骨髓间充质干细胞对糖尿病大鼠疗效观察

目的 体外诱导骨髓问充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化为胰岛样细胞,用于干预治疗糖尿病大鼠.方法 取周龄大鼠骨髓细胞,进行MSC培养纯化扩增,用bFGF、胰岛素等培养体系诱导MSC向胰岛细胞转化;双硫腙染色鉴定胰岛样细胞.使用链脲菌素(Streptozotocin,STZ)制作糖尿病大鼠模型,将诱导分化的胰岛样细胞移植至糖尿病模型大鼠,观察干预治疗效果.结果 体外诱导MSCs由长梭形变成多角形并逐渐聚集成圆形,双硫腙染色后细胞团成亮红色,表明为胰岛样细胞.糖尿病模型大鼠移植诱导分化胰岛样细胞1周后,多饮、多尿症状减轻,10 d后,血糖值由(21.352±3.150)mmol/L降低为(14.604±3.236)mmol/L,与对照组(22.256±4.051)mmol/L比较,差异无统计学意义(P>0.05);尿糖值由(18.00±1.00)g/L降低为(8.50±0.25)g/L,与对照组(20.00±0.18)g/L比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 骨髓间充质于细胞可在体外诱导分化为胰岛样细胞;骨髓间充质干细胞诱导分化的胰岛样细胞可以降低糖尿病大鼠血糖、尿糖值水平,可能具有治疗糖尿病作用.     

骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内定植研究

目的：观察骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内的定植情况。方法：选择健康SD大鼠34只,按随机数字表法分为MSCs干预组（A组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注MSC 1×106个/mL）,肺气肿模型组（B组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注等体积PBS）及MSC对照组（C组,10只,正常大鼠,尾静脉输注MSCs 1×106个/mL）,正常对照组（D组,4只,正常大鼠,尾静脉输注等体积PBS）,采用烟熏法复制大鼠肺气肿模型。全骨髓培养法体外培养扩增雄性SD大鼠来源的MSCs,经GFP标记细胞后将其经尾静脉注入肺气肿模型SD大鼠体内,24 h内处死大鼠,取肺组织迅速冰冻切片,共聚焦激光显微镜下观察观察转染GPF的间充质干细胞在大鼠肺内定植情况。结果：成功培养具有分化潜能的骨髓间充质干细胞,MSCs传至第4代时有99.5%表达CD44、99.6%表达CD29等间充质干细胞表面标志,仅有0.4%表达CD34、1.0%表达CD45单核细胞以及造血干细胞表型;成功复制大鼠肺气肿模型,香烟烟雾暴露组（A、B组）平均肺泡间隔为（119.0±26.2）μm,高于对照组（C、D组）的（89.8±17.3）μm,差异有统计学意义（P〈0.05）;平均肺泡数为（173.9±68.3）个/mm2低于对照组的（280.3±104.0）个/mm2,差异有统计学意义（P〈0.05）;显微共聚焦发现MSCs经尾静脉注入大鼠体内24 h后可见A组大鼠肺组织内转染绿色荧光蛋白质粒的MSCs,而B组、C组及D组均未见转染荧光。结论：骨髓间充质干细胞经尾静脉输注入后可在肺气肿模型大鼠肺内定植,为MSCs治疗慢阻肺可能提供理论依据。     

