外源性干扰 PVT1表达对结直肠癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的：外源性干扰PVT1表达对结直肠癌（CRC）细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法体外转染小干扰RNA（siRNA）干扰RKO和HCT116细胞PVT1表达（si‐PVT1组）;另设阴性对照siRNA（si‐NC）组。MTT实验和克隆形成实验检测 RKO和 HCT116细胞增殖力,Transwell实验检测RKO和HCT116细胞侵袭力,qRT‐PCR及Western blot检测相关抑癌基因SMAD4的表达。结果与si‐NC组相比,si‐PVT1组RKO和HCT116细胞增殖力抑制（P＜0．05或P＜0．01）,细胞克隆数减少（P＜0．01）,细胞侵袭数目减少（P＜0．05或P＜0．01）,且SMAD4 mRNA和蛋白表达水平均升高（P＜0．05）。结论 PVT1能促进CRC细胞增殖和侵袭,抑制CRC细胞凋亡。     

lncRNA FOXCUT调控Notch通路抑制结肠癌细胞增殖、侵袭的实验研究#br#

目的　研究长链非编码RNA（lncRNA）FOXC1启动子临近转录体（FOXCUT）对结肠癌细胞（HCT116）增殖、侵袭的影响及作用机制。方法　向HCT116细胞转染FOXCUT siRNA（FOXCUT siRNA组）,以转染阴性siRNA为阴性对照组（FOXCUT siRNA-NC组）,未转染组为正常对照组（NC组）,通过qPCR法确定FOXCUT干扰效果,并检测结肠癌及癌旁组织、人结肠癌细胞株（SW480、SW620、HCT116、HT29）和人正常结肠上皮细胞（NCM460）中FOXCUT mRNA表达水平;通过CCK-8、集落形成实验和Transwell实验检测沉默FOXCUT对HCT116细胞增殖、集落形成能力及侵袭能力的影响;qPCR检测沉默FOXCUT后HCT116细胞中Notch1、Hes1 mRNA表达变化;蛋白免疫印迹（Western blot）实验检测HCT116细胞中Notch1、Hes1蛋白表达情况。结果　与癌旁组织比较,结肠癌组织中FOXCUT mRNA表达水平显著增高（P＜0.01）;与NCM460细胞比较,SW480、SW620、HCT116、HT29结肠癌细胞株中FOXCUT mRNA表达水平均显著增高（P＜0.05）,其中以HCT116细胞中表达水平最高;与FOXCUT siRNA-NC组比较,FOXCUT siRNA组HCT116细胞中FOXCUT mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）;NC组、FOXCUT siRNA-NC组HCT116细胞中FOXCUT mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）;沉默FOXCUT可显著抑制细胞增殖、集落形成能力及侵袭（P＜0.05）,并抑制Notch1、Hes1 mRNA及蛋白表达（P＜0.01）。结论　沉默FOXCUT可抑制结肠癌HCT116细胞增殖及侵袭,可能与抑制Notch通路有关。     

半枝莲醇提取物调控circ＿0092283/miR-198对结直肠癌细胞克隆形成和凋亡的影响

摘要：目的:探讨半枝莲醇提取物（EESB）对结直肠癌细胞HCT-116克隆形成和凋亡的影响及可能机制。方法:HCT-116细胞分为不同剂量(0,200,400,800μg·ml-1)EESB组、circ0092283小干扰RNA（si-circ0092283）组、小干扰RNA阴性对照（si-NC）组、400μg·ml-1?EESB+circ0092283过表达载体（pcDNA-circ0092283）组、400μg·ml-1EESB+miR-198抑制剂（anti-miR-198）组,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹（Western Blot）法检测细胞中B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）和B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）蛋白表达,实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测circ0092283和miR-198表达。收集30例结直肠癌患者的癌组织和癌旁组织,培养HCT-116和肠上皮细胞HIEC-6,RT-qPCR法检测组织和细胞中circ0092283和miR-198表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证circ0092283和miR-198调控关系。结果:不同剂量(200,400,800μg·ml-1)的EESB作用于HCT-116细胞或干扰circ0092283表达后,HCT-116细胞克隆形成数和细胞中Bcl-2蛋白表达降低（P<0.05）,细胞凋亡率和细胞内Bax蛋白表达升高（P<0.05）。结直肠癌组织和HCT-116细胞中circ0092283呈高表达,而miR-198呈低表达。circ0092283靶向负调控miR-198。EESB抑制circ0092283表达,而促进miR-198表达;过表达circ0092283或抑制miR-198表达可降低EESB对HCT-116细胞克隆形成、细胞凋亡和Bal、Bax蛋白表达的影响。结论:EESB可能通过调控circ0092283/miR-198轴降低结直肠癌HCT-116细胞的克隆形成能力,并促进HCT-116细胞凋亡。     

