可见,适合于大块组织的定量研究。③结果表明5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞是可行的。     

人胚神经干细胞植入脑出血大鼠的存活和分化状态

背景:研究证实外源性神经干细胞能修复神经,促进脑出血后神经功能障碍的恢复.然而,脑出血后局部内环境对移植神经干细胞存活分化的影响是一个复杂多变的过程.目的:观察人胚神经干细胞植入脑出血大鼠脑内的存活和分化状态.设计、时间及地点:免疫组织化学水平的开放性实验,于2007 05/2008 04在泸州医学院附属医院分子生物实验室完成.材料:纳入40只SD雌性大鼠,由中国医学科学院实验动物研究所提供;8周龄流产胚胎大脑由德阳市人民医院医院妇产科提供.方法:取8周龄流产人胚胎大脑皮质细胞,体外培养获得人胚神经干细胞.通过注射自体动脉血到尾状核制作大鼠脑出血模型,出血后2 d将标有5'-溴脱氧尿嘧啶的人胚神经干细胞悬液移植到血肿腔周围的4点,1,2周后处死大鼠,相邻脑组织切片行5'-溴脱氧尿嘧啶,微管相关蛋白2和5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染.主要观察指标:应用免疫组织化学及免疫荧光染色方法观察移植入脑出血大鼠脑内的人胚神经干细胞存活、分化状态和迁徙情况.结果:5'-溴脱氧尿嘧啶阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后1周及2周均可见其存活并向周围迁移,且移植后2周迁移的范围广.移植后1周,脑组织切片见5'-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2和5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞,且5' -溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2双阳性细胞多于5' -溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞.移植后2周,5' -溴脱氧尿嘧啶阳性细胞数明显减少,在脉络丛和微血管中可见,且5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于5'-溴脱氧尿嘧啶,微管相关蛋白2双阳性细胞.结论:人胚神经干细胞移植入脑出血大鼠脑内能够存活,移植后逐渐分化为神经细胞和星形胶质细胞.     

骨髓间充质干细胞移植对永久性大脑中动脉阻塞大鼠生长相关蛋白43及脑梗死体积的影响

背景:大量实验表明骨髓间充质干细胞植入缺缸大鼠脑内能够通过血脑屏障在脑中成活并迁移,可部分转变为神经元,并能促进多种神经营养因子分泌,明显改善神经功能缺损,较神经保护剂具有更长的治疗时间窗.目的:观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠永久性大脑中动脉阻塞后内源性轴突再生标志物生长相关蛋白43的表达及脑梗死体积的影响.方法:将成年SD大鼠按随机数字表法分为模犁对照组、假手术组、干细胞移植组.另取成年SD大鼠4只制备骨髓间充质干细胞,并以5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记.假手术组分离结扎右侧颈总动脉:其余大鼠制备永久性右侧大脑中动脉缺血模型,造模后,干细胞移植组移植骨髓间充质干细胞,模型对照组推注等量磷酸盐缓冲液.于移植前、移植后7,14,21,28d进行神经功能缺损评分,应用免疫组织化学法检测脑梗死灶周边区生长相关蛋白43表达.结果与结论:干细胞移植组移植后7d在梗死灶能检测到5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性细胞,移植后14 d增多达高峰,移植后28 d逐渐减少并消失;移植后7,14 d脑梗死灶周边区生长相关蛋白43免疫活性显著高于模型对照组(P<0.05).假手术组大鼠无神经损伤症状,神经功能评分均为0分;随时间推移,模犁对照组和干细胞移植组神经功能评分逐渐降低,从移植后14 d开始,干细胞移植组神经功能评分明显低于模型对照组(P<0.05).与模型对照组相比,干细胞移植组脑梗死体积均显著减小(P<0.05).结果显示,骨髓间充质干细胞移植能上调局灶性脑缺血大鼠脑梗死灶周边区生长相关蛋白43的表达,并显著减小脑梗死体积.     

粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞原位移植治疗大鼠缺血性脑梗死

背景：粒细胞集落刺激因子是骨髓造血干细胞的强有力的动员剂，已经证实粒细胞集落刺激因子具有同时动员造血干细胞和间充质干细胞的能力。 目的：观察应用粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞进入脑梗死部位，对缺血性脑梗死大鼠的治疗作用。 设计：随机分组设计、动物实验。 单位：中山大学干细胞与组织工程中心。 材料：实验于2004-09／2005-01在中山大学（北校区）动物实验部和中山大学干细胞与组织工程中心完成。选择雄性Wistar大鼠200只，随机分为自体骨髓干细胞移植组和对照组，每组100只。 方法：两组均用线栓法制作大鼠缺血脑梗死模型。自体骨髓干细胞移植组于复制缺血脑梗死模型后lh腹腔注射重组人粒细胞集落刺激因子（60μg／kg）。对照组于术后lh腹腔注射等量生理盐水。①术前及术后24h，48h，1周测各组大鼠的体质量，计算体质量减轻率；并对大鼠进行神经病学分级。分级标准：0级：正常；1级：对侧前肢屈曲2级：提尾时，对侧前肢抓力减弱；3级：自主运动无方向性，提尾时向对侧旋转．4级：自主运动时，向对侧旋转。②将两组大鼠各取15只，分别于术后24，48h和l周开颅取脑，用2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色测定脑梗死体积、苏木精一伊红染色检查脑组织病理变化、免疫组织化学检测CD34阳性细胞浸润情况。 主要观察指标：体质量减轻率，神经病学分级，脑梗死体积，脑组织病理变化，CD34阳性细胞浸润情况。 结果：纳入动物200只，造模成功180只，造模后1-7d死亡48只，存活132只，随机选择120只进入结果分析。①体质量测定、神经病学分级：术后24h，48h两组大鼠体质量减轻率比较差异无显著性（P〈0．05）；术后l周自体骨髓干细胞移植组体质量减轻率显著低于对照组，差异显著[分别为（10．5&;#177;8．2）％，（17．8&;#177;7．1）％，P〈0．05]。自体骨髓干细胞移植组的神经损伤与对照组比较差异无显著性。②梗死灶体积：对照组梗死灶体积和梗死灶体积占全脑体积百分比高于自体骨髓干细胞移植组，差异显著[分别为（251．69&;#177;52．77），（145.72&;#177;28．05）mm^3，（17.00&;#177;2.69）%，（9.90&;#177;1.62）％，P〈0．01]。③病理学改变：术后24h，两组大鼠均出现典型的脑缺血梗死病理变化，自体骨髓干细胞移植组大鼠的梗死区可见少量单个核细胞，而对照组则无。术后48h神经细胞大片消失，胶质细胞变性，自体骨髓干细胞移植组有大量单个核细胞浸润，对照组相对较少。l周后对照组梗死区脑组织液化变软，坏死灶周围可见较多的单核和淋巴细胞浸澜；自体骨髓干细胞移植组大鼠部分坏死灶被新生毛细血管和胶质细胞增生修复，炎性细胞浸润不明显。④免疫组织化学检查：术后24h，自体骨髓干细胞移植组大鼠的手术侧脑组织中检测到CD34阳性的单个核细胞，对侧脑组织及对照组大鼠的脑组织无此类细胞。术后48h，自体骨髓干细胞移植组手术侧脑组织除有CD34阳性单个核细胞浸润，还发现呈锥形并且带有突起的CD34阳性细胞。对侧脑组织、对照组大鼠的脑组织均未见CD34阳性细胞。 结论：粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞进行自体干细胞原位移植治疗，可以减轻大鼠缺血性脑梗死程度，减少脑梗死体积。