大鼠胰岛移植后血管重建和排斥反应的实验研究

目的通过不同移植前和移植后处理,观察移植胰岛的血管重建及功能变化。方法随机将SD大鼠分成3组,未处理组:移植前后均未作处理,只作单纯胰岛移植;抗树突状细胞单克隆抗体处理组:胰岛移植前先将供体胰岛细胞用抗树突状细胞单克隆抗体和补体在体外37℃下共育45min,再移植给受体大鼠;雷帕霉素处理组:胰岛移植后给予受体大鼠1mg/kg/d的雷帕霉素。胰岛的血管密度通过Lecti nFrom Bandeiraea Simplicifolia的荧光染色来评估,胰岛功能通过测定血糖水平来评估。结果3组胰岛在移植后2d时结构松散,均未见毛细血管再生。移植后4、8、10d胰岛呈团块状和条索状,均可见微血管再生。移植后8、10d时雷帕霉素处理组的微血管密度大于抗树突状细胞单克隆抗体处理组和未处理组(P<0.05),而移植后4d时3组之间均无明显差异(P>0.05)。抗树突状细胞单克隆抗体处理组的高血糖缓解时间比未处理组延长2d。雷帕霉素处理组移植后血糖水平一直维持在低水平。结论雷帕霉素在胰岛移植早期对血管重建有着重要的临床意义,并能有效地保护胰岛细胞免受排斥反应的影响。去除供体胰岛中的树突状细胞对防止胰岛移植早期的免疫排斥有一定的...     

自体骨髓基质干细胞移植联合EPO治疗脊髓损伤的研究

目的：探讨自体骨髓基质干细胞（MSCs）移植联合促红细胞生成素（EPO）对大鼠脊髓损伤（SCI）治疗的效果。方法：培养与纯化骨髓基质干细胞。80只SD大鼠制备脊髓损伤模型,随机分为4组：干细胞移植组、EPO组、联合组和对照组。采用BBB法进行运动能力评分和组织切片观察来评定修复情况。结果：三个实验组与对照组相比,差异具有统计学意义（P〈0.05）,三个实验组均可明显促进大鼠运动功能和损伤后组织结构的恢复,其中联合组效果更显著。结论：骨髓基质干细胞移植联合EPO具有促进大鼠脊髓损伤后神经功能的修复。     

糖尿病大鼠血管内皮细胞DNA损伤与凋亡的研究

目的探讨糖尿病（diabetes mellitus）大鼠血管内皮细胞DNA损伤与凋亡的关系。方法制作链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病模型大鼠。16只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、糖尿病大鼠组，分离血管内皮细胞。采用单细胞琼脂糖凝胶电泳检测细胞DNA损伤，采用流式细胞仪分析检测凋亡。结果糖尿病组与对照组血管内皮细胞DNA损伤积分分别为（29．5±6．7）分和（8．6±3．6）分，细胞凋亡率为（10．9±3．5）和（4．4±1．2）。2组之间相比有差异有统计学意义（P〈0．05）。将细胞凋亡率与DNA损伤程度进行了相关分析，发现两者之间呈明显的正相关（r=0．82，P〈0．05）。结论糖尿病大鼠血管内皮细胞有明显的DNA损伤和凋亡，且细胞凋亡与DNA损伤明显相关，但血管内皮细胞DNA损伤和凋亡在糖尿病中的作用尚需进一步的研究。     

诱导分化骨髓干细胞（MSCs）构建膀胱的实验研究

目的分离提起大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,通过组织工程技术．构建组织构建膀胱,为进一步临床应用奠定基础。方法将sD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后,以生长状态良好的骨髓问充质干细胞接种于制备好的聚乳酸一聚乙醇酸支架上,进行体外联合培养,构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程构建膀胱。结果体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好,传代扩增容易,骨髓间充质干细胞在聚乳酸一聚乙醇酸基质中生长良好,可体外构建组织工程膀胱。结论通过利用体外扩增培养的骨髓问充质干细胞制备的上皮细胞可以体外聚乳酸一聚乙醇酸支架构建组织工程膀胱。     