LncRNA TMPO-AS1调节miR-340-5p/RUNX1轴对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨长链非编码RNA TMPO反义RNA1(LncRNA TMPO-AS1)调控miR-340-5p/RUNT相关转录因子1(RUNX1)轴对结直肠癌(CRC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 qRT-PCR检测人正常结肠上皮细胞HCoEpiC、人CRC细胞SW480、HCT116、LOVO、HT-29中TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1表达;将HCT116细胞随机分为：si-ctrl组、si-TMPO-AS1组、mimics NC组、miR-340-5p组、si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl组、si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p组;qRT-PCR检测6组HCT116细胞TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1水平;CCK-8法检测HCT116细胞活力;EDU法检测HCT116细胞增殖;Transwell检测HCT116细胞迁移和侵袭;western blot检测HCT116细胞RUNX1、PCNA、MMP-2表达;双荧光素酶报告基因实验分别验证TMPO-AS1和miR-340-5p、miR-340-5p和RUNX1的...     

AGGF1通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进结直肠癌发生发展

目的 研究G补缀FHA域血管新生因子1（angiogenic factor with G-patch and FHA domain 1，AGGF1）调控Wnt/β-catenin信号通路对结直肠癌细胞（colorectal cancer，CRC）增殖、侵袭和上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）的可能机制。方法 通过裸鼠荷瘤免疫组化法检测AGGF1在正常组织和癌组织中的表达。qRT-PCR和Western blotting检测NCM460、SW620、HT29、HCT116、SW480中AGGF1的mRNA和蛋白表达水平。于HCT116细胞中过表达AGGF1，分为Vector组和AGGF1组；于SW620细胞中敲减AGGF1，分为shControl组和shAGGF1组。CCK-8法和克隆形成试验测定细胞活性和细胞克隆数目。划痕试验和Transwell试验检测细胞迁移和侵袭情况。免疫荧光检测细胞E-cadherin、N-cadherin的表达。Western blotting检测细胞E-cadherin、N-cadherin、AGGF1、β-catenin、糖原合酶激酶-3β （glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、p-GSK-3β蛋白表达水平。结果 AGGF1蛋白表达在CRC组织中明显增高。AGGF1 mRNA和蛋白表达水平在HCT116细胞中最低，在SW620细胞中最高。CCK-8法、克隆形成试验、划痕试验和Transwell试验结果显示，在HCT116细胞中，与Vector组比较，AGGF1组48，72，96 h细胞活性、克隆细胞数目、相对迁移距离、侵袭细胞数显著增加（P<0.05或P<0.01）；而在SW620细胞中，与shControl组比较，shAGGF1组结果相反（P<0.05或P<0.01）。免疫荧光和Western blotting检测结果显示，与Vector组比较，AGGF1组E-cadherin荧光表达和蛋白表达水平降低（P<0.01），N-cadherin增强（P<0.05或P<0.01），同时上调AGGF1、β-catenin、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达（P<0.01）；与shControl组比较，shAGGF1组E-cadherin荧光表达和蛋白表达水平显著升高（P<0.01），N-cadherin显著降低（P<0.05或P<0.01），同时下调AGGF1、β-catenin、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达（P<0.05或P<0.01）。结论 AGGF1可通过激活Wnt/β-catenin信号通路异常表达，上调β-catenin、p-GSK-3β、N-cadherin表达，下调E-cadherin表达，促进CRC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT，从而促进CRC发生发展。     

