Mfn2基因对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞形成及ABCA1表达的影响

目的:观察Mfn2基因对ox-LDL刺激下RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响及其机制。方法:通过细胞内胆固醇浓度检测,分析过表达或者干扰Mfn2基因表达对RAW264.7细胞在ox-LDL刺激下泡沫细胞内胆固醇含量和胆固醇酯/总胆固醇比例的影响;通过实时定量PCR和Western blot检测Mfn2基因对细胞胆固醇外排蛋白ABCA1mRNA和蛋白水平的影响。结果:RAW264.7细胞过表达Mfn2基因,分别降低细胞内16.3%总胆固醇含量和19.8%胆固醇酯/总胆固醇比例;而干扰RAW264.7细胞Mfn2基因表达,分别增加细胞内45.9%总胆固醇含量和26.7%的胆固醇酯/总胆固醇比例。40pfu和60pfu adv-Mfn2感染均促进RAW264.7细胞ABCA1的mRNA表达(分别增加26.5%和60.5%),而仅60pfu adv-Mfn2感染促进RAW264.7细胞ABCA1的蛋白表达(增加40.6%)。结论:Mfn2可能通过促进ABCA1的表达,减少细胞内胆固醇的沉积。     

别嘌呤醇抑制巨噬细胞脂质蓄积的作用机制

目的采用氧化型低密度脂白(ox-LDL)构建小鼠巨噬细胞泡沫化模型,探讨别嘌呤醇对泡沫化进程中脂质蓄积的影响及其机制。方法体外培养小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7,用ox-LDL或Dil-ox-LDL孵育细胞构建泡沫化模型。用不同浓度别嘌呤醇处理细胞,MTT法筛选出合适的实验浓度。将合适浓度的别嘌呤醇作用于细胞,在共聚焦荧光显微镜下观察Dil-ox-LDL孵育后RAW264.7细胞内脂质蓄积情况;酶学终点法定量检测细胞内总胆固醇的变化;半定量﹑荧光定量RT-PCR法和蛋白免疫印迹法分别检测细胞中LXRα和ABCA1 mRNA和蛋白的表达水平。结果与ox-LDL诱导的泡沫化模型组相比,别嘌呤醇组脂质蓄积显著下降,总胆固醇含量明显下调。别嘌呤醇在mRNA和蛋白水平上引起LXRα和ABCA1的高表达。结论别嘌呤醇具有抑制ox-LDL诱导小鼠巨噬细胞泡沫化进程的作用,并通过上调LXRα-ABCA1途径来调节细胞内胆固醇的含量。     

白细胞介素34对巨噬细胞泡沫化过程中细胞内胆固醇水平的影响

目的 探讨白细胞介素34(IL-34)对小鼠巨噬细胞向泡沫细胞分化过程中细胞内胆固醇水平的影响及其可能的分子机制。方法 采用小鼠巨噬细胞系RAW 246.7,并分为对照组(PBS)、处理组[氧化型低密度脂蛋白(oxLDL 40μg/ml)]、低剂量组(oxLDL+IL-34 20ng/ml)、高剂量组(oxLDL+IL-34 50ng/ml),不同条件诱导培养24h,油红O染色观察泡沫细胞形成情况,比色法检测细胞内总胆固醇、胆固醇酯及游离胆固醇水平,RT-PCR和Western blot检测胆固醇酰基转移酶(ACAT-1)、中性胆固醇水解酶(nCEH)mRNA及蛋白表达。结果 处理组与低剂量组细胞内总胆固醇、胆固醇酯水平无明显差异(P0.05);与处理组比较,高剂量组细胞内红染脂滴增多,细胞内总胆固醇[(0.23±0.04)μg/μl vs(0.14±0.02)μg/μl,P0.05)]、胆固醇酯水平明显增多[(0.12±0.02)μg/μl vs(0.06±0.05)μg/μl,P0.05)],ACAT-1蛋白及mRNA表达上调(1.03±0.12 vs 0.43±0.07,P0.05),nCEH蛋白和mRNA无明显变化(P0.05)。结论 高剂量IL-34能增加巨噬细胞内胆固醇酯含量蓄积,其作用机制可能是通过上调ACAT-1促进细胞内游离胆固醇的酯化实现。     