G-SCF联合HGF-MSCs治疗肺动脉高压大鼠的疗效研究

目的探讨重组粒细胞集落刺激因子(G-SCF)联合携带肝细胞生长因子(HGF)基因的骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对野百合碱诱导的实验性肺动脉高压(PAH)大鼠的治疗效果。方法取3周龄雄性SD大鼠骨髓,经贴壁筛选法体外培养并纯化MSCs,利用腺病毒(Ad)介导的基因转染方法,将HGF基因导入MSCs。将50只SD大鼠随机分为5组(每组10只):PAH组,采用腹腔注射野百合碱(60mg/kg)复制PAH模型后,经颈内静脉移植1ml低糖伊戈尔培养基(L-DMEM);MSCs组,复制PAH模型后,移植5×106/L的空腺病毒载体转染的MSCs细胞悬液1ml;G-CSF组,经腹腔注射G-SCF[100μg/(kg.d)],连续5d;HGF组,移植5×106/L携带HGF基因的MSCs细胞悬液1ml;HGF+G-CSF组,移植5×106/L携带HGF基因的MSCs细胞悬液1ml并且经腹腔注射G-SCF[100μg/(kg.d),连续5d。21d后,观察各组血流动力学指标、右心室(RV)与左心室(LV)重量比值(RV/LV比值)、血管密度及血浆中内皮素-1(ET-1)的表达情况。结果 PAH大鼠治疗21d后,实验各组间全身动脉血压无明显差异;HGF+G-SCF组及HGF组中平均肺动脉压较其他各组显著下降(P<0.05);HGF组及HGF+G-SCF组RV/LV比值显著低于其他3组(P<0.05);HGF+G-SCF组血管密度高于其他各组,但差异无统计学意义(P>0.05);HGF组及HGF+G-SCF组血浆中ET-1的含量显著低于PAH组(P<0.05)。结论 G-SCF联合HGF-MSCs移植可有效减轻野百合碱诱导的大鼠PAH的进程,明显改善心功能及血流动力学指标,这些效应可能是通过增加肺血管数量及减少缩血管因子来实现的。     

TRAIL净化自体造血干细胞移植物中白血病细胞的实验研究

目的探讨TRAIL作为自体造血干细胞移植物体外净化剂的可行性。方法常规分离骨髓单个核细胞，分别以PE—DcR1、PE—DcR2荧光染色，荧光显微镜观察观察TRAIL诱骗受体DcR1和DcR2在骨髓单个核细胞的表达及定位。200ng／ml的TRAIL作用骨髓单个核细胞、白血病Jurkat细胞系18h，FITC-Annexin V／PI标记流式细胞仪定量凋亡率，并将经上述处理的骨髓单个核细胞行成纤维细胞集落（CFU—F）培养。将绿色荧光蛋白标记的Jurkat细胞和骨髓单个核细胞混合经200ng／ml TRAIL作用24h，在GM—CSF和EPO作用下行集落培养，第7天计数Jurkat细胞所形成的荧光集落及骨髓单个核细胞所形成的非荧光集落数CFU—GM和BFU—E。结果TRAIL诱骗受体DcR1和DcR2在骨髓单个核细胞均有表达，且主要定位于胞浆和胞膜。200ng／mlTRAIL作用18h，骨髓单个核细胞、Jurkat细胞系凋亡率分别为（5．95±1．23）％、（33．42±2．28）％，2组间差异有统计学意义（P〈0.01）。TRAIL组每4×10^6个骨髓单个核细胞形成CFU—F集落数为235．67±33．56，与对照组249．33±42．72比较差异无统计学意义（P〉0．05）。200ng／mlTRAIL明显抑制Jurkat细胞所形成荧光集落，但基本不影响骨髓单个核细胞CFU—GM和BFU—E的形成。结论TRAIL能选择性地诱导Jurkat细胞凋亡，而对骨髓单个核细胞无明显毒性作用，可用于自体造血干细胞移植物体外净化。     