RNA结合蛋白HuR及TTP在结直肠癌中的表达和临床意义

目的:检测RNA结合蛋白HuR及TTP在结直肠癌中的表达,分析两者在结直肠癌发生、发展中的作用、关系。方法:免疫组化法检测83例患者肿瘤组织以及26例癌旁正常组织中HuR及TTP的表达。结果:蛋白HuR在肿瘤细胞质中的表达明显高于癌旁正常组织细胞质中的表达,而蛋白TTP在肿瘤组织中的表达则明显低于癌旁正常组织中的表达。经Spearman等级相关分析HuR和TTP表达呈负相关性(P<0.05)。结论:在结直肠癌的发生发展过程中,信使RNA的稳定因子HuR表达上调,而信使RNA的降解因子TTP下调或缺失。在结直肠癌的发生过程中可能起拮抗作用。胞质HuR蛋白的表达可促进肿瘤发生发展。     

shRNA沉默STAT3基因对结肠癌细胞增殖及顺铂敏感性的影响

目的 构建携带信号转导与转录激活子3（STAT3）基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,观察pGPU6/GFP/Neo- STAT3重组质粒对HCT116细胞顺铂化疗敏感性的影响。方法 设计并构建稳定转录shRNA STAT3的质粒,采用脂质体法转染结肠癌HCT116细胞,Western blot法检测转染后STAT3蛋白表达变化,MTT法检测细胞增殖变化。重组质粒联合顺铂作用于HCT116细胞后,MTT法检测细胞存活率。结果 成功构建了pGPU6/GFP/Neo-STAT3重组质粒,测序证实重组质粒构建正确。重组质粒转染HCT116细胞后,细胞增殖明显受抑制,STAT3蛋白表达降低。重组质粒联合顺铂治疗后,细胞增殖活性显著降低。结论 shRNA STAT3重组质粒能明显降低HCT116细胞中STAT3蛋白的表达,抑制细胞增殖,提高结肠癌细胞对顺铂的敏感性。     

西红花苷抑制NFATc3活性促进与肿瘤成纤维细胞共培养的结直肠癌细胞放射敏感性

目的 探究西红花苷对与肿瘤成纤维细胞（CAFs）共培养的结直肠癌细胞放射敏感性的影响,并探究分子机制。方法 通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质免疫印记（Western blotting）比较人正常结肠上皮细胞NCM460和结直肠癌细胞系SW480、SW620、HCT116、LOVO中活化T细胞核因子c3（NFATc3）表达差异。建立CAFs与HCT116细胞共培养体系,西红花苷处理细胞后经不同剂量（0、2、4、6、8 Gy）X射线照射,细胞克隆形成实验分析细胞存活分数（SF）。再将HCT116细胞分为对照组、6 Gy组、CAFs/HCT116＋6 Gy组、CAFs/HCT116＋西红花苷＋6 Gy组,进行对应处理后,MTT法检测各处理组HCT116细胞活性,流式细胞术检测各处理组HCT116细胞凋亡率,Hoechst 33258染色观察各处理组HCT116细胞凋亡形态,qRT-PCR和Western blotting测定各处理组HCT116细胞中NFATc3表达水平。结果 相较于人正常结肠上皮细胞NCM460,人结直肠癌细胞系SW480、SW620、HCT116、LOVO中的NFATc3 mRNA和蛋白相对表达量均显著上调（P＜0.05）。与HCT116细胞比较,与CAFs共培养的HCT116细胞经辐射后的SF显著增高（P＜0.05）;与CAFs共培养的HCT116细胞比较,与CAFs共培养的HCT116细胞经西红花苷处理再进行辐射的SF显著降低（P＜0.05）。与6 Gy组比较,CAFs/HCT116＋6 Gy组HCT116细胞存活率显著升高（P＜0.05）,细胞凋亡率显著下降（P＜0.05）,细胞内染色也较为均匀,未见致密浓染的凋亡状细胞,细胞中NFATc3 mRNA和蛋白相对表达量均显著上调（P＜0.05）;而与CAFs/HCT116＋6 Gy组比较,CAFs/HCT116＋西红花苷＋6 Gy组HCT116细胞存活率显著降低（P＜0.05）,细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）,细胞中有较多致密浓染、碎裂荧光块,同时,细胞中NFATc3 mRNA和蛋白相对表达量显著下调（P＜0.05）。结论 西红花苷能够明显提高与CAFs共培养的结直肠癌HCT116细胞的放射敏感性,从而促进细胞发生凋亡,该作用可能与抑制NFATc3有关。     

