含绿色荧光蛋白及人胰岛素基因的真核表达载体的构建

目的构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人胰岛素基因的重组真核表达载体。方法将人胰岛素基因插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-INS。酶切鉴定,测序证实。结果重组真核表达载体pIRES2-EGFP-INS经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,电泳后显示360bp的INS的目的片段和5.3kb的pIRES2-EGFP载体片段,进一步测序并证明重组质粒连接正确。结论成功构建了pIRES2-EGFP-INS重组质粒,为简便快速了解胰岛素基因的转染效率奠定了基础。     

携带人PPARα基因高效真核表达载体的构建及其意义

目的构建可以高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体(αhPPARα)的真核细胞表达载体,为筛选作用于PPARα受体的药物提供分子平台。方法将HepG2细胞总RNA经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆hPPARα全长基因,用BamHⅠ、SalⅠ双酶切后,与相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建phPPARα-IRES2-EGFP重组质粒,用酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARα基因的完整性和可靠性;重组质粒转染293细胞,荧光显微镜观察EGFP报告基因表达强度,并对转染细胞的hPPARα表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARα的高效表达。结论成功构建重组质粒phPPARα-IRES2-EG-FP,为基于hPPARα受体靶点的药物筛选平台的建立提供了高效表达hPPARα的重组载体。     

重组组蛋白去乙酰化酶2-pEGFP-C2质粒的构建及表达

目的将组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因克隆入pEGFP-C2载体,探讨构建的质粒转染进非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7株相关蛋白和mRNA的表达及蛋白分布部位的情况。方法从人肝癌细胞(HepG2)中获得组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的cDNA,采用Xho I和BamH I双酶切,用T4连接酶将该cDNA连接pEGFP-C2质粒,将构建成功的pEGFP-C2-HDAC2质粒经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后转染非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7),荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western blot鉴定HDAC2的表达。结果双酶切鉴定可见HDAC2质粒片段,转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达,PCR结果可检测到HDAC2 mRNA表达,同时Western blot可检测HDAC2蛋白和GFP蛋白的表达。结论成功构建了重组pEGFP-C2-HDAC2表达质粒,HDAC2蛋白可与绿色荧光蛋白在COS-7细胞中融合表达。     

真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2的构建及其在U251细胞中的表达

目的 构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,并探索其在U251神经胶质瘤细胞中的表达.方法 以正常人脑组织总RNA为模板,采用RT-PCR法获得Bex2的cDNA,并与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒.对pEGFP-N1-Bex2重组质粒的菌液行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定.在U251细胞中用脂质体转染法转染pEGFP-N1-Bex2真核表达载体过表达Bex2,分别于转染后12、24、48、72 h收集细胞,用Western blot检测Bex2基因的表达情况.结果 真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2经PCR及双酶切鉴定,均可见387 bp的目的基因条带,并单倍正向克隆至质粒中.转染质粒pEGFP-N1-Bex2后荧光显微镜下观察U251细胞内有绿色荧光蛋白表达,Western blot检测见47 KD和26 KD分别有清晰的外源性Bex2-GFP融合蛋白和GFP蛋白的表达.pEGFP-N1-Bex2在转染U251细胞后12h即有表达,48 h达到高峰.结论 成功构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,瞬时转染后在U251细胞中顺利表达.     

重组真核质粒pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)的构建及表达

目的:将人类G3BP(Ras-GTPase activating protein SH3 domain binding protein)蛋白Domain(1～5)基因片段分别定向连入pEGFP-C2质粒,使G3BP蛋白各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pEGFP-C2载体上,再将构建成功的pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)重组质粒转染入HeLa细胞内,以荧光显微镜及Western印迹法检测绿色荧光蛋白与目的蛋白的融合表达情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到绿色融合蛋白的表达。结论:重组pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)质粒成功构建并表达。     

SARI基因真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立

目的构建人SARI基因真核表达载体,并建立稳定转染的HeLa细胞系。方法采用RT-PCR技术从正常人外周血单个核细胞cDNA文库中扩增SARI基因序列,连接插入至pCMV-N-Flag真核表达载体,并对重组质粒进行酶切及测序鉴定;阳离子聚合物介导重组质粒转染HeLa细胞后,用G418抗生素筛选稳定转染的细胞系。间接免疫荧光检测Flag-SARI融合蛋白在HeLa细胞系中的表达定位。RT-PCR及Western blot检测SARI mRNA及蛋白的表达变化。结果双酶切和DNA测序表明pCMV-Flag-SARI真核表达质粒构建成功。经G418筛选后,RT-PCR和Western blot表明,转染重组质粒的HeLa细胞系中SARI mRNA及蛋白的表达明显升高。间接免疫荧光结果显示,Flag-SARI融合蛋白在HeLa细胞系的胞质和胞核中均有表达,且胞质荧光信号强于胞核。结论成功构建pCMV-Flag-SARI真核表达载体,表达的FlagSARI蛋白主要定位于HeLa细胞系的胞质中。     

