鼠抗人OX40功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的：研制功能性鼠抗人OX40单克隆抗体。方法：以转人OX40的转基因细胞L929-OX40为免疫原，常规免疫6—8周龄的雌性BALB／c小鼠；采用B淋巴细胞融合技术，将免疫小鼠脾脏细胞与SP2／0融合，以L929-OX40转基因细胞及PHA活化的T细胞为抗体筛选阳性细胞，经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养；采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析了该单抗的亚类及抗原识别位点；采用MTT法分析单抗在体外对T细胞的促增殖效应以及ELISA分析活化T细胞分泌的细胞因子。结果：获得1株持续、稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为7E11)，该单抗能特异性地识别人OX40分子和介导有效的共刺激信号，体外促进活化的T细胞增殖和细胞因子的分泌。结论：成功研制成一株能分泌功能性鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤，该抗体特异性地识别人OX40分子并具有在体外协同刺激T细胞的作用。     

鼠抗人OX40L功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的　鼠抗人OX4 0L分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定。方法以高表达人OX4 0L分子的转基因细胞L92 9/OX4 0L为免疫原 ,常规免疫BALB/c小鼠 ,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合 ,并以L92 9/OX4 0L为阳性抗体筛选细胞 ,L92 9/mock为阴性抗体筛选细胞 ,经免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养 ,筛选出特异分泌鼠抗人OX4 0L分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ;采用Westernblot、Ig亚型快速定性试纸法、间接免疫荧光法、竞争结合抑制试验和3 H TdR增殖试验等对单抗进行生物学特性的鉴定。结果　成功获得 3株持续、稳定分泌鼠抗人OX4 0L单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,命名为 9H10、4C12和 1G1。对单抗的生物学功能的研究结果表明 ,3株单抗均能识别活化B细胞和成熟DC表达的OX4 0L分子 ,且能抑制成熟DC对T细胞的促增殖作用 ,并与阻断型抗人B7 1单抗具有协同作用。结论　获得的 3株分泌鼠抗人OX4 0L功能性单克隆抗体的杂交瘤 ,所分泌的抗体具有特异性地识别人OX4 0L分子并能阻断OX4 0 /OX4 0L共刺激信号及抑制DC对T细胞的激发作用。     

ICOS/GL50信号在T细胞依赖性体液免疫应答中的作用

研究ICOS/GL5 0信号在T细胞体外增殖、细胞因子分泌以及B细胞抗体分泌中的作用 ,进一步探讨该信号途径在机体体液免疫应答中的作用机制。采用3 H TdR检测GL5 0 L92 9转染细胞和特异性鼠抗人GL5 0单抗对T细胞体外增殖的作用 ;ELISA法检测GL5 0 L92 9转染细胞和抗人GL5 0单抗对T细胞分泌IL 2、IL 10以及ICOS L92 9转染细胞和特异性鼠抗人GL5 0单抗对PWM介导的B细胞分泌抗体的效应。结果提示GL5 0 L92 9转染细胞能够促进经抗CD3单抗活化的T细胞增值和分泌IL 10 ,而抗GL5 0单抗可以阻断这些效应。ICOS分子与B细胞上GL5 0分子的结合上调PWM介导的B细胞分泌抗体而抗GL5 0单抗则下调这一效应。这些表明 ,ICOS/GL5 0信号途径在机体T细胞依赖的体液免疫应答反应中发挥着重要的调节作用     

鼠抗人4-1BB单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的:鼠抗人4-1 BB分子功能性单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:以高表达人4-1 BB分子的转基因细胞293T/4-1 BB为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以293T/4-1BB为阳性抗体筛选细胞,293T/mock为阴性抗体筛选细胞,经免疫荧光标记和流式细胞术(FCM)分析、反复筛选和多次克隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人4-1BB分子mAb的杂交瘤细胞株;采用Western blot、间接免疫荧光法、竞争结合抑制试验、3H掺入和细胞凋亡分析等方法对mAb进行生物学特性的鉴定.结果:成功获得3株持续、稳定分泌鼠抗人4-1BB mAb的杂交瘤细胞株,命名为1G5、4B11和9F11.对mAb的生物学功能的研究结果表明,3株mAb均能识别活化T细胞和单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DC)表达的4-1BB分子.mAb 4B11能有效地激发T细胞体外增殖、抑制其凋亡,并能促进Mo-DC体外扩增,上调CD80、CD83、CD86和CD1α的表达.结论:获得的3株分泌鼠抗人4-1BB mAb的杂交瘤,所分泌的抗体具有特异性地识别人4-1BB分子;其中4B1 1 mAb具有激发T细胞增殖及促进Mo-DC体外扩增与成熟的作用,为激发型4-1BB mAb.     