瘦素对巨噬细胞白细胞介素1β表达的影响

目的探讨瘦素对鼠源性巨噬细胞系RAW264.7细胞白细胞介素1β表达的影响,以阐明瘦素在动脉粥样硬化发生中的作用。方法不同浓度的瘦素(1.25、2.5、5和10nmol/L)孵育RAW264.7细胞4h后,逆转录聚合酶链反应法检测巨噬细胞白细胞介素1βmRNA的表达。并用该浓度梯度的瘦素分别孵育RAW264.7细胞1、3、6、9h后,采用双抗夹心酶联免疫吸附法检测各组培养上清白细胞介素1β蛋白含量。结果白细胞介素1βmRNA表达水平随瘦素浓度增加逐渐增高(分别为0.107±0.102、0.204±0.019、0.718±0.083、0.642±0.071),5nmol/L瘦素处理组达最高峰。各组培养上清白细胞介素1β蛋白分泌水平随瘦素浓度增加逐渐增高,5nmol/L瘦素处理组白细胞介素1β蛋白分泌量达最高峰;白细胞介素1β蛋白分泌水平随瘦素刺激时间增加逐渐增高,至6h达最高峰(P<0.05)。RAW264.7细胞经不同浓度瘦素处理后,白细胞介素1βmRNA和蛋白表达呈瘦素剂量依赖性增加。结论瘦素可在体外促进RAW264.7细胞白细胞介素1β表达和分泌,这可能是瘦素直接致动脉粥样硬化的机制之一。     

巨噬细胞荷脂过程中脂肪分化相关蛋白与酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1及中性胆固醇酯水解酶相互结合

目的探讨脂肪分化相关蛋白是否与酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1或中性胆固醇酯水解酶相互结合。方法50mg/L氧化型低密度脂蛋白孵育RAW264.7细胞0、0.5、1、3、6h,使用逆转录-聚合酶链反应及蛋白免疫印迹分析技术检测脂肪分化相关蛋白、酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1和中性胆固醇酯水解酶的mRNA及蛋白的表达;应用免疫共沉淀技术检测脂肪分化相关蛋白与酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1或中性胆固醇酯水解酶是否相互结合。结果随着氧化型低密度脂蛋白与RAW264.7细胞孵育时间的延长,逆转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹分析显示,脂肪分化相关蛋白、酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1和中性胆固醇酯水解酶的mRNA和蛋白质随着时间的延长而增多,与0h相比,差异有显著性（P<0.05,n＝3）。免疫共沉淀实验显示,RAW264.7细胞与氧化型低密度脂蛋白孵育0、0.5、1、3h时脂肪分化相关蛋白与酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1结合,6h时脂肪分化相关蛋白与酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1不结合;孵育0、0.5、1h时脂肪分化相关蛋白与中性胆固醇酯水解酶不结合,3、6h时与中性胆固醇酯水解酶结合。结论在荷脂的RAW264.7细胞中脂肪分化相关蛋白与中性胆固醇酯水解酶及酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1相互结合。脂肪分化相关蛋白与酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1和中性胆固醇酯水解酶在细胞内脂质代谢中可能协同作用。     

孤儿核受体Nur77通过转录激活功能调控巨噬细胞脂质沉积

目的:探讨孤儿核受体Nur77调控巨噬细胞脂质沉积与其转录激活功能的关系。方法:建立稳定表达GFP、GFP-Nur77、GFP-Nur77/ΔDBD和GFP-Nur77/ΔTAD c DNA的小鼠巨噬细胞RAW264.7单克隆细胞系,40μg/ml氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激24 h后,油红"O"染色定性观察细胞内脂质沉积,液相色谱-质谱联用法(LC-MS)定量检测细胞内胆固醇酯,荧光实时定量PCR(RT-PCR)检测CD36和ABCA1 mRNA水平的变化,流式细胞仪检测CD36蛋白表达,Western blot方法检测ABCA1蛋白表达。结果:与对照GFP-RAW264.7相比,高表达Nur77能够显著减少ox-LDL诱导引起的巨噬细胞内脂质沉积,同时降低CD36的mRNA及蛋白表达,上调ABCA1的mRNA及蛋白表达。但GFP-Nur77/ΔDBD RAW264.7和GFP-Nur77/ΔTAD RAW264.7细胞内胆固醇都明显升高,并伴随CD36的mRNA及蛋白表达的降低和ABCA1的mRNA及蛋白表达的升高。结论:孤儿核受体Nur77通过减少脂质摄取和增加脂质排出而减轻巨噬细胞内脂质沉积,这一作用与Nur77 DNA结合能力以及转录活性有关。     

