大黄牡丹汤含药血清对 LPS 刺激的小鼠肺巨噬细胞 TLR4和 MyD88表达的影响

目的：探讨大黄牡丹汤含药血清（以下简称含药血清）对脓毒症的治疗机制。方法体外培养小鼠肺巨噬细胞株RAW264．7并随机分为空白组,模型组,含药血清高、中、低浓度组,每组3个复孔。除空白组外,其余四组均予细菌脂多糖（ LPS）5μg/mL刺激24 h,含药血清高、中、低浓度组分别同时给予高、中、低浓度的含药血清进行干预。干预后于37℃、5％CO2培养箱中培养24 h。分别采用半定量RT-PCR和Western blot法测定Toll样受体4（TLR4）及髓样分化因子88（MyD88）mRNA和蛋白表达。结果模型组TLR4和MyD88 mRNA和蛋白表达均显著高于空白组（P＜0．01）;含药血清中浓度组与高浓度组TLR4和MyD88表达无显著差异,但均显著低于模型组（P＜0．01）。结论含药血清治疗脓毒症的机制可能为抑制TLR4和下游MyD88表达。     

肠炎清对免疫复合溃疡型结肠炎模型大鼠结肠组织NF-κB蛋白表达和TLR4、MyD88基因表达的影响

[目的]观察肠炎清对免疫复合溃疡型结肠炎模型(ICUC)大鼠结肠组织核因子-κB(NF-κB)蛋白表达及Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)基因表达的影响,探讨其治疗IBD的作用机制。[方法]采用三硝基苯磺酸(TNBS)加免疫复合法造模。将大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、肠炎清低、中、高剂量组(8.33、16.67、33.33ml/kg)、柳氮磺吡啶(SASP)组(0.5g/kg)。造模后第2天,用药组分别给予相应药物灌胃,7d后,麻醉处死大鼠,取新鲜结肠标本。采用免疫组化法检测NF-κBp65的蛋白表达,实时定量PCR法(qRT-PCR)检测TLR4mRNA、MyD88mRNA的表达。[结果]免疫组化结果 NF-κBp65在各组各只动物均可见阳性表达,其中肠炎清高剂量组及SASP组可显著下调NF-κBp65的表达,差异有统计学意义(P0.05)。PCR结果:造模后动物结肠组织TLR4mRNA、MyD88mRNA的表达量均有升高。与模型对照组比较,各给药组TLR4 mRNA、MyD88mRNA表达均有不同程度的下调,但差异无统计学意义。[结论]肠炎清能下调NF-κBp65蛋白表达、TLR4、MyD88基因表达,其作用机制可能与调控TLR4/MyD88/NF-κB信号转导通路有关。     

1,25-二羟维生素D3对于哮喘大鼠及其肺泡巨噬细胞中VDUP1/TRX的影响

目的探讨1,25-二羟维生素D3（1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25（OH）2D3）对哮喘大鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fuluid,BALF）中维生素D上调蛋白1（vitamin D up-regulated protein 1,VDUP1）和硫氧还蛋白（thioredoxin,TRX）表达及气道炎症的影响。方法将28只Wistar大鼠随机分为4组,以卵白蛋白（ovalbumin,OVA）诱导哮喘发作,并给予1,25（OH）2D3和地塞米松干预,同时设对照组。测定BALF中IL-4和IL-10水平,细胞总数和肺组织病理变化。同时提取7只哮喘模型大鼠BALF中的巨噬细胞,体外给予1,25（OH）2D3干预。用逆转录-聚合酶链反应检测肺组织及BALF中巨噬细胞表达VDUP1和TRX的水平。结果 1,25（OH）2D3治疗组BALF中细胞总数及嗜酸粒细胞计数和IL-4水平降低,IL-10水平增高。肺组织及肺泡巨噬细胞中VDUP1和TRX表达增加。结论给予哮喘大鼠1,25（OH）2D3可抑制气道炎症,增加TRX和VDUP1的表达,两者可作为哮喘氧化应激的监测指标。     