鼠抗人PD-L1功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的:研制特异性鼠抗人PD-L1单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:以高表达人PD-L1分子的基因转染细胞L929/PD-L1为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以L929/PD-L1细胞为抗体筛选细胞,L929/mock细胞为对照细胞,经选择性克隆化培养及流式细胞术(FCM)分析,筛选稳定和持久分泌鼠抗人PD-L1 mAb的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、Western blot、间接免疫荧光法和竞争结合抑制实验等方法对mAb进行生物学特性鉴定;继而体外实验分析mAb对T细胞增殖的影响。结果:成功获得3株鼠抗人PD-L1mAb,分别命名为11G8,2G5和5C3;对其生物学功能的研究结果显示,3株mAb均能识别活化T细胞表面PD-L1分子,和在体外显著促进T细胞的增殖。结论:获得的3株鼠抗人PD-L1功能性mAb,通过阻断PD-1/PD-L1抑制途径能够有效增强T细胞体外增殖,这为进一步研究PD-1/PD-L1信号通路提供了物质基础。     

一株鼠抗人BTLA功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性鉴定

为了研制鼠抗人BTLA功能性单克隆抗体,以高表达人BTLA分子的基因转染细胞L929/BTLA为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以基因转染细胞293T/BTLA和293T/mock作为抗原,筛选阳性杂交瘤克隆,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复鉴定和多次克隆化培养,筛选获得分泌特异性鼠抗人BTLA分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、细胞核染色体计数、竞争结合抑制试验和T增殖抑制试验等对单抗进行生物学特性的鉴定。结果表明,成功获得一株持续、稳定分泌鼠抗人BTLA单克隆抗体的杂交瘤细胞株8H9,该单抗可特异性识别基因转染细胞以及静止与活化T淋巴细胞上表达的BTLA分子,单抗8H9和BTLA交联后能显著抑制鼠抗人CD3单抗对T细胞激发的增殖作用。     

一株鼠抗人PD-1功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

研制特异性鼠抗人PD-1功能性单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。以高表达人PD-1分子的基因转染细胞L929/PD-1作为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以L929/PD-1作为抗体筛选细胞,L929/mock为对照细胞,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,筛选出分泌特异性鼠抗人PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Western blot、Ig亚型快速定性试纸法、间接免疫荧光法、竞争结合抑制试验和MTT增殖实验对单抗进行生物学特性的分析。结果表明,成功获得1株特异、稳定分泌鼠抗人PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为6E2。对6E2生物学功能的研究结果提示,该单抗能够识别活化T细胞表达的PD-1分子,且在体外能够显著抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌。获得的特异性鼠抗人PD-1功能性单克隆抗体,通过激发PD-1负性途径能够有效抑制T细胞的功能,为进一步研究PD-1信号奠定了物质基础。     

一株识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的单克隆抗体的研制及其生物学功能研究

目的:以本科室发现肿瘤细胞上表达的CD40 787AA突变为基础,研制识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的单克隆抗体(mAb),并对其生物学特性作初步分析.方法:以转人CD40突变体转基因细胞L929-CD40mu为免疫原,免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞融合技术,将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0融合,以L929-CD40mu转基因细胞为抗体筛选阳性细胞,免疫荧光标记法对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养;采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析该mAb的亚类及抗原识别位点;免疫印迹法对该mAb进行鉴定;采用MTT法分析mAb在体外对肿瘤细胞的抑制增殖效应以及PI-annexin V方法进行细胞凋亡测定.结果:获得1株稳定分泌鼠抗人CD40mu mAb的杂交瘤细胞株(命名为10C5),该mAb能特异性地识别人肿瘤细胞株H08910表达的CD40突变体分子,而不识别正常扁桃体B淋巴细胞及血管内皮细胞表达的CD40分子,并且能够在体外促进肿瘤细胞凋亡.结论:成功地研制出1株特异性识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的mAb,该mAb具有体外抑制肿瘤细胞生长并促进其凋亡的作用.     