m6a甲基转移酶METTL3调控KAI1/CD82表达介导垂体神经内分泌肿瘤细胞生物学行为的机制研究

目的 研究m6a甲基转移酶METTL3调控KAI1/CD82表达介导垂体神经内分泌肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭的机制。方法 通过实时荧光聚合酶链反应（qPCR）和蛋白免疫印迹测定大鼠垂体细胞、大鼠垂体神经内分泌肿瘤细胞系GH3和MMQ中的METTL3与KAI1/CD82表达水平。体外培养GH3细胞，将其随机分为对照组、METTL3过表达质粒组、METTL3空质粒组、METTL3 siRNA组、METTL3 siRNA阴性对照组，经分组转染后，通过qPCR和蛋白免疫印迹检测各组细胞METTL3与KAI1/CD82表达；通过CCK-8实验检测各组细胞活力；通过细胞划痕、Transwell侵袭实验检测各组细胞迁移侵袭情况；通过甲基化RNA免疫共沉淀（MeRIP）实验检测各组细胞KAI1/CD82 m6A甲基化修饰情况。结果 相比大鼠垂体细胞，大鼠垂体神经内分泌肿瘤细胞系GH3及MMQ中的METTL3蛋白及mRNA表达水平明显升高，KAI1/CD82蛋白及mRNA表达水平明显降低（P<0.05）。与对照组相比，METTL3空质粒组、METTL3 siRNA阴性对照组细胞各指标差异无统计学意义...     

TGF-β1对结直肠癌细胞株侵袭转移及IL-22表达的影响

目的 探讨转化生长因子β1（TGF-β1）对结直肠癌细胞株侵袭转移及白细胞介素22（IL-22）蛋白表达的 影响。方法 以结直肠癌HCT116细胞株为研究对象,以不同浓度（0、5、10、15、20、30、50 μg/L）TGF-β1处理24、48 h 后,CCK-8法检测结直肠癌HCT116细胞体外增殖情况;将结直肠癌HCT116细胞株分为对照组和10 μg/L TGF-β1 处理组。Transwell侵袭迁移实验和划痕实验检测TGF-β1对HCT116细胞侵袭迁移能力的影响;采用RT-PCR检测 TGF-β1对HCT116细胞TGF-β1、IL-22 mRNA表达的影响;免疫细胞化学染色和Western blot 检测HCT116细胞中 TGF-β1、IL-22、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达水平。结果 CCK-8结果显示, 0、5、10、15、20、30、50 μg/L TGF-β1 溶液刺激 24、48 h 后,不同 TGF-β1 浓度处理组结直肠癌 HCT116 细胞光密度 （OD）值差异均无统计学意义（均P＞0.05）。10 μg/L TGF-β1处理HCT116细胞48 h后,细胞侵袭能力、迁移能力和 迁移距离均明显升高（均P＜0.01）;TGF-β1处理组TGF-β1 mRNA表达水平明显高于对照组,而IL-22 mRNA表达水 平明显低于对照组（均P＜0.01）;免疫细胞化学染色和Western blot结果显示,TGF-β1处理组TGF-β1、STAT3蛋白表 达水平明显高于对照组,而IL-22、E-cadherin蛋白表达水平明显低于对照组（均P＜0.05）。结论 TGF-β1可能促进 HCT116细胞侵袭和迁移,但对HCT116细胞的增殖影响不明显,结直肠癌HCT116细胞中TGF-β1可能抑制IL-22蛋 白的表达。     

