同型半胱氨酸致脑微血管内皮细胞损伤及丙丁酚拮抗作用的浓度依赖性

目的：观察同型半胱氨酸对大鼠脑微血管内皮细胞的损伤及抗氧化药物丙丁酚的拮抗作用，并观察这种拮抗作用是否有浓度依赖性。 方法：实验于2004-04／10在广西壮族自治区人民医院实验中心完成。取Wistar大鼠2只，用酶溶液消化大鼠脑皮质组织制成细胞悬液再进行培养传代。①经过鉴定的大鼠脑微血管内皮细胞分为损伤组和正常对照组，正常对照组加入无血清1640培养液；损伤组分别加入用无血清的培养液配制的浓度为0．1，0．5，1．0，1．5，2．0mmol／L的同型半胱氨酸，两个组孵育2，4，6，8，10h后计算血管内皮细胞损伤的指标乳酸脱氢酶释放率。②另将细胞分为3组，正常对照组换用无血清1640培养液孵育8h；损伤组加入1．0mmol几同型半胱氨酸孵育8h：干预组分别加入终浓度为10，20，30，40，50μmol／L的丙丁酚各孵育30min后再加入1．0mmol／L同型半胱氨酸孵育8h，然后计算乳酸脱氢酶释放率。⑧将细胞分为3组：正常对照组RPMI-1640培养基常规培养；损伤组：RPMI-1640培养基＋同型半胱氨酸1．0mmol／L进行培养；干预组：RPMI．1640培养基＋丙丁酚50μmol／L30min后再加入同型半胱氨酸1．0mmol／L进行培养。一共观察7d，并画出细胞生长曲线。 结果：①同型半胱氨酸在浓度1．0mmol／L孵育时间8h时乳酸脱氢酶释放率最高，显著高于对照组[（49．06&;#177;1．07）％，（19．6&;#177;2．04）％，P〈0．011。②丙丁酚在10，20，30，40，50μmol／L时乳酸脱氢酶释放率为（45．57&;#177;1.31）%，（41．17&;#177;1．25）％，（37．9&;#177;0．69）％，（32．57&;#177;9．47）％，（26.26&;#177;2.34）%，与损伤组相比差异显著[（49．03&;#177;1．12）％，P〈0．05]，且丙丁酚浓度越高，乳酸脱氢酶释放率越低。③细胞存活数：损伤组低于干预组和对照组（P〈0．01），后两组间无差异（P〉0．05）。 结论：同型半胱氨酸对大鼠脑微血管内皮细胞有毒性损伤作用，丙丁酚10～50μmol／L呈剂量依赖性拮抗作用同型半胱氨酸所致大鼠脑微血管内皮细胞损伤。     

同型半胱氨酸对谷胱甘肽合成的抑制作用

目的:探讨同型半胱氨酸对谷胱甘肽合成的影响及其发生的可能原因。方法:实验于2004-08/2005-02在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室进行。选用健康家兔20只,取抗凝血,离心收集红细胞,制备含有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶体系的红细胞裂解液,设置对照组,高、低剂量同型半胱氨酸处理组,每组均设8个平行管。各组均加入100mmol/L的Tris-Hcl缓冲液(pH8.0)60μL,1mol/LMgCl28μL,10mmol/LATP40μL,50mmol/L谷氨酸(调pH为中性)40μL,红细胞裂解液40μL。低、高浓度同型半胱氨酸处理组再分别加入100mmol/L同型半胱氨酸20μL和60μL,其余实验条件相同。以反应中生成无机磷的mmol数表示γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性大小。分别用紫外分光光度法和荧光法检测各组无机磷和谷胱甘肽含量。结果:①无机磷的生成量:低浓度同型半胱氨酸组和高浓度同型半胱氨酸组明显低于对照组犤(1.476±0.240),(0.751±0.085),(3.279±0.470)mmol/L,P<0.01犦,高浓度同型半胱氨酸组明显低于低浓度同型半胱氨酸组(P<0.05)。②还原型谷胱甘肽含量:低同型半胱氨酸组和高同型半胱氨酸组明显低于对照组犤(3.058±0.264),(1.908±0.301),(4.476±0.462)μmol/L,P<0.01犦,高浓度同型半胱氨酸组明显低于低浓度同型半胱氨酸组(P<0.01)。结论:同型半胱氨酸有可能通过竞争性抑制γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性,减少细胞内还原型谷胱甘肽的生成。     