鼠抗人B7-H4单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

研制鼠抗人B7-H4单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步研究。采用稳定高表达B7-H4分子的基因转染细胞株293T/B7-H4为免疫原免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术融合、流式细胞术筛选和克隆化培养后,最终获得一株鼠抗人B7-H4单克隆抗体(mAb),建立了稳定的杂交瘤细胞株;采用快速试纸条定性法鉴定其抗体亚型,通过western blot和细胞免疫组化鉴定其识别特异性,并与商品化抗人B7-H4抗体(美国BioLegend.克隆号MIH43)进行位点竞争;T细胞体外增殖抑制实验初步鉴定其生物学特性。成功获得的杂交瘤细胞株命名为287;快速试纸条鉴定其Ig亚型为IgG1,K链;western blot和细胞免疫组化结果显示,2B7能特异性识别B7-H4分子;位点竞争实验表明,287与商品化抗体MIH43识别不同的抗原表位。生物学功能实验结果显示,287能阻断B7-H4对T细胞体外增殖的抑制效应。单克隆抗体2B7的成功研制,为深入研究B7-H4的生物学功能和临床应用提供了有价值的工具。     

一株鼠抗人HVEM单克隆抗体的研制及初步鉴定

研制鼠抗人单纯疱疹病毒侵入介质(HVEM)的功能性单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步分析。以高表达人HVEM分子的基因转染细胞L929/HVEM作为免疫原,常规免疫小鼠并进行融合,以L929/HVEM作为抗体筛选细胞,L929/mock为对照细胞,筛选出分泌特异性鼠抗人HVEM单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用western blot、间接免疫荧光法和MTT增殖实验对单抗进行生物学特性的分析。结果显示,成功获得一株特异性鼠抗人HVEM的杂交瘤细胞株,命名为2B11。该单抗能够识别肿瘤细胞表达的HVEM分子,且在体外能够显著抑制HVEM介导的T细胞增殖和细胞因子的分泌,从而为进一步研究HVEM介导的免疫学效应提供了物质基础。     

利用基因重组抗原研制人CD20单克隆抗体及其功能的研究

目的　利用基因重组抗原免疫小鼠 ,制备人CD2 0单克隆抗体 ,研究其特异性和功能。方法　用表达重组人CD2 0基因的细胞NIH 3T3免疫BALB c小鼠 ,取其脾细胞与Sp2 0细胞融合 ,以间接免疫荧光法筛选杂交瘤上清。免疫沉淀法及流式细胞术鉴定其识别抗原的相对分子质量 (Mr)和特异性 ;以MTT法、流式细胞术及形态学方法检测诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的功能。结果　利用杂交瘤技术获得了 1株抗人CD2 0的单克隆抗体 1 2 8,它具有CD2 0抗体特异的细胞反应谱 ,其识别的抗原Mr 为 33× 10 3 。MTT实验证实 1 2 8能显著抑制Daudi和Raji细胞生长。结论　利用基因重组抗原制备了 1株能够稳定分泌抗人CD2 0的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1 2 8,此单抗具有抑制CD2 0阳性细胞增殖和诱导其凋亡的功能。     

抗人CD38单克隆抗体的制备、鉴定及其功能的初步研究

目的：研制抗人CD38抗原分子的单克隆抗体，进一步研究其生物学功能。方法：采用高表达CD38抗原的Daudi细胞免疫Balb/c小鼠；取其脾细胞与SP2/0细胞融合；用间接免疫荧光法进行杂交瘤筛选；流式细胞术、免疫沉淀法与CD38分子原核表达产物的Western-blot分析鉴定单克隆抗体的特异性。以MTT（四甲偶氨唑盐）法检测单克隆抗体抑制细胞增殖以及介导补体杀伤靶细胞的功能。结果：获得了一株抗人CD38分子的单克隆抗体1C6，流式细胞术显示它具有CD38抗原特异的细胞反应谱，其识别的抗原分子质量为45000u。与CD38分子原核表达产物的Western-blot分析表明，其可特异识别CD38分子胞外结构域。MTT法显示其可介导补体杀伤靶细胞。结论：成功制备了抗人CD38分子的单克隆抗体，并进行了初步的功能研究。     