亲环素A在巨噬细胞荷脂过程中的影响

目的观察胆固醇转运复合物中关键蛋白亲环素A在氧化型低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞荷脂过程中的表达变化及其与细胞内胆固醇蓄积的关系,进而分析亲环素A在巨噬源性泡沫细胞形成过程中的作用。方法采用75 mg/L氧化型低密度脂蛋白与RAW264.7细胞共同孵育,建立巨噬细胞荷脂化模型;Western-blot、免疫荧光法检测亲环素A蛋白的表达水平;高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量的变化。结果75 mg/L氧化型低密度脂蛋白与RAW264.7细胞共同孵育48 h后,亲环素A的蛋白表达逐渐减弱,48 h、72 h分别较未处理组下降了54.5%±6.3%、59.8%±5.9%(P<0.05)。间接免疫荧光定位检测发现氧化型低密度脂蛋白显著抑制RAW264.7细胞中亲环素A在胞膜、胞浆中的表达,且随着处理时间的延长作用更明显。细胞内胆固醇酯/总胆固醇的比值由未处理组的28.3%±1.2%上升至48 h的42.3%±5.9%(P均<0.05)。结论氧化型低密度脂蛋白诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化过程中,亲环素A的表达下调与细胞胆固醇蓄积密切相关。     

亲环素A在巨噬细胞荷脂过程中的表达及普罗布考干预的影响

目的观察亲环素A在氧化型低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞荷脂过程中的表达变化及其与细胞内胆固醇蓄积的关系,进而探讨亲环素A在动脉粥样硬化形成中的作用机制。方法采用75 mg/L氧化型低密度脂蛋白与RAW264.7巨噬细胞共同孵育,建立巨噬细胞荷脂化模型,油红O染色观察细胞内脂滴的形成,高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量,Western-blot检测亲环素A的蛋白表达;用75 mg/L普罗布考干预对上述检测的影响。结果氧化型低密度脂蛋白与RAW264.7细胞共同孵育48 h后,油红O染色显示细胞内有大量脂滴形成,细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量均明显增加,胆固醇酯/总胆固醇的比值为42.3%±5.9%,符合荷脂细胞特征;亲环素A的蛋白表达明显减弱。予普罗布考处理,细胞内脂滴明显减少,胆固醇酯/总胆固醇的比值降至32.9%±2.5%,亲环素A的蛋白表达增加81.3%±3.6%,较对照组差异有显著性(P均<0.05)。结论氧化型低密度脂蛋白诱导的RAW264.7巨噬细胞荷脂过程中,亲环素A表达下调,促进细胞胆固醇蓄积;普罗布考干预可上调亲环素A蛋白表达,减轻细胞内的胆固醇蓄积。     

孤儿核受体Nur77抑制小鼠巨噬细胞脂质沉积

目的 探讨孤儿核受体Nur77对巨噬细胞脂质沉积的影响及其机制.方法 建市稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)和GFP-Nur77质粒cDNA的小鼠巨噬细胞RAW264.7单克隆细胞系,40 μg/ml氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激24 h后,用油红O染色定性观察细胞内脂质沉积,液相色谱-质谱联用法定量检测细胞内胆固醇酯,用荧光实时定量PCR(RT-PCR)检测CD36和腺苷三磷酸结合盒转运体A1(ABCA1)mRNA水平的变化,用流式细胞仪检测CD36蛋白表达,Western blot方法检测ABCA1蛋白表达.结果 Nur77能够显著减少ox-LDL诱导引起的巨噬细胞内脂质沉积.ox-LDL诱导前,GFP-RAW264.7组和GFP-Nur77-RAW264.7组细胞内总胆固醇含量分别为(38.66±0.13)μg/mg蛋白和(36.25±0.48)μg/mg蛋白,细胞内胆固醇酯含量为(18.85±0.03)μg/mg蛋白和(17.79±0.86)μg/mg蛋白.ox-LDL诱导24h后,GFP-RAW264.7组和GFP-Nur77-RAW264.7组细胞内总胆固醇含量分别为(68.98±1.68)μg/mg蛋白和(50.94±1.63)μg/mg蛋白,细胞内胆同醇酯含量为(35.92±2.28)μg/mg蛋白和(24.81±2.92)μg/mg蛋白.同时伴随CD36的mRNA及蛋白表达下降和ABCAI的mRNA及蛋白表达上调.结论 孤儿核受体Nur77通过减少脂质摄取和增加脂质排出而减轻巨噬细胞内脂质沉积,这可能是其抗动脉粥样硬化的重要机制之一.     

乌司他丁对脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应的影响

目的探讨乌司他丁对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响。方法采用1.0μg/mL的LPS激活RAW264.7细胞株,与不同浓度组乌司他丁(100～10 000 U/mL)共同孵育,采用ELISA法测定TNF-α和IL-1β的表达;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术分析TNF-αmRNA和IL-1βmRNA表达。结果高浓度乌司他丁(1 000～10 000 U/mL)可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α和IL-1β表达(P均<0.05),下调LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-αmRNA和IL-1βmRNA含量(P均<0.05);低浓度乌司他丁(100 U/mL)对LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达与LPS单独处理组比较,无显著差异。结论乌司他丁可抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应;该抑制作用呈浓度依赖性。