通络方药对2型糖尿病大鼠心肌和主动脉iNOS基因表达的影响

目的观察通络方药（Tongluo Recipe,TLR）对2型糖尿病大鼠心肌和主动脉诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因表达的影响,探讨TLR在2型糖尿病（type 2 diabetes,T2DM）的干预作用和应用价值。方法30只雄性健康清洁级SD大鼠随机分为3组：正常对照组、T2DM组、T2DM＋TLR干预组,每组10只。T2DM＋TLR干预组大鼠TLR按0．4g·kg^-1·d^1剂量灌胃,1次,d,持续给药12W后处死取心肌、主动脉组织待测。利用实时定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）方法测定各组大鼠心肌、主动脉诱导型一氧化氮合酶iNOS的基因表达水平。结果与正常对照组比较,2型DM组大鼠心肌和主动脉iNOS的mRNA表达明显降低（P〈0．01、P〈0．05）,而T2DM＋TLR干预组大鼠心肌和主动脉iNOS的mRNA表达较T2DM组明显升高（P〈0．01）。结论TLR可以增加T2DM大鼠心肌、主动脉iNOS的mRNA表达,从而增加NO合成,可能对T2DM具有防治意义。     

TLR4在糖尿病大鼠肺组织表达的变化及对脂多糖反应性的研究

复制糖尿病大鼠模型，饲养4周，正常组及糖尿病组分别给予腹腔注射脂多糖5mg／kg，12h后免疫组化及免疫印记分析方法检测Toll样受体4（TLR4）在大鼠肺组织中含量的变化。观察到糖尿病组大鼠肺组织TLR4表达较对照组增高（P=0．000）；糖尿病组大鼠腹腔注射脂多糖后肺组织TLR4表达无明显变化（P=0．941），正常组大鼠腹腔注射脂多糖后TLR4表达明显增高（P=0．000）。提示糖尿病机体处于促炎症状态，但在免疫应激条件下糖尿病机体的TLR4不能正常发挥免疫识别功能，将可能导致糖尿病机体的免疫防御能力降低。     

1，25-二羟维生素D3对高糖环境下人肾小管上皮细胞维生素D受体及血管紧张素Ⅱ表达的影响

目的观察1,25-二羟维生素D,[1,25-（OH）2D3]对高糖状态下人近端肾小管上皮细胞（HK-2）维生素D受体（VDR）以及血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）表达的影响。方法体外培养HK-2细胞,实验分为对照组（糖浓度5．5mmol／L）、甘露醇组（19．5mmol／L）、高糖组（糖浓度25．0mmoL／L）、高糖＋1,25-（OH）,D,组（浓度1．0×10^-6、1．0×10^-7、1．0×10^-8mol／L）和高糖＋1,25-（OH）2D3＋siRNAVDR干扰组,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测VDRmRNA表达,Westernblotting检测VDR蛋白表达,双荧光素酶报告基因系统检测VDR基因转录活性,放射免疫法检测AngⅡ含量。多个样本间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用g检验。结果与对照组相比,高糖组HK-2细胞中VDRmRNA、蛋白的表达及基因转录活性均明显降低（分别为1．34±0．22比2．47±0．31、0．51±0．06比1．14±0．13、0．51±0．21比1．42±0．28,均P〈0．05）。1,25-（OH）2D3上调高糖条件下HK-2细胞中VDRmRNA、蛋白的表达及基因转录活性,且呈浓度依赖性（分别为1．964-0．31比1．34±0．22、0．934-0．08比0．51±0．06、1．12±0．23比0．51±0．21,均P〈0．05）。与对照组相比,高糖使HK-2细胞分泌AngⅡ增加[（88±10）比（17±2）ng／L,P〈0．05]。1,25-（OH）2D3浓度依赖性下调高糖诱导的AngII高表达[（44±5）比（884-10）ng／L,P〈0．05]。利用RNA干扰诱导VDR基因沉默后,1,25-（OH）2D3不能下调高糖诱导的AngⅡ高表达[（87±12）比（88±10）ng／L,P〉0．05]。结论1,25-（OH）2D,可能通过VDR介导的方式负性调节高糖环境下人肾小管上皮细胞AnglI表达,从而对糖尿病肾脏疾病的进展起到延缓作用。     