缺氧诱导因子-1α对结直肠癌细胞上皮间质转化及 侵袭迁移的影响

摘要： 目的 探讨缺氧是否能促进不同分化程度结直肠癌细胞上皮间质转化 （EMT）, 并分析缺氧对结直肠癌细 胞侵袭、 迁移的影响。方法 分别选取 HCT116（低度分化）和 HT-29（高度分化）结直肠腺癌细胞。观察 0、 10、 25、 50、 100 及 150 mg/L 氯化钴 （CoCl2） 诱导 2 种细胞 48 h 后的形态变化。分析 0、 10、 25、 50 及 100 mg/L CoCl2 处理 48 h 后缺氧诱导因子 （HIF） -1α蛋白表达变化, 筛选出 CoCl2诱导细胞缺氧的最适合浓度。MTT 实验检测不同时间点 （0 、 24 、 48 、 72 及 96 h） CoCl2诱导 2 种结直肠癌细胞的增殖情况, 筛选出 CoCl2诱导缺氧的最佳时间。最佳浓度和时间 条件下, 对 HCT116 和 HT-29 细胞分别进行缺氧 （缺氧组） 和常氧 （常氧组） 处理, Transwell 侵袭和划痕实验检测 2 组 2 种细胞的侵袭、 迁移情况; Western blot 实验和 RT-PCR 实验检测 2 组 HIF-1α、 E-cadherin 及 Vimentin 的蛋白及 mRNA 表达水平。结果 50 mg/L CoCl2作用 48 h 时 2 种细胞均出现明显的形态改变。2 组 HCT116、 HT-29 细胞的 HIF-1α蛋白表达水平随 CoCl2浓度增加均呈先增后减趋势, 50 mg/L 为最适宜浓度 （P < 0.05）。0~96 h 时 2 种细胞不 论有无缺氧, 细胞增殖能力均呈先增后减趋势 （P＜0.05）, 48 h 为最佳作用时间。HCT116 和 HT-29 细胞系中缺氧组 穿膜细胞数和细胞迁移率均明显高于常氧组 （P＜0.05）。HCT116、 HT-29 细胞系中缺氧组 HIF-1α、 Vimentin 的蛋白 和 mRNA 表达水平均高于常氧组, 而 E-cadherin 的蛋白和 mRNA 表达水平低于常氧组（均 P＜0.05）。结论 缺氧 能诱导不同分化程度结直肠癌细胞均发生 EMT, 并能增强 2 种结直肠癌细胞的侵袭、 迁移能力。     

紫草素对人结肠癌细胞HCT116自噬和凋亡的影响

目的:研究紫草素对人结肠癌细胞HCT116自噬和凋亡的影响。方法:以0(空白对照)、10、20、40μg/mL紫草素作用于HCT116细胞48 h后,采用MTT法检测细胞增殖抑制率;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;分别采用实时荧光定量-聚合酶链式反应法和Western blotting法检测细胞中微管相关蛋白轻链3(LC3)和自噬相关蛋白Beclin-1、p62的mRNA及其蛋白表达水平。结果:与空白对照比较,10、20、40μg/mL紫草素作用48 h后HCT116细胞的增殖抑制率和凋亡率均显著升高(P<0.05或P<0.01)。10、20、40μg/mL紫草素作用于HCT116细胞48 h后均可不同程度地升高细胞中LC3、Beclin-1、p62 mRNA及其蛋白的表达水平,除10μg/mL紫草素作用后细胞中LC3 m RNA表达水平升高不显著外,其余指标水平与空白对照比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:紫草素可诱导人结肠癌细胞HCT116发生凋亡,并激活其自噬途径。     

