Survivin反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞的抑制作用

我们以骨肉瘤OS 73 2细胞为对象 ,在明确其高表达Survivin基础上 ,尝试通过合成靶向Survivin的反义寡核苷酸(ASODN)转染OS 73 2细胞 ,以封闭Sur vivin表达 ,探讨ASODN对骨肉瘤细胞凋亡 /增殖的影响及其对化疗药物的促进作用。一、材料与方法1.材料 :人骨肉瘤细胞株OS 73 2购自北京积水潭医院骨科研究所。针对Survivin基因翻译起始密码区 ,设计合成ASODN (上海生工公司 ) ,序列为 5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG 3′ ,并设正义 (senseoligonucleotide ,SODN )对照 ,序列为 5′GTTCCTCGACCTTCCGACCC3′ ,两组寡核苷酸均…     

DJ-1 shRNA靶向逆转人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADM的耐药性

目的探讨干扰癌基因DJ-1表达对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM多药耐药性(multi-drug resistence,MDR)的影响。方法将构建的DJ-1 shRNA真核表达载体,用脂质体转染至人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM;用RT-PCR和Western blot法分别检测细胞MDR 1 mRNA和P-糖蛋白(P-glycopro-tein,P-gp)的表达;MTT法检测细胞对化疗药物的敏感性。结果 DJ-1 shRNA靶向干预MCF-7/ADM细胞DJ-1表达后,DJ-1 shRNA组细胞MDR 1 mRNA和P-gp表达水平较空白与阴性对照组明显下降(P0.0 1);细胞内Adriamycin浓度明显增加;细胞对Adriamycin的敏感性增强2.6 8倍。结论 DJ-1shRNA可降低乳腺癌MCF-7/ADM细胞的MDR,为研究逆转乳腺癌化疗耐药提供了新方法。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞株侵袭力的抑制作用

目的　探讨乙酰肝素酶 (HPSE)反义寡脱氧核苷酸 (AS ODN )对人乳腺癌细胞株侵袭力的抑制活性。方法　设计合成分别互补于HPSEmRNA 5 '未翻译区和起始密码区的AS ODN1、AS ODN2及相应对照NS ODN1、NS ODN 2 ,在脂质体介导下以 2 5 0nmol/L终浓度转染人乳腺癌MDA43 5细胞 ,以RT PCR和Westernblot分别检测HPSEmRNA和蛋白表达 ,以基质凝胶侵袭实验检测细胞侵袭力。结果　AS ODN 2组的HPSEmRNA相对表达量、蛋白表达量和侵袭细胞数(0 .62± 0 .0 4、12 .70± 1.70、61.0 0± 9.0 0 )与脂质体对照组 (1.60± 0 .0 4、3 6.2 0± 2 .10、178.0 0±17.0 0 )和NS ODN2组 (1.48± 0 .0 3、3 5 .5 0± 2 .3 0、174.0 0± 2 0 .0 0 )相比较均显著降低 (P <0 .0 1) ;而AS ODN 1组与脂质体对照组和NS ODN1组相比较差异均无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　互补于起始密码区的HPSEAS ODN可通过下调HPSE表达显著抑制人乳腺癌细胞株MDA43 5的侵袭力。     

Ad-p53对乳腺癌阿霉素耐药细胞株多药耐药基因1/P-gp表达的影响

目的 观察腺病毒介导的p53基因(Ad-p53)逆转乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/Adr多药耐药作用及其对MDR1 mRNA/P-gP表达的影响.方法 以人乳腺癌MCF-7细胞及其阿霉素耐药株MCF-7/Adr为实验对象,以50 MOI Ad-p53感染MCF-7/Adr细胞,CCK-8法观察Ad-p53对多药耐药的逆转作用,实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测MDR1 mRNA变化,免疫荧光组织化学及Western blot检测P-gP蛋白表达的变化.结果 50 MOI Ad-p53能使MCF-7/Adr细胞阿霉素IC50由(4.54±0.91)mg/L降到(0.26±0.11)mg/L,逆转耐药倍数为18.1倍(P《0.01);MDR1 mRNA相对表达量由1.32下降至0.85(P《0.01),P-gP蛋白表达量亦下降.结论 Ad-p53具有对人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/Adr多药耐药的逆转作用,其可下调MDR1 mR-NA/P-gP表达.     

