靶向人Ku70 mRNA反义核苷酸的优化设计与筛选

目的:联合应用RNAdraw和Sfold软件设计并筛选低毒且高效抑制Hela细胞Ku70 mRNA表达的反义寡核苷酸。方法:从GenBank获得人Ku70 mRNA全序列,联合应用RNAdraw与Sfold软件,根据最小自由能原理设计多条20 nt的反义寡核苷酸,脂质体转染后MTT法检测其非序列特异性细胞毒性,选择毒性最小者并转染Hela细胞,RT-PCR检测转染前后Ku70 mRNA的表达水平并进行比较。结果:靶向Ku70 mRNA设计6条20 nt的反义寡核苷酸,其中NO.1序列非特异性毒性最低,对Hela细胞的生长抑制率(50、100和200 nmol.L-1浓度组分别为4.8%、9.5%和10.2%)与脂质体组比较差异无显著性(P>0.05),用毒性最低序列转染Hela细胞后使Ku70 mRNA表达水平显著降低(P<0.01),条带强度和面积与未转染组比较分别下降81.6%和77.6%。结论:联合应用计算机软件RNAdraw和Sfold对设计反义核酸有较大的指导意义,能实现较高的命中率,设计的反义寡核苷酸能有效抑制Hela细胞Ku70mRNA的表达。     

Survivin反义核酸对乳腺癌细胞增殖的影响

目的：探讨Survivin反义核酸对乳腺癌细胞增殖的影响。方法：本实验分6组，分别以脂质体介导反义寡核苷酸、无义寡核苷酸及RPMI 1640培养液作为空白的对照组，转染人乳腺癌MCF-7细胞系，采用Realtime RT-PCR，Western blot方法检测各组MCF-7细胞Survivin蛋白及mRNA的表达情况，测定转染后细胞贴壁率变化，研究Survivin反义寡核苷酸对MCF-7细胞的生长抑制作用。结果：脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染人乳腺癌MCF-7细胞后，细胞内Survivin蛋白及mRNA表达显著降低，通过Realtime RT-PCR检测MCF-7细胞经作用后其Survivin mRNA起始拷贝数明显下降；同时细胞贴壁率降低达32．96％，细胞生长抑制率最高达73．62％，ASOND／LiP组与NODN／LiP组和LiP组差异有显著性（P＜0．05）。结论：脂质体介导转染的反义寡核苷酸可在Survivin蛋白及mRNA水平有效地降低乳腺癌MCF-7细胞内Survivin的表达，并能够有效抑制乳腺癌细胞的增殖活性，提示Survivin靶向治疗可能成为乳腺癌综合治疗的一种重要方法。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响

目的：探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响．．方法：采用脂质体介导乙酰肝素酶反义寡核苷酸转染人胃癌细胞株SGC7901细胞,以逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后乙酰肝素酶mRNA、Fas mRNA和Bcl-2 mRNA表达的变化,采用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果：脂质体介导转染乙酰肝素酶反义寡核苷酸后,SGC7901胃癌细胞内乙酰肝素酶mRNA和Bcl-2 mRNA表达下降,FasmRNA表达上升,凋亡细胞比率由转染前的4．04％增加至转染后的16．00％。结论：转染后的乙酰肝素酶反义寡核苷酸可有效地诱导胃癌细胞发生凋亡。     