白蛋白治疗对小鼠脑缺血早期脑组织Toll样受体4和骨髓分化因子88 mRNA表达的影响

目的研究人血白蛋白治疗对局灶性脑缺血再灌注小鼠脑组织Toll样受体4(TLR4)和骨髓分化因子88(MyD88)mRNA表达的影响。方法健康雄性成年昆明小鼠54只,随机分为假手术组(14只)、生理盐水组(20只)和白蛋白组(20只),每组又均分为再灌后6、24 h 2个时间点。采用左侧大脑中动脉线栓法制备小鼠局灶性脑缺血再灌注模型,RT-PCR法检测左侧脑组织TLR4、MyD88 mRNA的表达水平,并进行神经功能缺损评分。结果生理盐水组和白蛋白组脑缺血再灌注后6、24 h TLR4、MyD88 mRNA表达水平明显高于假手术组,且24 h表达水平升高更明显(P<0.05);但白蛋白组6、24 h TLR4、MyD88 mRNA表达量明显低于生理盐水组(P<0.05);24 h白蛋白组小鼠的神经功能缺损评分与生理盐水组比较有明显改善(P<0.05);24 h TLR4、MyD88 mRNA表达水平与神经功能缺损评分呈正相关(r=0.92,r=0.85,P<0.05)。结论白蛋白治疗可以下调脑缺血早期脑组织高表达的TLR4、MyD88 mRNA的水平,改善脑缺血后小鼠神经功能缺损。     

姜黄素抑制肝星状细胞MyD88及信号通路细胞因子表达的研究

目的探讨姜黄素在肝星状细胞MyD88依赖性途径中的作用机制。方法体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,将HSCT6分为空白对照组、Control siRNA组、MyD88 siRNA干扰组、姜黄素组、姜黄素+Control siRNA组、姜黄素+MyD88 siRNA干扰组,siRNA处理组给予siRNA干扰48 h后,姜黄素组加入姜黄素作用24 h,各组均在收集细胞前12 h给予LPS诱导,收集各组细胞,Western blotting法检测MyD88蛋白表达;RT-PCR术检测细胞因子mRNA的表达。结果 MyD88 siRNA干扰、姜黄素均可降低MyD88蛋白的表达(P0.05),同时给予MyD88 siRNA干扰和姜黄素作用时,MyD88蛋白下降更明显(P0.05)。MyD88 siRNA干扰后TLR2、TLR4 mRNA表达差异无统计学意义(P0.05),姜黄素作用后TLR2、TLR4的mRNA表达降低,二者同时作用其下降更显著(P0.05);MyD88 siRNA干扰、姜黄素处理后NF-κB、TNF-α、IL-1βmRNA表达均降低,二者同时作用后其下降更明显(P0.05)。结论姜黄素可能通过抑制MyD88蛋白表达和MyD88依赖途径上的多种细胞因子的mRNA表达而阻断MyD88依赖性信号通路的转导,促进活化的HSCs凋亡,从而发挥其抗肝纤维化的作用。     

雷帕霉素减少GK糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡及其机制

目的观察糖尿病肾组织肿瘤坏死因子（TNF-α）、核因子（NF-κB）的表达及其与肾组织细胞凋亡关系以及雷帕霉素对其的影响。方法将20只GK大鼠随机分为DM组（n=10）、DMR组（n=10）,10只Wistar大鼠作为NC组。DMR组予以6mg／kg雷帕霉素灌胃,DM与NC组仅给予等量生理盐水灌胃。TUNEL法检测肾组织细胞凋亡。免疫组织化学法（IHC）检测肾组织TNF-α和NF-κB的表达。结果TUNEL法显示,NC组肾组织未见明显的凋亡细胞;4周及8周DM组凋亡数呈进行性增多（P〈0．01）。IHC显示,NC组肾组织TNF-α、NF-κBp65有轻微阳性表达;4周、8周DM组NF-KBp65、TNF-α表达有逐渐上升的趋势,均显著高于正常对照组（P〈0．01）。NF-κBp65、TNF-α阳性表达呈正相关（P〈0．01）;肾组织NF-a和NF-κBp65表达与肾组织细胞凋亡之间均呈正相关（P〈0．01）;与DM组比较,DMR组4周、8周组肾组织TNF-α和NF-κBp65的过度表达均被显著抑制（P〈0．01）,肾组织细胞凋亡数显著减少（P〈0．01）。结论NF-κB及其诱导的TNF-α在糖尿病肾病损伤中发挥重要作用,雷帕霉素可能通过抑制NF-κB和TNF-α的表达减少减轻肾组织细胞凋亡。     