偏头痛患者血浆同型半胱氨酸的变化及意义

目的:测定偏头痛患者及正常人同型半胱氨酸水平,评价同型半胱氨酸水平在偏头痛诊断治疗中的意义。方法:收集38例无先兆或有先兆的偏头痛患者及40例健康人血液标本,采用高效液相色谱法测定血浆同型半胱氨酸水平,放射免疫检测法测定血浆维生素B12和叶酸水平,比较二者间差异。结果:偏头痛组血浆同型半胱氨酸主要分布8mmol/L以上范围,均值为(11.4±3.6)mmol/L。对照组主要分布在4.9～8.0mmol/L,均值为(6.6±1.1)mmol/L,两组比较差异有显著性意义(t=2.03,P<0.001)。而偏头痛组平均血浆维生素B12犤(124.8±38.6)pmol/L犦及叶酸水平犤(9.9±3.9)nmol/L犦较对照组犤(267.4±64.8)pmol/L,(25.8±7.8)nmol/L犦显著下降(t=3.56,t=2.69,P<0.001),对照组及病例组维生素B12、叶酸与同型半胱氨酸水平呈显著负相关(r=-0.33～-0.50,P<0.001)。结论:血浆同型半胱氨酸水平升高与偏头痛发生有关。     

乳酸脱氢酶抗体对大鼠血管源性脑水肿的干预效应

目的:从酶屏障的角度观察乳酸脱氢酶抗体对大鼠血管源性脑水肿的干预作用。方法:实验于2005-06-10/07-10在南方医科大学附属南方医院神经内科实验室完成。①分组:60只清洁级Wistar大鼠随机分为正常组、脑水肿组、脑水肿甘露醇组与脑水肿乳酸脱氢酶抗体组,每组15只。每组取10只用于脑组织水分含量测定,其余5只用于脑毛细血管伊文思蓝渗出量测定。②模型制备及给药:用腹腔注射苯肾上腺素的方法制成血管源性脑水肿模型。正常组不注射苯肾上腺素及治疗药物,直接断头取脑;脑水肿组制备模型后不给予治疗药物,即刻断头取脑;脑水肿甘露醇组在制成模型后由股静脉注射甘露醇(20g/L,0.5g/kg),30min后断头取脑;脑水肿乳酸脱氢酶抗体组在制成模型后腹腔注射乳酸脱氢酶抗体(10mL/kg),30min后断头取脑。通过水分分析仪分别测定各组脑灰、白质水分含量百分比。用伊文思蓝测定血脑屏障的通透性。结果:60只大鼠均进入结果分析。①脑水肿甘露醇组和脑水肿乳酸脱氢酶抗体组脑灰、白质的水分含量百分比显著低于脑水肿组[灰质:(72.69±1.90)%,(72.78±1.34)%,(76.53±1.39)%,P<0.01;白质:(73.63±1.11)%,(69.58±2.73)%,(77.45±2.38)%,P<0.01]。脑水肿甘露醇组与脑水肿乳酸脱氢酶抗体组相比脑灰质水分百分比差异无显著性意义(P>0.05),白质水分含量差异有显著性意义(P<0.01)。②脑水肿甘露醇组和脑水肿乳酸脱氢酶抗体组伊文思蓝渗出量与脑水肿组相比有显著性下降[(0.0626±0.0033),(0.0441±0.0056),(0.0736±0.0032)A/g(P<0.01)]。与脑水肿甘露醇组相比,脑水肿乳酸脱氢酶抗体组伊文思蓝渗出量有显著下降(P<0.01)。结论:甘露醇可降低灰质、白质水肿,但降低血脑屏障通透性差。乳酸脱氢酶抗体对减少血管源性脑水肿大鼠脑灰、白质水分含量、降低血脑屏障通透性均有显著效果。血管源性脑水肿中血脑屏障的通透性改变与乳酸脱氢酶活性有关,乳酸脱氢酶抗体对血管源性脑水肿有治疗作用。     