大鼠ILK-RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建大鼠整合素连接激酶-RNAi(ILK-RNAi)慢病毒表达载体,为下一步干预研究细胞转分化及其信号通路奠定基础.方法 针对大鼠ILK基因RNAi有效靶序列,合成4条干扰(KD)序列.与pGCSIL-GFP载体连接产生shILK-RNAi慢病毒载体.将连接产物转入制备完毕的细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性克隆,测序验证.包装慢病毒,以绿色荧光蛋白(GFP)表达水平验证病毒滴度.慢病毒载体感染大鼠NRK-52E细胞后,RT-PCR、WB检测及荧光显微镜观察ILK在其细胞中的表达.结果 测序验证成功构建3条大鼠ILK-RNAi慢病毒载体,滴度分别为5×108,2.5×108,3.5×108 pfu/mL.分别以不同感染复数(MOI)感染NRK-52E细胞进行内源筛靶,荧光观察80％细胞的绿色荧光蛋白,RT-PCR、WB检测ILK的表达明显下降.相对于阴性对照序列,KD2,KD3在高MOI组中对ILK表达的敲减达到65％以上(P＜0.05),为有效靶点.其中KD2及KD3的ILK 2-△△ct值分别为0.337,0.217.KD2序列为对ILK的表达抑制最显著.结论 成功构建大鼠ILK-RNAi慢病毒表达载体.     

preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达

目的研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性。方法依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),最终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物。从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+HBsAg(1～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6×His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白。采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达。结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值。酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致。转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1～HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致。结论成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系。     

乙型脑炎病毒C蛋白编码基因重组质粒构建与表达

目的构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)C蛋白编码基因重组子并鉴定。方法以JEV SA14-14-2株总RNA为模板,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增JEV C蛋白编码基因,克隆至pMD19-TSimple载体测序。为便于分析JEV C蛋白编码基因重组子在哺乳动物细胞中的表达,在JEV C蛋白编码基因5′端附加FLAG序列,并亚克隆至pcDNA 3.1(+)载体中,构建重组子pJc并经酶切及DNA测序分析。脂质体法将pJc转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。免疫荧光检测转染的CHO细胞中JEV C蛋白分布与表达。结果 pJC经BamH I/EcoR I酶切释出的插入子片段(414bp)分别与预期结果相符合。所编码的融合蛋白主要分布于胞质,少量分布于胞膜。结论 pJC成功构建,转染的CHO细胞可表达JEV C蛋白。     

含MGMT及增强荧光蛋白真核表达载体的构建

目的 克隆O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）基因,测序鉴定正确后构建含增强荧光蛋白（EGFP）的真核表达载体.方法 利用RT-PCR从人正常肝细胞中克隆MGMT并与克隆载体pGEM-T载体相连接.经PCR、酶切及测序鉴定证明克隆成功后用限制性内切酶切下MG-MT片段,同时酶切载体pIRES2-EGFP.凝胶纯化回收后重组构建真核表达载体并鉴定.结果 测序结果显示所克隆的编码序列与GeneBank公布MGMT cDNA序列一致.真核表达载体的PCR及酶切鉴定结果与预期结果一致.结论 成功克隆了耐药基因MGMT并构建了含EGFP编码序列的真核表达载体pIRES2-MGMT-EGFP,为MGMT的进一步相关研究奠定了坚实基础.     

miRNA-1真核表达载体的构建及转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达

目的 构建大鼠miRNA-1真核表达载体,为研究miRNA-1功能提供实验基础.方法 应用技术体外合成miRNA-1前体对应的基因组片段,定向克隆到pSD11-U6/Neo/绿色荧光蛋白载体上.阳性克隆进行及DNA测序鉴定,将构建成功的重组质粒pSD11-U6/Neo/绿色荧光蛋白/miRNA-1借助脂质体转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果 PCR鉴定及DNA测序表明真核表达载体pSD11-U6/Neo/绿色荧光蛋白/miRNA-1构建成功.转染大鼠骨髓间充质干细胞后,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达.结论 大鼠miRNA-1真核表达载体构建成功.     