人胎盘层粘连蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的获得能特异性识别人层粘连蛋白（hLN）的单克隆抗体（McAb）。方法用纯化的人层粘连蛋白（hLN）作抗原免疫Balb/C小鼠,以细胞融合、酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选和克隆化技术获得抗hLN的杂交瘤细胞株;用生物学方法鉴定杂交瘤细胞,用免疫学方法鉴定McAb的特异性。结果获得4株稳定分泌抗人LN的杂交瘤细胞株（2A1、3B5、2C4、4D1）,培养上清的ELISA效价分别为：1∶512、1∶1024、1∶512、1∶256;腹水效价分别为：1×10^6、1×10^7、1×10^6、1×10^5;采用ELISA相加法表明2A1、4D1与3B5、2C4识别的hLN上的抗原决定簇和识别的不同,4株单抗均属实IgG。结论成功建立了4株稳定分泌抗人LNMcAb的杂交瘤细胞株,它们分别识别hLN上2个不同的抗原位点,有望作为hLN定量检测的特异性抗体。     

抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的研制和初步应用

本文采用体细胞杂交瘤技术和酶联免疫吸附试验筛选技术,获得了6株持续分泌抗人甲状腺球蛋白 McAb 的杂交瘤细胞系。这6种 McAb 对人 T_3/T_4、及家兔、小牛、大鼠的甲状腺球蛋白均无交叉反应,但其中4种 McAb 对狗甲状腺球蛋白有不同程度的交叉反应,包括2种 McAb对人甲状腺微粒体也有交叉反应,余2种 McAb 均无交叉反应。将所得杂交瘤细胞接种 BALB/c鼠腹腔,获得高效价的腹水 McAb。本文还以这些 McAb 用免疫组化法,研究和检测病理甲状腺组织中甲状腺球蛋白的可能性进行了初步探索,并讨论了其临床意义。     

鼠抗粒细胞集落刺激因子单克隆抗体的研制

本文运用杂支瘤技术，成功地建立了６株能稳定分泌小鼠杭重组人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）单克隆抗体的杂交瘤细胞１Ｂ９Ｄ１０、１ＧＳＦ１０、２Ｃ８Ｃ１、２Ｅ４Ｆ６、３Ｃ６Ｅ１１、７Ｄ２Ｃ７）。试验结果表明，６株单抗均为１ｇＧ类，且特异性强，能分别识别不同的抗原结合位点，相对亲和力２Ｅ４Ｆ６单抗最高，１ＧＳＦ１０最低，为今后Ｇ－ＣＳＦ单抗的应用打下了基础。     

人巨细胞病毒单克隆抗体的研制检定和应用

采用人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＡＤ１６９株作为免疫原，制备出１３株鼠－鼠杂交瘤细胞系。对其中的６株进行了检定．免疫印迹试验结果表明：单克隆抗体（ＭｃＡｂ）７Ｂ４、７Ｄ７、７Ｅ１１、８Ｅ８和８Ｄ６相对应的ＨＣＭＶ多肽分子量分别为４６、１５０、３８、５１７２和６５ｋＤ．ＨＣＭＶ感染人胚肺二倍体细胞（２ＢＳ）后不同时间制成抗原片，与ＭｃＡｂ作间接免疫荧光试验。结果表明：ＭｃＡｂ８Ｂ８相应的病毒多肽为即刻早期抗原，其它５株ＭｃＡｂ相应的病毒多肽均为晚期抗原，６株ＭｃＡｂ等量混合后，标上辣根过氧化物酶，用于ＩｇＭ抗体捕获法ＥＬＩＳＡ（ＭａｃＥＬＩＳＡ）中，并与间接ＥＬＩＳＡ（ＩＥＬＩＳＡ）同时检测ＨＣＭＶ－ＩｇＭ．在未经选择的１００份脐带血中，两法均为阳性的３份，两法均为阴性的９４份；ＭａｃＥＬＩＳＡ阳性而ＩＥＬＩＳＡ阴性的２份血清的特异性试验证明，ＨＣＭＶ－ＩｇＭ确为阳性．ＩＥＬＩＳＡ阳性而ＭａｃＥＬＩＳＡ阴性的１份血清的特异性试验证明，它是由ＲＦ引起的假阳性。     