螺旋藻抗运动性疲劳作用的实验

目的:观察螺旋藻对大鼠力竭运动时间及血清中乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶、谷草转氨酶活性和丙二醛浓度的影响。方法:实验于2003-09/2004-01在广西医科大学生理实验室完成。30只SD雄性大鼠随机分为安静组、力竭运动组、螺旋藻力竭运动组,每组10只。安静组、力竭运动组喂普通饲料,螺旋藻力竭运动组在饲料中加入15%螺旋藻干粉喂养,共喂养1个月。力竭运动组、螺旋藻力竭运动组大鼠在跑台上进行下坡运动至力竭,跑台速度16m/min,坡度为-16°,力竭标准为动物已跟不上预定速度,经电刺激尾巴仍不能继续往前跑。力竭运动组、螺旋藻力竭运动组大鼠力竭后即刻腹腔麻醉断头处死,同时亦将安静组麻醉后处死,颈动脉采血,分离血清,检测各组大鼠血清乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶、谷草转氨酶活性、丙二醛的水平,评估机体运动损伤的情况。结果:30只大鼠均进入结果分析。①螺旋藻力竭运动组力竭运动时间明显少于力竭运动组(81.4±13.7),(72.8±15.3)min,(t=2.12,P=0.048)。②力竭运动组血清乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶、谷草转氨酶活性、丙二醛浓度明显高于安静组(86.6±4.0),(42.6±4.6)μkat/L;(6.62±0.38),(4.82±0.31)μkat/L;(7.90±0.48),(5.84±0.72)μkat/L;(6.16±0.36),(4.47±0.15)μmol/L,(q=29.70,16.09,11.50,17.49,P=0.000),螺旋藻力竭运动组上述指标明显低于力竭运动组(53.6±5.3)μkat/L,(5.85±0.35)μkat/L,(6.90±0.45)μkat/L,(4.64±0.29)μmol/L,(q=19.22,6.89,5.56,15.73,P<0.01)。结论:螺旋藻可减轻力竭运动后代谢引起的氧自由基损伤,保护细胞膜结构的稳定,调节渗透压平衡,防止过氧化损伤,从而起到抗运动性疲劳的作用。     

内给氧改善缺血再灌注后脑组织能量代谢的实验研究

目的:探讨内给氧改善大鼠脑组织缺血再灌注后能量代谢障碍,起到脑保护作用的机制。方法:30只Wistar大鼠随机分成3组:假手术组、缺血组、治疗组,制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型,予内给氧治疗后,分别测定各组大鼠脑组织中的三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、单磷酸腺苷(AMP),乳酸含量及Na+-K+-ATPase活性,计算能量负荷值。结果:内给氧治疗组的ATP含量(2.3309±0.0866)mg/L、能量负荷值为0.0960±0.0052,Na+-K+-ATPase活性为(0.903±0.117)μkat/g,均高于缺血组犤(0.8199±0.0591)mg/L,0.1663±0.0044,(0.465±0.064)μkat/g犦差异存显著性意义(P<0.05),乳酸含量(16.0342±1.0136)mmol/g低于缺血组(24.2513±4.3571)mmol/g,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:内给氧可明显改善大鼠脑缺血再灌注后能量代谢,具有脑保护作用。     