红景天苷通过抑制STAT3活化调控结肠癌细胞增殖和转移

目的：研究红景天苷对结肠癌细胞增殖和转移的抑制作用,并探讨其分子机制。方法：采用平板克隆和CCK-8法检测结肠癌HCT116细胞活力,Transwell观察细胞侵袭与迁移能力,蛋白质印迹法检测增殖蛋白[c-Myc,细胞周期蛋白D1（cyclinD1）]、侵袭转移相关蛋白[E-钙黏附蛋白（E-cadherin）和基质蛋白酶9（MMP-9）]及JAK2/STAT3信号通路蛋白[STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）、JAK2和磷酸化JAK2（p-JAK2）]的表达。结果：平板克隆和CCK-8实验显示,与对照组相比,0.5,1,2 μg·mL^-1红景天苷显著抑制HCT116细胞的增殖,且在该范围内有浓度依赖性。Transwell实验显示,0.5,1,2 μg·mL^-1红景天苷分别作用于HCT116细胞24 h,细胞的侵袭、转移能力也逐渐降低（P<0.05）。蛋白质印迹法检测结果显示：与对照组相比,0.5,1,2 μg·mL^-1红景天苷组c-Myc、cyclinD1、MMP-9、p-STAT3、p-JAK2蛋白水平均明显降低（P<0.05）,E-cadherin蛋白水平均升高（P<0.05）,而JAK2、STAT3蛋白水平无明显差异（P>0.05）。与红景天苷组比较,红景天苷+Y705D组细胞增殖能力增强,迁移和侵袭细胞数增多（P<0.05）,p-STAT3,c-Myc,cyclinD1,MMP-9蛋白表达增加,E-cadherin蛋白表达减少（P<0.05）;而与Y705D组比较,红景天苷+Y705D组细胞增殖能力减弱（P<0.05）,迁移和侵袭细胞数减少（P<0.05）,p-STAT3、c-Myc、cyclinD1、MMP-9蛋白表达减少（P<0.05）,E-cadherin蛋白表达增加（P<0.05）。结论：红景天苷抑制结肠癌细胞增殖和转移,其作用机制与抑制STAT3信号通路有关。     

circMTO1调控Wnt/β-catenin抑制乳腺癌细胞增殖和转移能力的机制研究

目的 研究环状RNA MTO1（circMTO1）对乳腺癌细胞增殖和转移的影响及其可能机制。方法 收集102例浸润性乳腺癌患者的癌组织及癌旁组织,选用乳腺癌细胞系MDA-MB-231、HCC-70、MCF-7和人乳腺正常细胞系MCF-10A,采用荧光定量PCR（qPCR）检测circMTO1在乳腺癌组织和细胞系中的表达水平。分别构建circMTO1过表达和circMTO1敲减质粒转染乳腺癌细胞系,分为NC组、oe-circMTO1组和sh-circMTO1组,qPCR检测转染效果。MTS实验检测各组细胞增殖能力,Transwell实验检测各组细胞转移能力。TOP/FOP荧光素酶实验检测各组细胞Wnt/β-catenin信号通路活性,Western blot检测各组细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt3a、β-catenin、cMyc、Cyclin D1和基质金属蛋白酶7（MMP7）的表达。结果 与癌旁组织和人正常乳腺细胞系相比,circMTO1在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中的相对表达量降低（P<0.05）。有淋巴结转移和TNM分期为Ⅲ期的乳腺癌患者组织中circMTO1的相对表达水平较低（P<0.05）。与NC组相比,oe-circMTO1组circMTO1相对表达量增加,细胞的增殖、转移能力以及Wnt/β-catenin信号通路活性减弱,Wnt3a、β-catenin、cMyc、Cyclin D1和MMP7蛋白表达水平降低（P<0.05）;sh-circMTO1组circMTO1相对表达量降低,细胞的增殖、转移能力以及Wnt/β-catenin信号通路活性增强,Wnt3a、β-catenin、cMyc、Cyclin D1和MMP7蛋白表达水平增加（P<0.05）。结论 circMTO1在乳腺癌细胞中呈低表达,circMTO1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活性,从而抑制乳腺癌细胞的增殖和转移能力。     