联合应用Survivin和VEGF反义寡核苷酸对肺癌A549细胞的抑制作用

目的研究非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)A549细胞经Survivin和VEGF反义寡核苷酸(ASODN)单独和联合转染后细胞生长、凋亡以及对基因表达的抑制作用。方法针对Survivin和VEGF mRNA序列设计反义寡核苷酸,以脂质体(Lip)为载体,介导Survivin和VEGF ASODN单独和联合转染A549细胞。MTT法检测细胞生长抑制率,RT-PCR检测细胞中Survivin和VEGF基因的mRNA含量,流式细胞术检测细胞凋亡以及细胞中Survivin基因的蛋白表达。结果经脂质体转染后200~600 nmol/L Survivin ASODN和5~20μmol/L VEGF ASODN均能抑制A549细胞增殖,诱导细胞凋亡;在48 h时,400 nmol/L Survivin ASODN和10μmol/L VEGF ASODN抑制率和凋亡率有统计学意义(P<0.05);两者联合转染A549细胞抑制率和凋亡率分别为(61.37±1.94)%和57.03%,显著高于两基因单独转染(P<0.05);联合组的Survivin mRNA的表达量为(15.26±1.31)%,蛋白表达率为(30.40±1.33)%,VEGF mRNA的表达量为(13.12±1.45)%,均显著低于单独转染组(P<0.05)。结论 Survivin和VEGF ASODN均能抑制A549细胞基因表达,诱导细胞凋亡,两基因反义寡核苷酸联合转染的效果优于单独转染。     

WT1反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究

[目的]研究WT1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响。[方法]实验分4组:正常对照组(加入转染液)、反义组(脂质体+反义寡合苷酸转染)、正义组(脂质体+正义寡合苷酸转染)和脂质体组(只加入脂质体)。分组转染卵巢癌SKOV3细胞株后,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR检测WT1 mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白表达水平。[结果]脂质体介导的WT1反义寡核苷酸转染明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,抑制率为49.48%,G0-G1期细胞分布率增加达(79.10±2.79)%,凋亡细胞群明显增多,凋亡率为(13.18±2.00)%,同时转染后细胞WT1 mRNA及蛋白表达水平下降,与对照组及其他各组相比较差异均有显著性意义(P<0.05)。[结论]WT1反义核酸能抑制卵巢癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。WT1反义核酸用于卵巢癌的基因治疗具有一定的潜在意义。     

生存素反义寡核苷酸对人胃癌细胞增殖的抑制作用

目的 探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用。方法 设计合成特异性靶向生存素的反义寡核苷酸。胃癌细胞株SGC7901分为4组：空白对照组、单纯脂质体对照组、正义链转染对照组、ASODN转染组。作用48h后收获各组细胞。Westernblot法检测各组细胞生存素表达情况，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，MTT法检测各组细胞的生长抑制率。结果 脂质体介导生存素反义寡核苷酸转染后的胃癌细胞出现生存素蛋白表达明显下降；ASODN转染组细胞凋亡率明显高于各对照组（P〈0．05），而各对照组问差异无显著性（P〉0．05）；ASODN转染组细胞的抑制率明显高于各对照组（P〈0．05），而各对照组问差异无显著性（P〉0．05）。结论 生存素反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下凋生存素蛋白表达，诱导胃癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，具有明显的抗癌作用。     

环氧合酶-2反义寡核苷酸对宫颈癌Hela细胞顺铂敏感性的影响

目的研究COX-2反义寡核苷酸(AS-ODNs)对宫颈癌Hela细胞顺铂敏感性的影响。方法体外设计、合成针对COX-2的反义寡核苷酸,并转染宫颈癌Hela细胞,应用细胞蛋白印记法(West-blot)测定转染COX-2反义寡核苷酸后Hela细胞COX-2基因蛋白的表达变化,应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测(MTT)COX-2反义寡核苷酸转染后Hela细胞对顺铂敏感性的变化。结果转染针对COX-2的反义寡核苷酸后,在24、48和72h,Hela细胞COX-2蛋白的表达水平下降;在转染48h后,Hela细胞对顺铂的半数抑制量从(10.475±1.713)μg/ml提高到(0.194±0.021)μg/ml,Hela细胞对顺铂的敏感性增加了53.88倍。结论COX-2反义寡核苷酸能增加宫颈癌Hela细胞对顺铂的敏感性。     