重组人α干扰素单克隆抗体的研制及其应用

目的　研制抗干扰素的单克隆抗体 (McAb)及其应用。方法　应用杂交瘤技术 ,获得 4 0株抗重组人α干扰素的单克隆抗体细胞株 ;用ELISA方法检测腹水滴度 ,用辛酸法纯化McAb。结果　 4 0株细胞中 2E9、4G1能稳定分泌抗重组人α1b干扰素的单克隆抗体 ,2C9为抗重组新型干扰素 ,2A7、4G10分泌抗重组人α干扰素 (α1b、α2b、α2a、)和重组集成干扰素、重组新型干扰素的单克隆抗体细胞系 ;体外连续传代 6个月 ,分泌抗体能力不变 ,特异性专一。 5株单克隆抗体均为IgG。采用辛酸方法提纯抗体纯度达到 95 %以上。粗制的重组人α干扰素经 4G10单克隆抗体亲和层析柱提纯后 ,获得的干扰素纯度 95 %以上 ,平均收率 93% ,残余鼠IgG含量 <10 0ng 剂量 (5 0 μg)。 2C9单克隆抗体亲和层析柱适用于纯化新型干扰素。结论　 4G10单克隆抗体亲和层析柱可以应用于大规模重组人α干扰素生产。     

抗人心肌单克隆抗体的制备及其生物学特性的初步研究

本文以人心肌抗原免疫BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,获2株(2F_1和1F_6)分泌抗人心肌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。免疫印迹试验证明,细胞培养上清及小鼠腹水中的特异性抗体均能与分子量为55KD蛋白带结合。抗原阻断试验结果,证明获得的两株单抗是人心肌抗原特异的。染色体数分别为102条和96条。1F_6和2F_1的Ig亚类型均为IgG_1。间接免疫荧光呈肌束膜型,ABC免疫组化显示肌束膜和肌原型(胞浆)。     

抗人B因子单克隆抗体的制备及其特性的初步研究

本文以人B因子免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,获得六株(A_2、B_2、B_7、C_9、F_9、F_(10))分泌抗人B因子单克隆抗体(单抗)的杂交瘤细胞系。用ELISA检测细胞培养上清和小鼠腹水的特异性抗体效价,分别为10~(-2)—10~(-3)和10~(-4)—10~(-5)。抗原阻断试验结果,说明这些单抗是B因子特异的。经取代试验和ACH_(50)抑制试验,提示B因子具有耐热和不耐热二组抗原决定基。A_2和B_2针对不耐热抗原决定基,能抑制补体旁路途径活化;B_7和C_9针对耐热抗原决定基,不影响补体旁路途径活化;F_9和F_(10)则既能与耐热决定基发生反应,也具有抑制补体旁路活化的功能。用固相抗原竞争抑制试验,分析B因子的抗原表位,发现6株单抗可识别4个抗原决定基。这些单抗对B因子结构与功能的研究,B因子在补体旁路活化过程中与有关补体成分之间的相互关系的研究,都是很有意义的。     

4种抗支原体单克隆抗体免疫学特性的研究

为了有效地控制细胞质量、我们从1987年开始、相继建立了抗口腔支原体(M.orale),精氨酸支原体(M.arginini),猪鼻支原体(M.hyorhinis).和莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)的杂交瘤细胞系共20株。并用IFA法、BA法或APAAP法对单克隆抗体进行了检测和鉴定。单克隆抗体(McAb)亚类鉴定结果:8株为IgG1,2株为IgG2b,其余10株为IgM。抗体效价测定大多数在4000～8 000之间。利用支原体纯培养的菌落进行了IFA染色试验,封闭试验,生长抑制试验和免疫电镜检查,均证实了它们的特异性,并获得2株对同属支原体有抗原交叉的McAb(3D1和3A11)。利用上述McAb检测实验室常用细胞的支原体污染,较常规法和DNA荧光染色法简便,快速,特异性较高。