HuR基因的慢病毒干扰载体构建及其病毒包装

目的 构建人HuR基因慢病毒干扰载体和基因敲低细胞株,为揭示C/EBPβ3'UTR RNA 与HuR蛋白相互作用抑制肝癌细胞增殖的分子机制奠定基础.方法 根据shRNA设计原则设计人HuR基因的shRNA序列,用化学合成法合成shDNA序列,以LV10(pGLVU6/RFP/Puro)为载体骨架,构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,并与慢病毒包装辅助载体(pLP1、pLP2和pLP/VSVG)共转染HEK293T细胞,收集病毒液纯化后感染SMMC-7721细胞并用嘌呤霉素杀死未感染的肝癌细胞,荧光显微镜下挑取单克隆红色荧光细胞集落,扩大培养后通过Western blot验证肝癌细胞内源性HuR蛋白表达.结果 经DNA测序鉴定,LV10-HuR正是所需的慢病毒干扰载体.通过共转染获得的重组慢病毒颗粒感染的肝癌细胞在荧光显微镜下显示红色荧光.嘌呤霉素筛选和单克隆细胞集落挑取获得显示红色荧光细胞株,western blot证明稳转细胞内源性HuR基因表达下降,证明LV10-HuR慢病毒干扰载体可以抑制肝癌细胞内源性HuR基因表达.结论 成功构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,包装出有活性的重组慢病毒颗粒,建立HuR基因敲低肝癌细胞株.     

转录因子Snail促进结直肠癌细胞对奥沙利铂耐药的机制研究

目的 研究转录因子Snail促进结直肠癌细胞HCT116对奥沙利铂产生耐药性的分子机制.方法 采用MTT法分别检测过表达Snail蛋白和空载质粒的HCT116细胞对奥沙利铂的敏感性差别,以及RNA敲除-糖蛋白(P-gp,编码基因ABCB1)蛋白的HCT116细胞对奥沙利铂的敏感性的影响.实时定量PCR方法检测过表达Snail对耐药相关基因表达的影响.蛋白质免疫印迹技术Western blot检测过表达Snail对P-gp蛋白表达的影响.结果 过表达转录因子Snail可以明显促进结直肠癌细胞HCT116对奥沙利铂产生耐药性.实时定量PCR结果表明:过表达Snail明显提高了P-gp蛋白编码基因ABCB1的表达,而对其它耐药基因如ABCC1、ERCC1等没有明显影响.Western blot结果显示过表达Snail可以促进P-gp蛋白的表达.敲除P-gp蛋白可以明显提高HCT116细胞对于奥沙利铂的敏感性.结论 过表达Snail可以明显促进结直肠癌细胞HCT116对奥沙利铂的耐药性,其机制与Snail促进耐药蛋白P-gp的表达有关.     

lncRNA SOX21-AS1的表达对卵巢癌细胞增殖和转移能力的影响及机制研究

目的 探讨长链非编码RNA SRY-box转录因子21反义RNA 1（lncRNA SOX21-AS1）对卵巢癌细胞增殖和转移能力的影响及其作用机制。方法 选取卵巢癌组织和其邻近的癌旁组织各75例,另选取卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、OVCR3和人卵巢正常上皮细胞HOSE作为实验对象,实时荧光定量PCR法检测lncRNA SOX21-AS1在组织和细胞中的表达。根据是否干扰lncRNA SOX21-AS1表达将细胞分为si-NC组和si-SOX21-AS1组。MTS实验和平板克隆实验检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞转移能力,TOP/FOP荧光素酶实验和Western blot实验检测细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性和相关蛋白表达水平。结果 与癌旁组织相比,lncRNA SOX21-AS1在卵巢癌组织中的表达上调（P<0.05）。与卵巢正常上皮细胞HOSE相比,lncRNA SOX21-AS1在卵巢癌细胞中的表达上调,SKOV3中最高（P<0.05）。与FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期、无淋巴结转移的患者相比,FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、有淋巴结转移患者lncRNA SOX21-AS1相对表达水平升高（P<0.05）。干扰lncRNA SOX21-AS1表达可抑制卵巢癌细胞增殖和转移能力、抑制Wnt/β-catenin信号通路活性并降低Wnt/β-catenin信号通路各蛋白的表达水平（P<0.05）。结论 lncRNA SOX21-AS1在卵巢癌组织和细胞中高表达,干扰lncRNA SOX21-AS1的表达可抑制卵巢癌细胞增殖和转移能力。