脂质体介导的99mTc标记c-myc mRNA反义寡核苷酸的反义作用效果的研究

目的探讨脂质体介导的99mTc标记癌基因c-myc mRNA的反义寡核苷酸能否抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达.方法合成15 bp的癌基因c-myc mRNA的反义、正义及无义寡核苷酸,用99mTc标记后(简称99mTc-DNA),一部分用脂质体包裹,以不同放射性强度的99mTc-DNA及脂质体包裹的99mTc-DNA转染细胞,于转染后不同时间测定细胞摄取率,在转染后18 h测定细胞返流比率,用四唑盐比色实验检测反义抑制细胞的生长状况,用流式细胞术测定癌蛋白的表达.结果在1～5 h内,细胞的摄取率随时间的延长而增加,脂质体包裹的99mTc-DNA的细胞摄取率明显高于未用脂质体包裹的99mTc-DNA.四唑盐比色实验,随着脂质体介导的99mTc-反义DNA剂量的增加,细胞数量逐渐减少,而正义、无义寡聚核苷酸组,细胞数量则没有减少的趋势.细胞的返流比率,反义、正义、无义寡核苷酸分别为39.51%、44.12%、63.92%.测定癌蛋白的荧光强度,反义寡核苷酸组2.9860±0.3733、正义寡核苷酸组4.2600±0.2218、无义寡核苷酸组5.2620±0.8562,反义寡聚核苷酸组的荧光强度明显低于正义和无义寡聚核苷酸组.结论脂质体介导的99mTc标记的反义寡核苷酸能抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达.     

Ku70 基因RNA 干扰载体的构建及干扰效果鉴定

目的构建靶向Ku70基因的RNA干扰(RNAi)表达载体并进行RNAi效果鉴定。方法设计3个针对Ku70基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染Hela细胞系。在转染24、48、72 h后,通过免疫印迹分析检测Ku70蛋白的表达量。把RNAi效果最显著的siRNA设计成短发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA),克隆入pSi-lencerTM 4.1-CMV hygro载体,转染Hela细胞系并筛选稳转细胞株,在mRNA和蛋白水平,评估Ku70 siRNA的干扰效果。结果 siRNA转染Hela细胞24、48 h后,Ku70蛋白的表达没有显著变化,但在72 h后,蛋白的表达量显著下降。在具有稳定表达siRNA的稳转细胞株中,Ku70基因的表达在mRNA水平和蛋白水平都受到了非常明显的抑制。结论成功构建靶向Ku70基因RNAi载体,并筛选出效能最优序列,为进一步研究Ku70基因的表达与宫颈癌放射治疗敏感性的关系奠定了基础。     

反义核酸对人结肠癌SW480细胞存活素表达和增殖的抑制

目的:研究存活素(Survivin)反义寡核苷酸对人结肠癌SW480细胞增殖的影响.方法:针对Survivin mRNA 序列设计了反义寡核甘酸,转染SW480细胞;RT-PCR检测细胞中Survivin 基因的mRNA 的表达,Western blot显示Survivin蛋白水平,以MTT法检测细胞增殖.结果:Survivin 反义寡核苷酸可明显降低SW480细胞中Survivin 的mRNA 和蛋白水平;MTT比色法结果说明人Survivin 反义寡核苷酸抑制SW480细胞增殖,抑制率远高于反义寡核苷酸组和空白对照组.结论:Survivin反义寡核苷酸能有效的下调SW480细胞Survivin的表达,同时抑制细胞增殖,有望应用于人结肠癌辅助治疗之中.     

我国医用氧气及分子筛制氧设备监管要求和对策

本文分析我国医用制氧设备及氧气制造原理、管理分类、质量标准、生产要求,依据国家相关法规探索其分类监管及临床应用中存在的难点和不足,以加强医疗机构分子筛制氧设备、医用氧及临床用氧的管理。分子筛制氧设备按医疗器械管理,新修订的《医用气体管道系统用氧气浓缩器供气系统》标准规定其产出气体应符合国家有关法规规定。我国已针对该设备产出气——富氧空气发布了国家药品标准,但如何按药品管理富氧空气尚无明确的规定。依据设备运行、维护、监控等影响生产富氧空气质量的因素,提出富氧空气按医疗机构制剂管理的建议。     

高压氧舱氧浓度的监测

本文就高压氧舱治疗过程中氧浓度升高的原因进行较为深入的探讨,并提供了相应预防措施和解决办法.     