hTR反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞Panc-1生物特性及端粒酶活性的影响

端粒酶持续激活导致恶性肿瘤细胞获得无限增殖能力 ,人端粒酶RNA组分(hTR )对端粒酶活性维持具有重要作用 ,破坏端粒酶RNA组分的模板功能 ,即可抑制端粒酶活性[1] 。我们针对hTR模板区设计合成反义寡核苷酸 (A SODN) ,观察其对Panc 1端粒酶活性及细胞生长的影响 ,为胰腺癌基因治疗提供新的实验依据。一、材料与方法1.核苷酸设计与合成 :根据hTR模板区序列设计一条互补于起始密码区的反义片段 ,并随机设计合成一段正义寡核苷酸 (SODN)序列作为对照 ,均由上海生工公司进行合成。2 .细胞培养与转染 :Panc 1细胞株购自中国协和医科大…     

核因子-кB/p65反义寡核苷酸对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的 观察核因子(NF)-кB/p65反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计合成NF-кB/p65 ASODN,按照0.05、0.1、0.2.0.3、0.4、0.5 μmol/L不同浓度转染胃癌SGC-7901细胞株,设正义寡核苷酸(SODN)、错义寡核苷酸(MSODN)和空白对照组进行比较.利用荧光染色观察转染效果,噻唑蓝(M1T)比色法检测细胞生长抑制率(IR),流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡情况.结果 与SODN、MSODN及对照组比较,ASODN组细胞增殖明显受到抑制(P<0.05),72 hIR为58.3%,且这种抑制作用呈浓度依赖性.FCM结果显示ASODN可诱导细胞的凋亡.结论 NF-кB ASODN能抑制胃癌细胞生长,其机制与ASODN诱导的细胞凋亡有关,NF-кB可作为胃癌治疗的新靶点.     

黄芪甲苷对耐药肝癌细胞株HepG2/GCS逆转作用的研究

近年来,葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase,GCS)在肿瘤多药耐药中的作用逐渐受到重视.我们前期实验已证实GCS基因参与了肝癌细胞HepG2多药耐药的发生,通过基因转染使细胞内GCS基因高表达的肝癌细胞株HepG2/GCS具有多药耐药性[1].本实验观察黄芪甲苷(astragalosideⅣ)对肝癌耐药细胞株HepG2/GCS耐药性的影响,进一步探讨其逆转肿瘤多药耐药的作用机制.     

腺病毒介导的野生型p53基因逆转乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A耐药性的研究

目的 探讨野生型p53基因对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A耐药性的逆转作用及其机制.方法 选用含野生型p53基因的重组腺病毒载体,转染乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A,绘制细胞生长曲线,利用流式细胞计数仪检测细胞周期分布及凋亡分析、TUNEL法检测细胞凋亡的发生,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot印迹转移检测p53基因的表达情况.结果 野生型p53基因转染MCF-7/A后的24、48 h均检测到p53基因的表达,并显著抑制MCF-7/A细胞的增殖;细胞周期发生改变,转染后的MCF-7/A的G0%G1期DNA百分含量(76.22%)明显高于对照组(43.64%,P<0.05),凋亡率(10.76%)与对照组(1.48%)之间差异有统计学意义(P<0.05).结论 重组腺病毒介导的野生型p53基因对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A的耐药性有明显的逆转作用,其机制可能是引起明显的G1期阻滞并诱导细胞凋亡.     