复方丹参注射液对变应性哮喘小鼠脾巨噬细胞TLR2和TLR4 mRNA表达的研究

目的通过观察卵清蛋白（OVA）诱导的变应性哮喘小鼠脾脏巨噬细胞中TLR2和TLR4 mRNA的表达变化,探讨复方丹参注射液（Complex Salvia Mihiorrhiza Injection,SA）对其作用的机制。方法将30只雄性BALB／c小鼠随机分为对照组、模型组和SA组,每组各10只。各组按要求处理于20天后取脾脏,贴壁法分离脾巨噬细胞,通过实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）,检测TLR2和TLR4 mRNA以及GAPDH cDNA的荧光域值循环数,观察SA对TLR2和TLR4 mRNA水平表达的影响。结果与对照组相比,模型组TLR2 mRNA表达明显下调,差异有统计学意义（P〈0．05）,而TLR4 mRNA表达无变化（P〉0．05）;模型组与SA组比较,SA组TLR2和TLR4 mRNA表达均上调,且有统计学差异（P〈0．05）。结论SA能使变应性哮喘模型小鼠脾巨噬细胞中TLR2和TLR4 mRNA水平表达上调,为中药在哮喘治疗中的应用提供了科学依据。     

模拟代谢性内毒素血症对肝损伤小鼠肝组织TLR4信号通路的影响

目的：观察持续4 w的模拟代谢性内毒素血症对小鼠肝脏组织病理和4型Toll样受体（TLR4）信号通路的影响。方法将30只雄性C57BL/6J 小鼠随机分为正常组（n=10）和内毒素组（n=10）,均予以普通饲料喂养,和高脂组（n=10）,予以高脂饲料喂养。内毒素组小鼠同时经腹部皮下植入的微泵注入内毒素300μg·kg-1·d-1,连续4 w,正常组小鼠皮下微泵持续注入生理盐水作为对照。4 w后测定小鼠血清内毒素水平,对肝组织切片行HE染色后进行非酒精性脂肪性肝病评分（NAS）,采样Real time PCR法测定小鼠肝组织TLR4及其下游的MyD88和TRIF-related adaptor molecule （TRAM） mRNA水平。结果内毒素组小鼠血清内毒素水平（0.62±0.04 EU/ml）显著高于正常组（0.50±0.06 EU/ml,P〈0.05）和高脂组（0.49±0.05 EU/ml,P〈0.05）;内毒素组小鼠肝组织主要表现为单纯性脂肪变性,NAS积分为（2.30±0.49）,高脂组小鼠肝组织炎症较明显,NAS积分为（4.20±1.61）,显著高于内毒素组（P〈0.05）;与正常组相比,内毒素组小鼠肝组织TLR4 mRNA 水平上调5.12倍（P＜0.01）,TRAM mRNA水平上调3.46倍（P＜0.01）,而MyD88 mRNA水平与正常组比,无显著差别。结论持续4 w的模拟代谢性内毒素血症可诱导小鼠肝脏单纯性脂肪变性,TLR4 mRNA 和TRAM mRNA水平上调,而MyD88 mRNA水平无显著变化。     