荧光染料CM—DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外实验

目的探讨荧光染料CM—DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞的效果及其对细胞活力、增殖能力、凋亡等生物学特性的影响。方法用梯度离心加贴壁培养法获取、培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞。取第4代MSCs,分为实验组和对照组,用浓度为6μmol／L的CM—DiI对实验组MSCs进行标记。用台盼蓝染色检测细胞的活力,CCK-8法检测细胞增殖能力,Hoechst33258染色法检测细胞凋亡。细胞标记后用倒置相差荧光显微镜动态观察不同子代MSCs的阳性标记率、荧光衰减情况及细胞生长、形态变化。结果CM—DiI标记后的MSCs发橙红色荧光,高倍镜下显示细胞上有密集排列明亮荧光颗粒。CM—DiI标记后1d、4d、8d、16d、24d细胞标记阳性率分别为100％、（85．2±4．9）％、（42．3±5．1）％、（17．6±3．6）％、（4．4±1．3）％,细胞标记阳性率和荧光强度随传代次数和培养时间的增加而呈显著进行性下降。标记细胞的大小、形态、活力、增殖能力、细胞凋亡与未标记细胞相比无明显差异。结论CM—DiI标记骨髓间充质干细胞简便、有效,对其生物学特性无明显影响,可用于MSCs的短期示踪。     

GFP修饰的骨髓基质干细胞在移植癫痫大鼠脑中存活及迁移

目的探讨骨髓基质干细胞定向移植后在脑中存活时间,为进一步的细胞治疗提供实验基础。方法腹腔注射青霉索建立癫痫模型。24只健康Sprague-DawleySD大鼠,用立体定向仪进行移植。移植骨髓基质干细胞后,分为7d组（8只）,14d组（8只）,28d组（8只）。分别于移植后7d,14d,28d天脑灌注取材,通过荧光观察比较骨髓基质干细胞移植后,7d,14d及28d组的细胞存活数。结果骨髓基质干细胞移植后14d组细胞数少于7d组（P〈0.01）,28d组少于14d组（P〈0.01）。结论移植于癫痫鼠海马内的骨髓基质干细胞移植可以存活,部分细胞会发生迁移,但随时间延长,细胞数逐渐减少。     

胶原酶浓度对大鼠胰岛分离纯化产量的影响

目的观察胶原酶浓度对大鼠胰岛分离纯化产量的影响,筛选出获取高产量胰岛的最佳消化液的胶原酶浓度。方法 75只雄性SD大鼠按胶原酶浓度分为5组：Ⅰ组（0.5 mg/ml）、Ⅱ组（0.75 mg/ml）、Ⅲ组（1.0 mg/ml）Ⅳ组（1.2 mg/ml）和Ⅴ组（1.5 mg/ml）,每组15只。通过胆灌注胶原酶V来消化大鼠胰腺,分离胰岛,采用不连续密度梯度Ficoll离心法纯化胰岛,根据胰岛直径计数所获胰岛的数量及胰岛当量,并利用葡萄糖刺激胰岛素释放试验评估胰岛功能。结果分离的大鼠胰岛具有较好的质量,胰岛纯度为95%左右,活性率为90%左右,体外培养生长良好。随着胶原酶的浓度增加,胰岛数量和胰岛当量明显增加（P〈0.05）,并且最大直径的胰岛数量也在增加（P〈0.05）,在胶原酶浓度1.0 mg/ml时获得的胰岛产量最高,其次为1.2 mg/ml,在其他浓度时,胰岛产量都较低（P〈0.05）。在低糖和高糖刺激下胰岛素的释放分别为（1.346±0.128）ng/ml和（2.565±0.208）ng/ml,差异具有显著性意义（P〈0.05）,刺激指数为（1.908±0.152）,提示胰岛细胞功能良好,电镜照片显示胰岛生长状况良好。结论进行大鼠胰岛分离纯化时最适宜的胶原酶浓度为1.0~1.2 mg/ml,可获得稳定高产量的胰岛,过低和过高的浓度都是不适宜的。     