盐酸氟桂利嗪对同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞株黏附分子表达的干预

目的:观察盐酸氟桂利嗪对同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞株黏附分子表达的影响。方法:实验于2005-02/08在西京医院神经内科实验室完成。人脐静脉内皮株细胞培养,取第4～7代指数生长期细胞,接种到96孔板,24h细胞贴壁后换液,加入药物处理。随机分为正常对照组、同型半胱氨酸组及盐酸氟桂利嗪组3组,正常对照组,仅予空白RPMI-1640培养基培养24h;同型半胱氨酸组,分别加入终浓度为100μmol/L、200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L的同型半胱氨酸培养24h;盐酸氟桂利嗪组:加入终浓度为10μmmol/L盐酸氟桂利嗪及终浓度分别为为100μmol/L、200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L的同型半胱氨酸,培养24h。以上每组各种浓度共8孔。用ELISA法检测各组不同培养条件下可溶性细胞间黏附分子1和可溶性血管细胞黏附因子1的吸光度值(波长490nm)。结果:同型半胱氨酸组中随着培养液同型半胱氨酸浓度的增加可溶性细胞间黏附分子1的吸光度值从(0.143±0.013)增至(0.175±0.006),与对照组相比差异有显著性意义(P<0.01);可溶性血管黏附分子1从(0.112±0.008)增至(0.147±0.014),与对照组相比差异有显著性意义(P<0.01);10μmmol/L的盐酸氟桂利嗪 100μmol/L同型半胱氨酸组与相同浓度的同型半胱氨酸组相比吸光度值也减少,差异无显著性意义(P>0.05);10μmmol/L的盐酸氟桂利嗪 200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L同型半胱氨酸组的吸光度均低于相同浓度的同型半胱氨酸组,差异有显著性意义(P<0.01);表明盐酸氟桂利嗪明显抑制同型半胱氨酸所诱导的可溶性细胞间黏附分子1和可溶性血管细胞黏附因子1的表达。结论:盐酸氟桂利嗪能够减少同型半胱氨酸引起的人脐静脉内皮细胞株黏附分子的上调,可能对细胞具有保护作用。     

盐酸氟桂利嗪对同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞株黏附分子表达的干预

目的：观察盐酸氟桂利嗪对同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞株黏附分子表达的影响。 方法：实验于2005-02／08在西京医院神经内科实验室完成。人脐静脉内皮株细胞培养，取第4—7代指数生长期细胞，接种到96孔板，24h细胞贴壁后换液，加入药物处理，随机分为正常对照组、同型半胱氨酸组及盐酸氟桂利嗪组3组，正常对照组，仅予空白RPMI-1640培养基培养24h；同型半胱氨酸组，分别加入终浓度为100μmol／L、200μmol／L、500μmol／L．1000μmol/L的同型半胱氨酸培养24h；盐酸氟桂利嗪组：加入终浓度为10μmmol／L盐酸氟桂利嗪及终浓度分别为100μmol／L、200μmol／L、500μmol／L、1000μmol／L的同型半胱氨酸，培养24h。以上每组各种浓度共8孔。用ELISA法检测各组不同培养条件下可溶性细胞间黏附分子1和可溶性血管细胞黏附因子1的吸光度值（波长490nm）。 结果：同型半胱氨酸组中随着培养液同型半胱氨酸浓度的增加可溶性细胞间黏附分子1的吸光度值从（0．143&;#177;0.013）增至（0．175&;#177;0．006），与对照组相比差异有显著性意义（P〈0．01）；可溶性血管黏附分子1从（0．112&;#177;0．008）增至（0．147&;#177;0．014）．与对照组相比差异有显著性意义（P〈0．01）；10μmmol／L的盐酸氟桂利嗪＋100μmol／L同型半胱氨酸组与相同浓度的同型半胱氨酸组相比吸光度值也减少．差异无显著性意义（P〉0．05）；10μmmol／L的盐酸氟桂利嗪＋200μmol／L、500μmol／L、1000μmol／L同型半胱氨酸组的吸光度均低于相同浓度的同型半胱氨酸组．差异有显著性意义（P〈0．01）；表明盐酸氟桂利嗪明显抑制同型半胱氨酸所诱导的可溶性细胞间黏附分子1和可溶性血管细胞黏附因子1的表达。 结论：盐酸氟桂利嗪能够减少同型半胱氨酸引起的人脐静脉内皮细胞株黏附分子的上调，可能对细胞具有保护作用。     