胆囊癌细胞中转染Survivin和bcl-2反义寡核苷酸后凋亡作用的对比研究

目的:比较转染Survivin、bcl -2反义寡核苷酸(ASODN)对胆囊癌细胞系 GBC SD的凋亡促进作用。方法:设计并合成特异性靶向 Survivin及 bcl- 2 的 ASODN。胆囊癌细胞分为 5 组:空白对照组、Survivin ASODN转染组、bcl- 2 ASODN转染组、Survivin SODN转染组和bcl -2 SODN转染组,转染24h后,采用逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)检测Survivin基因、bcl- 2基因表达的变化,流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测 ASODN对细胞的生长抑制率。结果:转染 Survivin及bcl 2 ASODN后,胆囊癌细胞内Survivin基因表达下调 47.8%,bcl- 2 基因表达下调 52.4%;细胞凋亡率分别为(11.4±3. 9)%、(7. 3±3. 2)%,与对照组差异有统计学意义(P< 0. 01)。而转染 SurvivinASODN组及bc1 2ASODN组相比差异也有显著性(P<0.05)。两转染组相对于空白对照组的生长抑制率分别为54.3%、41.6%。结论:Survivin和bcl 2反义寡核苷酸均可有效的抑制Survivin及bc1- 2基因的表达,从而诱导胆囊癌细胞的凋亡,两者相比,Survivin反义寡核苷酸可更为有效地诱导胆囊癌细胞的凋亡。     

siRNA特异性靶向沉默Livin基因对人乳腺癌MCF－7多药耐药细胞耐药性的研究

目的研究siRNA特异性靶向沉默Livin基因对人乳腺癌MCF－7多药耐药细胞耐药性的影响。 方法采用ADM低浓度梯度递增结合大剂量间歇诱导方法建立5－FU诱导的多药耐药细胞系,采用ATP生物荧光肿瘤体外药物检测技术(ATP－TCA)法检测细胞耐药性,采用免疫组织化学方法检测Livin蛋白在MCF－7耐药细胞株系中的表达情况,采用Livin SiRNA联合表柔吡星、5－氟尿嘧啶、多西他赛、健择诱导乳腺癌MDR细胞的凋亡。采用SPSS 20.0处理数据,耐药情况、细胞的凋亡情况用( ±s)表示,采用t检验,当P<0.05时差异具有统计学意义。 结果结果显示,MCF－7多药耐药细胞存在多药耐药问题;联合组MCF－7增敏(19.48±12.00) μM、MCF－7/MDR增敏(35.62±2.37) μM,与转染组与加药组对比,数据差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论siRNA特异性靶向沉默Livin基因可增强人乳腺癌MCF－7多药耐药细胞的敏感性,提高细胞凋亡率。     

乙型肝炎病毒X蛋白上调肝癌多药耐药相关基因表达的研究

目的　研究乙型肝炎病毒 X蛋白 (HBX)对肝癌耐药相关基因 MDRI,MRP1 ,MRP2 3,MRP3,L RP的影响从而探讨 HBX基因影响肝癌多药耐药性状的分子机制。方法　应用脂质体介导技术对人肝癌细胞株 Hep G2瞬时转染 HBX基因 ,然后用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)和 Westernblot技术分别检测转染后多药耐药相关基因和蛋白水平的表达情况。再使用 MTT检测阿霉素及丝裂霉素诱导后细胞存活率的变化。结果　转染前后相比 ,转染 HBX基因的 Hep G2细胞多药耐药相关基因和蛋白表达水平比转染前均明显上调 (P<0 .0 5 )转染后 PRP1基因表达量与转染前比为 3.1 1 ,PRP2为 1 .6 9,L RP3为 1 .4 6 ,MDR1为 3.6 4 ,L RP为 1 .90。 Westernblot显示转染后 L DR1蛋白水平上升 1 .1 0倍 ,MRP1蛋白上升 1 .2 8倍 ,L RP蛋白上升 1 .0 8倍。MTT结果显示阿霉素和丝裂霉素 IC50 转染组明显高于对照组。结论　乙型肝炎病毒 X蛋白可能促进肝癌多药耐药的产生     