医用纯氧舱顶部进氧提高舱内氧浓度的试验

医用纯氧舱采用舱内前顶部进氧加压,后方排气的结构形式,会使舱内氧浓度较为容易达到 90%以上,满足了医疗需要.     

感染性休克患者经皮氧负荷试验和中心静脉血氧饱和度的相关性

目的 分析感染性休克患者经皮氧负荷试验和中心静脉血氧饱和度( ScvO2)的相关性。方法 对49例感染性休克患者进行前瞻性研究,予经皮氧分压监测及实施氧负荷试验,增加吸入氧浓度( FiO2) 10 min,同时检测基础中心静脉血气和动脉血气以及增氧后动脉血气,并计算经皮氧分压( PtcO2)指数（基础PtcO2/基础PaO2）、组织氧合指数（基础PtcO2/基础FiO2）、10 min氧负荷值（吸入纯氧10 min后PtcO2值-基础PtcO2值）、氧负荷指数[10 min氧负荷值/（吸入纯氧10 min后PaO2-基础PaO2）];根据ScvO2分为止常ScvO2组(≥70％)和低ScvO2组(＜70％),在氧负荷试验中比较两组经皮氧分压不同参数的差异。结果 基础PtcO2、组织氧合指数、10 min氧负荷值、氧负荷指数与ScvO2均存在显著相关性,但与乳酸水平无相关性;正常ScvO2组和低ScvO2组两组间PtcO2、PtcO2指数、组织氧合指数无统计学差异;而10 min氧负荷值、氧负荷指数存在统计学差异;受试者工作特征曲线(ROC)分析显示,PtcO2、PtcO2指数、组织氧合指数、10 min氧负荷值、氧负荷指数评估ScvO2＜70％ ROC下面积分别为0.621、0.560、0.589、0.721、0.763。结论 经皮氧分压监测在成人的临床应用中,使用氧负荷试验后能提高其反映ScvO2的能力,可以预测ScvO2 ＜70％。     

感染性休克患者经皮氧分压与常用氧代谢指标的相关性

目的 分析感染性休克患者复苏前后经皮氧分压(PtcO2)相关指标与常用氧代谢指标的相关性.方法 选取2015年7月—2017年7月浙江医院感染性休克患者40例为研究对象,6 h持续监测PtcO2,并于0 h、6 h行氧负荷试验(OCT)、动脉血气分析及中心静脉血气分析.分析PtcO2值、OCT值(吸入纯氧10 min后...     

医用液态氧及PSA制氧有关情况的分析与比较

本文简介了两系统的结构、工作原理.对我院的用氧情况及如何配置PSA制氧系统作了分析;对两系统的投资、效益、管理等方面作了一些比较.     

液态氧中心供氧的应用

我院使用液态氧中心供氧一年多来,与原钢瓶氧供氧相比较,其优越性主要体现在:由于通过管路到使用终端,用截止阀门控制使用,所以安全、快捷、方便,提供的液化气态氧,因减少了压缩、充灌以及换瓶等环节,其纯度可达99.9%;液态氧的利用率可达90%以上,高于钢瓶氧(10～15)%;同时便于管理,减轻了劳动强度;而且经济实惠,大大节约了开支,经统计可节约开支四分之三.     

医用氧舱供排气系统的自动化设计

本文针对目前医用氧舱自动化程度不高,各种治疗参数难以定量控制的特点,设计出了以微型计算机为控制核心的医用氧舱自动供排气系统,并着重介绍了微型计算机的硬件和软件设计.