大鼠血栓调节蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的研究大鼠血栓调节蛋白基因的扩增、克隆及在原核细胞中的表达。方法以大鼠基因组DNA为模板,进行PCR扩增,用pMD18-Tsimple vector进行T克隆并测序。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,将目的基因克隆到pET-28a(+)表达载体质粒中,转化E.coliBL21(DE3)表达重组蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物。结果含有大鼠血栓调节蛋白基因的PCR产物约为1850bp。重组pMD18-Tsimple vector质粒和重组pET-28a(+)质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,有相应大小的目的片段,测序结果正确。经IPTG诱导,重组pET-28a(+)质粒在E.coliBL21(DE3)中有相对分子质量约为72000的融合蛋白表达。结论成功克隆了大鼠血栓调节蛋白基因,并成功表达了该基因编码的蛋白。     

AIF重组质粒的构建、表达和功能的研究

目的构建人凋亡诱导因子(AIF)基因功能片段的真核表达载体pcDNA3.1( )AIF,并初步研究AIF在细胞凋亡中的作用。方法从人细胞中提取总RNA,RTPCR扩增AIF基因片段;克隆到pMD18T载体上,通过酶切和测序进行鉴定;将AIF基因片段插入pcDNA3.1( ),构建真核表达载体;电转化淋巴母细胞Raji细胞,观察AIF的表达水平和功能。结果成熟AIF蛋白分子在真核细胞中表达,并转移到细胞核中,诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。结论成功构建了pcDNA3.1( )AIF真核表达载体,AIF在Caspase非依赖性细胞凋亡中发挥重要作用。     

pEGFP-N1-PEDF重组质粒的构建和鉴定

目的：构建 pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取PEDF的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-PEDF重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果本实验成功构建了pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒。结论为进一步研究利用PEDF基因治疗皮肤肿瘤提供实验基础。     

三羟基异黄酮对APP695基因转染PC12细胞凋亡的保护作用

目的探讨植物雌激素三羟基异黄酮(Genistein,GST)对APP695基因转染PC12细胞凋亡的保护作用及机制。方法用pIRES2-EGFP空载体和pIRES2-EGFP/APP695MT表达载体转染正常的PC12细胞,将细胞分为对照组、空载组、APP695转染组、GST干预组。应用流式细胞仪测定细胞凋亡率,免疫细胞化学SABC法和Western blot方法检测凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。结果 APP695转染组与空载组比较,PC12细胞凋亡率明显升高(P<0.01),Caspase-3为强阳性表达(P<0.01);GST干预组与APP695转染组比较,PC12细胞凋亡率明显降低(P<0.01),Caspase-3的免疫反应产物明显减弱(P<0.01),且15μmol.L-1和20μmol.L-1 GST处理组与5μmol.L-1和10μmol.L-1 GST处理组比较,Caspase-3的免疫反应产物减弱更明显(P<0.01)。结论 GST能降低APP695基因转染的PC12细胞凋亡率,其机制可能与减少凋亡蛋白Caspase-3的表达有关。     

pIRES-IL-24-PTEN双表达载体的构建及鉴定

目的构建携带人IL-24和10号染色体缺失的磷酸脂酶与PTEN双基因的真核表达载体,为研究其表达产物的抑癌机制提供基础。方法通过PCR方法获得PTEN、IL-24基因片段,进行T-A克隆,再酶切亚克隆到pIRES载体,酶切、测序鉴定正确后命名为pIRES-IL-24-PTEN载体。脂质体转染A549细胞,提取细胞的总蛋白,Western blot检测IL-24和PTEN蛋白的表达。结果酶切、测序显示pIRES-IL-24-PTEN载体序列正确,Western blot检测到IL-24和PTEN蛋白表达。结论成功构建pIRES-IL-24-PTEN载体,为后续研究奠定基础。     

肿瘤坏死因子受体2编码基因重组质粒的构建及意义

目的构建真核表达质粒pcDNA6.0-TNFR2~196MET和pcDNA6.0-TNFR2~196ARG。方法人工合成TNFR2~196MET目的片段,与pMD18-Tsimple载体连接形成克隆载体,再通过设计突变引物,PCR定点突变扩增出含有突变位点的质粒,转化到肠埃希菌感受态细胞JM109中,通过氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆,并进行扩增。抽提质粒进行测序鉴定,得到pMD18-Tsimple-TNFR2196ARG。双酶切pMD18-Tsimple-TN-FR2196MET、pMD18-Tsimple-TNFR2196ARG及pcDNA6.0,将TNFR2196MET、TNFR2196ARG插入pcDNA6.0线性质粒,即构建成pcDNA6.0-TNFR2196MET和pcDNA6.0-TNFR2196ARG真核表达质粒,转化到Ecoli感受态中,筛选阳性克隆行菌液PCR和双酶切及测序鉴定。结果酶切鉴定和测序分析验证TNFR2基因196MET和196ARG表达载体构建成功。结论成功构建表达载体为下一步心血管疾病研究奠定了实验基础。