转染ERα基因对MDA-MB-231乳腺癌细胞白细胞介素-8表达的影响

目的 通过转染GFP-C1-ERα质粒建立稳定表达ERα的MDA-MB-23l细胞株,观察ERα对该细胞株白细胞介素(IL)-8表达的影响.方法 pEGFP-C1-ERα质粒经酶切和测序后转染MDA-MB-231细胞,使用G418筛选出稳定表达的克隆并鉴定.使用荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别测定稳定转染ERα的MDA-MB-231细胞、MDA-MB-231细胞及MCF-7细胞的IL-8mRNA的表达,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定细胞上清液IL-8的浓度.结果 成功建立ERα阳性表达的MDA-MB-231细胞株,转染ERα的细胞株IL-8 mRNA的合成(105±16)ng/L明显低于MDA-MB-231细胞(195±32)ng/L(P<0.05),但仍然高于MCF-7细胞(32±4)ng/L(P<0.05),转染后细胞上清液IL-8浓度较未转染细胞明显降低,分别为(3499±312)ng/L和(6788±427)ng/L(P<0.05),但仍然高于MCF-7细胞(1846±44)ng/L(P<0.05).结论 稳定转染ERα基因抑制了MDA-MB-231细胞的IL-8的合成和分泌.     

脂质体转染survivin反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞凋亡的影响

目的探讨survivin反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)对人胰腺癌细胞PANC-1增殖的影响。方法设计并合成特异性靶向ASODN及正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,SODN)。ASODN经FAM标记,以阳离子脂质体为载体转染至体外培养的PANC-1细胞中(ASODN组),另设空白对照组(正常培养的细胞)、脂质体空转染组(脂质体转染的为正常的培养基)及SODN组作为对照组。采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测转染率,依次筛选最佳细胞接种数量、ASODN浓度和脂质体的量;荧光显微镜观察转染后的细胞;MTT法测定转染后细胞的抑制率;透射电镜观察转染后细胞的超微结构变化;吖叮橙(AO)与溴化乙啶(EB)染色观察转染后细胞凋亡的形态学改变;DNA凝胶电泳观察转染后细胞凋亡情况;FCM测转染后细胞凋亡率及细胞周期;免疫组织化学技术检测转染后survivin蛋白的表达。结果①ASODN浓度为50、100、150、200、250、400、600及800 nmol/L时,转染率分别为31.9%、37.4%、41.4%、52.6%、24.2%、11.4%、16.1%和15.5%;接种细胞数量为2×104、2×105及2×106个/孔时,转染率分别为12.0%、50.8%和11.2%;转染所用的脂质体量为2、3及4μl时,转染率分别为58.8%、34.0%和23.6%。②转染ASODN后荧光显微镜发现转染后细胞之间空隙加大,形态变圆,贴壁细胞生长较少,部分漂浮于培养液中。③ASODN组24、36及48 h后细胞抑制率明显高于各对照组(P0.05),随着时间延长,细胞抑制率增高(P0.05)。④ASODN组电泳图上凋亡细胞呈明显的"梯状"条带。⑤AO与EB染色观察ASODN组细胞出现凋亡的形态学改变,其核染色质均高度聚集或核染色呈新月形聚集于核膜一边,核仁消失。⑥ASODN组细胞凋亡率为(38.10±3.4)%,明显高于SODN组的(4.16±1.7)%(P0.05)。⑦ASODN组细胞周期阻滞于G2/M期。⑧转染后ASODN组survivin蛋白表达明显低于各对照组(P0.05)。结论 survivin ASODN转染至胰腺癌细胞最佳转染条件为接种细胞数量为2×105个/孔,ASODN的浓度为200 nmol/L,脂质体的量为2μl;survivin ASODN能明显下调survivin蛋白的表达,抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。     