果蝇样受体4介导游离脂肪酸调节人血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1的表达

目的探讨软脂酸对人主动脉血管平滑肌细胞（HA—VSMC）单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）基因表达的调节及果蝇样受体4（TLR4）信号通路的作用。方法采用不同剂量的软脂酸（100、200、400μmol/L）处理HA—VSMC6、12、24h,采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测细胞MCP．1mRNA表达,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测MCP-1蛋白表达,观察软脂酸调节MCP-1表达的剂量依赖关系和时间效应;采用蛋白激酶C（PKC）抑制剂白屈菜红碱、磷脂酰肌醇3激酶（P13K）抑制剂wortmannin、神经酰胺抑制剂myriocin和核因子KB（NF—KB）抑制剂parthenolide分别处理细胞30min,再加入软脂酸（400μmol/L）处理细胞6h后,实时荧光定量PCR检测MCP-1mRNA的表达水平,ELISA检测MCP-1的蛋白表达水平,研究软脂酸调节MCP-1表达依赖的信号通路;构建TLR4短发夹RNA（shRNA）腺病毒pGSadeno-TLR4并感染HA—VSMC沉默TLR4基因表达,实验同时设空白对照组（PBS缓冲液）和对照病毒（pGSadeno-GFP）组。细胞感染96h后更换培养基,再加入软脂酸（400μmoL／L）处理细胞6h,采用实时荧光定量PCR检测MCP-1mRNA表达水平,ELISA检测MCP-1的蛋白表达水平。提取细胞核蛋白,采用ELISA检测NF—KBp65亚基活性,观察TLR4／NF-KB通路在软脂酸调节HA-VSMCMCP-1基因表达中的作用。组间均数比较采用单因素方差分析。结果采用软脂酸处理细胞6h后,对照组及100、200和400μmoVL软脂酸组MCP-1mRNA表达分别为1．00±0．02、3．30±2．84、8．21±4．31和11．25±2．73（F=7．57,P〈0．05）;MCP-1蛋白表达分别为（127±10）、（147±10）、（163±18）和（194±14）ng／L（F=7．81,P〈0．05）。软脂酸可促进HA-VSMCMCP-1mRNA和蛋白表达且具有明显的剂量依赖关系。细胞培养12h和24h后,随着软脂酸浓度的增加,MCP-1mRNA和蛋白表达水平呈逐渐增加趋势,但时间效应则不明显。采用不同的信号通路抑制剂和软脂酸处理细胞6h后,对照组、软脂酸组、软脂酸＋parthenolide组、软脂酸＋白屈菜红碱组、软脂酸＋wortmannin组和软脂酸＋myriocin组MCP-1mRNA表达分别为1．00±0．02、10．80±1．23、3．49±0．28、10．84±0．24、11．24±0．27和10．62±0．36（F=1313．07,P〈0．05）;MCP-1蛋白表达分别为（132±8）、（218±12）、（152±4）、（213±12）、（225±7）和（226±9）ng／L（F=106．83,P〈0．05）。成功地构建并获得TLR4shRNA腺病毒pGSadeno—TLR4,采用pGSadeno-TLR4感染HA—VSMC阻断TLR4信号后,软脂酸＋pGSadeno．TLR4组的NF—KB065结合活性、MCP-1mRNA和蛋白表达均显著低于软脂酸组[分别为0．48±0．12比1．24±0．16、1．88±0．33比10．80±1．23、（154±10）比（218±12）ng／L;F=591．86、659．16、118．37,均P〈0．01]。而对照病毒pGSadeno．GFP对软脂酸诱导的NF—KB065结合活性和MCP：I表达均无明显影响。结论TLR4／NF—KB信号通路介导了软脂酸诱导的人主动脉血管平滑肌细胞MCP-1基因表达。     

TLR4/MyD88/NF-κB信号通路与溃疡性结肠炎

溃疡性结肠炎(UC)是一种发病机制尚未完全明确的非特异性炎症性疾病,免疫反应异常是UC发病的主要原因。研究表明,Toll样受体4(TLR4)通过胞内白细胞介素-1受体(IL-1R)同源结构域,并利用IL-1R下游信号传递分子髓样分化因子88(MyD88)、IL-1R相关激酶(IRAK)、肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF6)等,介导病原体诱导内皮细胞中NF-κB的活化,产生免疫炎性细胞因子,从而导致UC的发生。本文就TLR4/MyD88/NF-κB信号通路与UC的发病作一综述。     