VEGF转染VEC促进移植皮瓣血管化的实验研究

目的探讨VEGF165基因转染血管内皮细胞促进移植皮瓣血管化的可行性,提高皮瓣存活率。方法利用脂质体介导pIRES2-EGFP/VEGF165质粒体外转染VEC。27只SD大鼠随机分为3组,转染组和内皮细胞组大鼠缺血皮瓣内分别加入1ml浓度为1×106个/亳升的含有转染质粒pIRES2-EGFP/VEGF165血管内皮细胞和未转染正常血管内皮细胞的DMEM培养基,对照组注射相同量DMEM培养基。皮瓣早期断蒂,观察皮瓣的皮瓣存活率、HE染色和CD34免疫组化染色观察血管生成情况,计算微血管密度。结果VEGF165基因转染VEC、单纯的VECC移植大鼠缺血皮瓣后,与对照组的皮瓣存活率分别为98.6%±3.9%、83.2%±3.5%、42.5%±2.1%,差异有统计学意义(p<0.05)。术后第7d时三组皮瓣中点处的毛细血管密度分别为(60.4±6.5)个/毫米2、(58.2±6.3)个/毫米2、(17.8±1.7)个/毫米2;第14d时毛细血管密度分别为(91.9±7.1)个/毫米2、(74.4±6.8)个/毫米2、(28.6±3.7)个/毫米2。结论VEGF165转染血管内皮细胞可以可促进缺血皮瓣的血管新生,提高存活率。     

宫腔粘连模型的建立与评价及对生育力的影响

目的：苯酚胶浆法建立宫腔粘连动物模型并对其生育力进行评价。方法：将大鼠60只，随机分为造模组（30只）、假手术组（15只）、正常对照组（15只），苯酚胶浆法建立宫腔粘连模型。造模术后10d，取造模组15只、假手术组7只、正常对照组7只处死，肉眼观察其官腔改变，并进行大体分级；各组宫腔标本进行HE和Masson染色对其进行纤维化半定量评分，并对比各组的变化；剩余大鼠自然妊娠，妊娠第10天开腹计数子宫内胚胎数目作为评价生育力的指标。结果：造模侧宫腔狭窄甚至闭塞，宫腔粘连纤维化半定量评分显示：造模组（6．6±0．98分）和正常组（0分）、假手术组（-0．5±1．91分）差异有统计学意义（P〈0．001），假手术组和正常组差异无统计学意义（P〉0．05）；妊娠胚胎数造模组（0．2±0．4个）和假手术组（6．3±2．9个）、正常组（6．3±1．8个）差异有统计学意义（P〈0．001）；假手术组和正常组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：苯酚胶浆法可成功建立官腔粘连的动物模型；宫腔粘连的大鼠生育力明显降低。     

两种微囊化成猪胰岛移植疗效的比较

目的　通过对同一来源的成猪胰岛采用两种不同的免疫隔离材料进行微囊化包裹 ,并植入糖尿病大鼠腹腔内加以比较 ,以明确两种方法间的优劣。方法　将同一来源的成猪胰岛分成三组 :未微囊化组、海藻酸钠微囊组和琼脂糖微囊组。 2 4只糖尿病大鼠随机分为 4组 :对照组、未微囊化胰岛移植组、海藻酸钠微囊化胰岛移植组和琼脂糖微囊化胰岛移植组 ,分别进行腹腔内胰岛移植。结果　 4组糖尿病大鼠胰岛移植前血糖水平无显著差异 ,移植后 1周分别为 (2 2 6 7± 1 15)mmol/L ,(18 58± 2 6 2 )mmol/L ,(12 2 7± 1 36 )mmol/L和 (12 38± 2 6 8)mmol/L ,后 2组与前 2组相比均有显著差异 ,且生存期明显长于前 2组 ,但琼脂糖微囊化胰岛组的生存期明显短于海藻酸钠微囊化胰岛组 (分别为平均 57 10d和 145 17d)。结果　两种包膜材料制备的微囊化成猪胰岛均可存活于糖尿病大鼠体内并发挥生物功能 ,但海藻酸钠微囊化胰岛组较琼脂糖微囊化胰岛组的存活期明显延长。     