小干扰RNA沉默多药耐药相关蛋白基因2对人肝癌细胞HepG2多药耐药的逆转作用

目的 检测小干扰RNA(siRNA)对肝癌耐药细胞株HepG2/阿霉素(ADM)多药耐药相关蛋白基因2(MRP2)及其蛋白产物的抑制作用,观察对多药耐药性的影响.方法 使用浓度梯度法制作HepG2耐ADM细胞株(HepG2/ADM),ADM浓度从0.1～2.0 m/L:设计合成针对MRP2的siRNA小片段,转染HepG2/ADM耐药细胞,24 h后通过实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot检测siRNA对MRP2基因mRNA和蛋白的抑制效果;噻唑蓝(MTT)比色法观察抑制MRP2基因表达后,HepG2/ADM细胞对化疗药物的敏感性变化,并计算各药物的半数抑制浓度(IC50).结果 HepG2/ADM对ADM、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、长春新碱和奥沙利铂的IC50值分别为0.3204、3.8002、0.2014和0.1221;siRNA明显抑制了HepG2/ADM细胞MRP2基因mRNA和蛋白的表达(P＜0.05);转染MRP2-siRNA后,HepG2/ADM细胞对ADM、5-Fu、长春新碱和奥沙利铂的IC50值明显减小,分别为0.1023、1.4417、0.0452和0.0268.结论 用siRNA沉默MRP2基因能够逆转HepG2/ADM细胞对化疗药物的耐药性,MRP2基因与HepG2/ADM肝癌细胞的多药耐药性相关,可通过沉默MRP2基因提高耐药细胞对化疗药物的敏感性.     

结缔组织生长因子介导转化生长因子β1促进瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的 了解结缔组织生长因子(CTGF)介导TGF-β1发挥促人增生性瘢痕Fb(HSFb)转分化的作用.方法 体外培养人HSFb,取5份细胞标本分别加入不同浓度TGF-β1(0、2.5、5.0、7.5、10.0 ng/mL),作用48 h后待测.余下标本分为:空白对照组;CTGF刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人CTGF;TGF-β1刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1;CTGF反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染组,细胞转染CTGF ASODN后,加入培养液;CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组,细胞转染CTGF ASODN后2 h,加人含终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1的培养液.蛋白质印迹法分析不同浓度TGF-β1刺激对细胞CTGF表达的影响,比较各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;流式细胞仪检测α-SMA阳性细胞百分率.结果 TGF-β1浓度为10.0 ng/mL时,CTGF的表达明显高于未受刺激的细胞(P<0.05).CTGF刺激组与TGF-β1刺激组α-SMA表达明显高于空白对照组(P<0.01).CTGF ASODN转染组以及CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组α-SMA表达与空白对照组接近(P>0.05).上述各组细胞α-SMA阳性细胞百分率依次为(10.8±2.8)%、(29.1±4.0)%、(28.7±4.8)%、(10.7±2.3)%、(14.3±2.9)%,统计学分析结果类似于α-SMA表达.结论 CTGF是TGF-β1发挥促人HSFb转分化的重要下游效应分子之一.     

c-Src在TAM治疗耐药的人乳腺癌MCF-7细胞株中的表达及其意义

目的:探讨c-Src在乳腺癌三苯氧胺(TAM)中耐药的表达及意义.方法:用Western blot法检测TAM治疗耐药与敏感的两种人乳腺癌MCF-7细胞中c-Src的表达及其磷酸化水平;用c-Src阻滞剂PP2处理两种细胞后,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)及吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色法检测细胞凋亡情况.结果:与TAM敏感MCF-7细胞比较,TAM耐药MCF-7细胞c-Src的表达量及其磷酸化水平均明显增高;PP2处理后,TAM敏感MCF-7细胞的富集指数(EF)及细胞凋亡率高于TAM耐药MCF-7细胞(均P＜0.05).结论:c-Src在TAM治疗耐药的人乳腺癌MCF-7细胞株中处于高表达及高活性状态,并可能参与乳腺癌内分泌治疗耐药的机制.     