天然蒙脱石对大鼠急性肝衰竭血中内毒素及单核细胞表面Toll样受体4表达的影响

目的研究大鼠急性肝衰竭时血中内毒素（LPS）及单核细胞表面TLR4表达的变化以及天然蒙脱石（思密达）对其表达的影响。方法腹腔注射半乳糖胺建立大鼠急性肝衰竭模型。50只SD雄性大鼠随机分为空白组（A组）、对照组（B组）、模型组（C组）、思密达预防组（D组）和思密达治疗组（E组）。采用双色荧光染色法检测血中LPS;荧光素标记的抗TLR4/抗CD14对大鼠血液单核细胞表面TLR4及CD14分子进行免疫荧光染色,流式细胞仪检测。结果与A组比较,C组、D组和E组LPS及TLR4表达均显著增高（P〈0.01）;与C组比较,D组和E组LPS及TLR4表达显著降低（P〈0.05）;D组与E组相比,D组LPS及TLR4表达较低（P〈0.05）;B组与A组比较LPS及TLR4差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论大鼠急性肝衰竭时,血中LPS及TLR4的表达显著上调,用思密达预防和治疗后显著下调,且预防组下调更为显著。     

神经病理性疼痛大鼠海马组织中NF-κBmRNA、iNOSmRNA、nNOSmRNA表达及意义

目的探讨神经病理性疼痛大鼠模型海马核因子-κB（NF-κB）mRNA、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mR-NA和神经元型一氧化氮合酶（nNOS）mRNA表达及意义。方法将70只雄性Wister大鼠随机分为实验组和对照组各35只,于慢性坐骨神经挤压性损伤（CCI）术前1d及术后1、4,7、14、21、28d测定机械痛阈及热痛阈后处死大鼠,取海马组织,采用RT-PCR法测定NF-κBmRNA、iNOSmRNA、nNOSmRNA水平。结果与对照组及术前比较,实验组术后各时点术侧机械痛阈及热痛阈明显降低;NF-κBmRNA水平于术后4d开始增加,7d达到高峰,术后14、28d仍维持于较高水平（P〈0．05）;iNOSmRNA水平于术后4d开始增加,nNOSmRNA水平于术后7d开始增加,两者均在21d达到高峰,在28d仍维持在较高水平（P〈0．05）。结论CCI参与了神经病理性疼痛的维持,其机制可能为海马组织NF．KB活化并上调iNOS和nNOS表达。     

1,25(OH)_2D_3对去卵巢大鼠骨组织成骨细胞、骨细胞凋亡的影响

目的观察1,25(OH)_2D_3对去卵巢大鼠骨组织中成骨细胞、骨细胞凋亡的影响。方法 36只雌性SD大鼠随机分成四组,对尼尔雌醇组和1,25(OH)_2D_3组分别给予尼尔雌醇(0.1mg/kg)和1,25(OH)_2D_3(0.05μg/kg)治疗12周。12周后,以DXA法测定大鼠全身的骨密度;放射免疫法测定各组大鼠血清中骨钙素及雌二醇的水平;处死各组大鼠,采用3′-OH末端DNA原位标记技术和透射电镜检测骨细胞、成骨细胞凋亡。结果 12周后,去卵巢组大鼠的骨密度和血清雌二醇水平明显降低,骨钙素含量升高,与假手术组相比,差异有显著性(P0.05)。1,25(OH)_2D_3可以增加去卵巢大鼠的全身骨密度和血清骨钙素含量(P0.05),但是不增加血清雌二醇的水平(P0.05)。1,25(OH)_2D_3可以抑制骨细胞、成骨细胞凋亡,与去卵巢组相比差异有显著性(P0.05)。结论 1,25(OH)_2D_3对去卵巢大鼠骨质疏松症具有防治作用,其部分机制可能为1,25(0H)_2D_3抑制了骨细胞、成骨细胞凋亡,从而调节骨重建。