同型半胱氨酸对谷胱甘肽合成的抑制作用

目的：探讨同型半胱氨酸对谷胱甘肽合成的影响及其发生的可能原因.方法：实验于2004-08/2005-02在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室进行.选用健康家兔20只,取抗凝血,离心收集红细胞,制备含有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶体系的红细胞裂解液,设置对照组,高、低剂量同型半胱氨酸处理组,每组均设8个平行管.各组均加入100mmol/L的Tris-Hcl缓冲液（pH 8.0）60 μL,1 mol/L MgCl2 8 μL,10 mmol/L ATP 40μL,50 mmol/L谷氨酸（调pH为中性）40 μL,红细胞裂解液40μL.低、高浓度同型半胱氨酸处理组再分别加入100 mmol/L同型半胱氨酸20μL和60μL,其余实验条件相同.以反应中生成无机磷的mmol数表示γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性大小.分别用紫外分光光度法和荧光法检测各组无机磷和谷胱甘肽含量.结果：[1]无机磷的生成量：低浓度同型半胱氨酸组和高浓度同型半胱氨酸组明显低于对照组[（1.476&;#177;0.240）,（0.751&;#177;0.085）,（3.279&;#177;0.470）mmol/L,P＜0.01],高浓度同型半胱氨酸组明显低于低浓度同型半胱氨酸组（P＜0.05）.[2]还原型谷胱甘肽含量：低同型半胱氨酸组和高同型半胱氨酸组明显低于对照组[（3.058&;#177;0.264）,（1.908&;#177;0.301）,（4.476&;#177;0.462）μmol/L,＜0.01],高浓度同型半胱氨酸组明显低于低浓度同型半胱氨酸组（P＜0.01）.结论：同型半胱氨酸有可能通过竞争性抑制γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性,减少细胞内还原型谷胱甘肽的生成.     

同型半胱氨酸和晚期糖基化终产物影响血管内皮细胞凋亡的协同效应

目的:观察两种尿毒症毒素同型半胱氨酸和晚期糖基化终产物是否协同影响血管内皮细胞的凋亡程度。方法:实验于2006-01/03在中南大学湘雅三医院中心实验室完成。①参考Makita的报道体外制备晚期糖基化终产物,将牛血清白蛋白50g/L、D-葡萄糖0.5mol/L、磷酸盐缓冲盐液0.2mol/L(pH7.4)和蛋白酶抑制剂用0.22μm滤膜过滤除菌,37℃孵育60d。采用荧光分光光度分析法鉴定。晚期糖基化终产物修饰的牛血清白蛋白中晚期糖基化终产物含量为90.52U/mg。②将不同浓度的同型半胱氨酸和晚期糖基化终产物单独或联合作用于人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞,分为空白对照组;同型半胱氨酸干预组(分别加入0.05,0.1,0.5,1.0,5.0mmol/L的同型半胱氨酸);同型半胱氨酸 晚期糖基化终产物联合干预组(分别加入0.05,0.1,0.5,1.0,5.0mmol/L的同型半胱氨酸和终浓度为50mg/L的晚期糖基化终产物)。③采用Hoechst染色和流式细胞技术检测细胞凋亡程度。结果:①Hoechst33258染色检测内皮细胞凋亡结果:同型半胱氨酸 晚期糖基化终产物联合干预组在0.05～5.0mmol/L各个浓度较对照组和单纯同型半胱氨酸组都有明显差别(P<0.01)。②流式细胞仪检测内皮细胞凋亡结果:联合干预组总凋亡率为(15.31±2.14)%,早期凋亡率为(9.16±1.38)%,均显著高于同型半胱氨酸或晚期糖基化终产物单独干预组(P<0.01)。结论:同型半胱氨酸和晚期糖基化终产物对血管内皮细胞的凋亡具有协同诱导作用。