多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1与胶质瘤细胞株化疗敏感性之间的关系

目的 探讨多亮氨酸重复区免疫球蛋向样蛋白1(LRIG1)与胶质瘤细胞化疗敏感性的相关性.方法 替莫唑胺诱导构建多药耐药细胞株U251/TR,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测该细胞株的多药耐药性,逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR)法检测LRIG1在U251和U251/TR中的表达变化.转染LRIG1质粒体进入多药耐药细胞株,检测其对化疗药物敏感性变化.结果 成功构建多药耐药细胞株U251/TR,替莫唑胺、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷、硫酸长春新碱对U251的抑制率分别为:(19.30±0.04)％、(39.90±0.13)％、(28.10±0.09)％、(66.20±0.02)％、(26.30±0.11)％,而对U251/TR的抑制率分别为:(3.20±0.03)％、(15.30±0.09)％、(4.10±0.03)％、(45.60±0.10)％、(10.80±0.04)％,两者差异有统计学意义(P＜0.05).其LRIG1的表达明显降低,将LRIG1质粒体转入耐药细胞株后,TMZ、VP16、硫酸长春新碱、环磷酰胺、阿霉素对空白组(耐药细胞株)的抑制率为(2.60±0.02)％、(3.30±0.02)％、(9.50±0.06)％、(2.20±0.05)％、(2.90±0.03)％,而对转染组的抑制率为(19.10±0.34)％、(38.20±0.53)％、(29.10±0.25)％、(15.20±0.55)％、(17.40±0.41)％,耐药性被逆转,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 LRIG1与肿瘤的化疗敏感性相关,LRIG1可能与肿瘤的多药耐药有关.     

Caveolin-1对乳腺癌细胞Hs578T耐药株周期和凋亡影响

目的 探讨Caveolin-1基因对乳腺癌细胞系Hs578T耐药株(Hs578T/Dox)生长和凋亡的影响. 方法在乳腺癌细胞系Hs578T耐药株中转染Caveolin-1基因,构建高表达Caveolin-1蛋白的细胞系(Hs578T/Dox-cav),通过Western Blot方法证实转染成功.将这2种细胞以同样的条件培养96h,应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的分布.比较转染前后细胞的细胞周期分布的不同.应用软琼脂培养法比较转染前后细胞抛锚生长能力的变化以及对促凋亡剂(staurosporine)的不同反应.结果 转染Caveolin-1后明显促进了所用细胞株由G1期向G2期的转变(P&lt;0.01).自然凋亡率显著下降.抛锚生长能力增加,缓解了对staurosporine的反应.结论 Caveolin-1促进乳腺癌细胞系Hs578T耐药株生长和增殖,抑制凋亡.     

肿瘤相关钙信号传导蛋白-2基因对人乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响

目的 观察肿瘤相关钙信号传导蛋白-2(TROP-2)基因小干扰RNA (siRNA)对乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响.方法 培养人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株,以荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测TROP-2基因mRNA表达;筛选出TROP-2表达最高者.采用TROP4基因siRNA转染乳腺癌细胞,分别以荧光实时定量RT-PCR和免疫荧光方法观察TROP-2基因mRNA和蛋白水平,然后以噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力.结果 人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-35、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株TROP-2 mRNA分别是1.362±0.057、2.207±0.056、2.997±0.052、0.136±0.045、0.122±0.025、0.194±0.028和2.706±0.039,以MCF-7细胞最高;以TROP-2 siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞TROP-2基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;黏附实验结果显示,5、10、20 nmol/L siRNA组黏附率分别为(52.9±2.5)％、(25.6±2.3)％、(12.8±2.2)％(P＜0.01);Transwell实验结果显示,5、10和20 mol/L siRNA组穿过滤膜的细胞分别为78±17、39±15、19±16,而对照组分别为136±25、139±21(P＜0.01).结论 TROP-2基因在乳腺癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞黏附和侵袭能力.     

携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒的构建及其应用的初步研究

目的　构建携带反义多药耐药相关蛋白 (MRP)的重组腺病毒并转染人肝癌耐药细胞株 ,为肝癌耐药的基因治疗提供实验研究基础。方法　将MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒pAdTrack CMV上 ,与骨架质粒在细菌体内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装、扩增后得到携带反义MRP的重组腺病毒AdEasy GFP ASmrp ,再用其转染人肝癌耐药细胞株SMMC 772 1 /ADM。结果　成功地构建了携带反义MRP的重组腺病毒 ,病毒滴度为 2 .5× 1 0 9efu/ml,多重感染复数为 1 0 0时对SMMC 772 1 /ADM细胞株转导效率可达 90 %以上。结论　构建的重组腺病毒AdEasy GFP ASmrp可望有效地将反义MRP导入人肝癌耐药细胞株 ,为肝癌耐药机理及其逆转方式的研究提供实验基础。