2型糖尿病肾病大鼠模型的建立及其肾病特点

目的探讨用高脂高糖高能量饲料喂养加小剂量注射链脲佐菌素（STZ）诱导2型糖尿病肾病大鼠模型的可行性及其。肾病特点。方法选用2个月SD大鼠30只按随机数字表法分成正常组（10只）及造模组（20只）。造模组大鼠用高脂高糖饲料喂养10周后．并给予小剂量沣射STZ以诱导2型糖尿病模型。大鼠造模成功后继续予高脂高糖饲料喂养2个月。实验结束时,测定24h尿微量白蛋白、血肌酐、尿素氮等指标,并作肾脏组织的PAS染色切片。结果2型糖尿病模型造模成功组的大鼠体重、胆固醇、甘油三酯、胰岛素水平[（468．7±8．8）g,（1．92±0．27）mmol／L,（1．32±0．34）mmol／L,（38．81±5．39）mU／L]均高于正常组[（436．9±7．4）g,（1．16±0．17）mmol／L,（0．8±0．18）mmol/L,（21．43±4．19）mU／L,t=9．76,8．08,4．44,8．90,P〈0．01];注射STZ两周后,造模大鼠的血糖、胰岛素水平、胰岛素抵抗指数[（19．31±1．55）mmol／L,（31．31±8．60）mU／L,（26．55±6．33）]均高于正常组[（5．45±0．69）mmol／L,（19．97±3．26）mU／L,（4．82±0．84）,t=26．383,3．951,10．719,P〈0．01];实验结束前糖尿病组大鼠的血糖、胰岛素抵抗指数、尿微量白蛋白、肌酐、尿素氮[（19．27±1．97）mmol／L,（16．70±7．51）,（72．49±8．53）mg／24h,（74．76±8．38）txmol／L,（19．09±4．21）mmol／L]均高于正常组[（5．62±0．65）mmol／L,（5．45±1．33）,（15．26±2．20）mg／24h,（40．81±1．97）I~mol／L,（9．87±2．13）mmol／L,t=20．96,4．66,20．62,12．50,6．35,P〈0．01],。肾组织PAS染色显示糖尿病大鼠肾脏病变严重,出现新月体或肾小球硬化等病灶。结论长时间的高脂高糖高能量饲料喂养大鼠,并注射小剂量STZ能够诱导出2型糖尿病肾病大鼠模型,其肾脏发生肾小球系膜细胞增生、新月体及肾小球硬化等病理学改变。大鼠伴有多饮、多尿、多食症状,具有大量蛋白尿,高血肌酐及尿素氮的特点。     

葛根素对糖尿病大鼠视网膜色素上皮衍生因子表达的影响

目的观察葛根素对糖尿病视网膜病变中色素上皮衍生因子（PEDF）表达的影响。方法建立糖尿病大鼠视网膜病变模型,分为空白对照组、糖尿病组和糖尿病葛根素干预组,观察各组不同时期视网膜的病理改变,并应用RT—PCR对PEDF的表达进行分析。结果3、5个月时糖尿病组的体重[（216．9±8．37）g,（179．1±7．56）g]与空白对照组[（298．2±6．78）g,（323．5±6．45）g]比较差异均有统计学意义（g=12．39,P〈0．01;q=15．47,P〈0．01）;糖尿病组和糖尿病葛根素干预组各时点的血糖与空白对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．01,P〈0．05）;HE染色可见糖尿病组大鼠早期即出现糖尿病视网膜病变,而糖尿病葛根素干预组改变轻微。RT．PCR可见在5个月时PEDF在空白对照组、糖尿病组和糖尿病葛根素干预组的表达分别为8．833（1．200）、1．650（3．300）、8．350（1．100）,糖尿病组大鼠视网膜PEDF的表达明显低于空白对照组和糖尿病葛根素干预组（χ2=48．57,P〈0．01;χ2=48．46,P〈0．01）。结论葛根素能够减轻糖尿病大鼠视网膜结构的病理损害,早期干预能够阻止糖尿病视网膜病变过程中PEDF表达的下降,延缓糖尿病视网膜病变的发病进程。