p53在苯并[a]芘诱导所致p21和细胞周期蛋白改变中的作用

目的探讨在苯并[a]芘(B[a]P)诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)中p53蛋白对p21、cyclin D1和CDK4蛋白间相互作用的影响。方法向转染p53小干扰RNA(p53siRNA)质粒的HELF细胞即p53-H细胞组、载体CMV的HELF细胞即HELF/CMV细胞组中分别加入2μmol/L B[a]P作用24 h,向p53化学抑制剂Pifithrin-α(PFT-α)组即HELF/CMV+PFT-α细胞组中同时加入2μmol/L B[a]P和20μmol/L PFT-α作用24 h,各组同时设立不做任何处理的对照组。用免疫印迹(Western blot)法检测细胞中p53、p53-ser20以及p21、cyclin D1和CDK4蛋白水平的变化,同时利用免疫沉淀方法分析p53蛋白对p21、cyclin D1以及CDK4蛋白间相互作用的影响。结果利用PFT-α或p53 siRNA技术抑制p53蛋白后,B[a]P诱导的p53蛋白20位丝氨酸磷酸化水平和p21蛋白水平的增高受抑制,B[a]P诱导的cyclin D1水平的增加不受影响,CDK4的水平不受B[a]P的影响;免疫沉淀实验结果表明,B[a]P引起的p21和CDK4结合的增加受到抑制,B[a]P引起的p21与cyclin D1结合的增加不受影响,cyclin D1和CDK4的结合不受B[a]P的影响。结论B[a]P通过p53-ser20影响人胚肺成纤维细胞p21和CDK4的结合。     

p53蛋白在苯并(a)芘诱导的p21、E2F-1表达及细胞周期改变中的作用

目的 探讨p53蛋白在苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞周期改变中的作用及其与p21、E2F-1的关系.方法 转染p53 siRNA质粒(p53-H)和载体CMV的HELF细胞(HELF/CMV)无血清培养48 h后,加入2 μmol/L B(a)P作用24 h.用流式细胞仪检测细胞周期的变化.用Western blotting检测细胞中p53、p21蛋白含量的改变,利用细胞核、细胞浆分离技术观察其亚细胞定位.用免疫荧光法观察E2F-1蛋白含量及细胞核、细胞浆分布.利用p53 siRNA质粒和化学抑制剂pifithrin-α(PFT)抑制其表达,观察p53与p21、E2F-1的上下游关系以及其在B(a)P引起的细胞周期改变中的作用.结果 2 μmol/L B(a)P作用24 h后,G1期细胞比例由(71±5)%减少为(39±4)%;p53、p21以及E2F-1蛋白含量增加,并且主要分布在细胞核内.用p53 siRNA质粒和PFT抑制p53表达后,B(a)P诱导的p21高表达被抑制,细胞核内的含量明显减少;B(a)P诱导的E2F-1蛋白含量增加以及细胞周期的改变没有明显变化.结论 B(a)P通过p53非依赖的信号通路引起HELF细胞周期的改变;p53对p21的表达具有调节作用,而对E2F-1的表达不具有调节作用.     

苯并(a)芘通过活化蛋白-1-细胞周期蛋白D1/E2F-1信号通路引起细胞周期的改变

目的 探讨活化蛋白-1(activated protein-1,AP-1)在苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]引起的人胚肺成纤维细胞(HELF)周期改变中的作用以及AP-1与细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)和E2F-1/4的上下游关系.方法 转染AP-1荧光报告质粒的HELF细胞(AP-H)无血清培养48 h后,加入2μmol/L B(a)P作用24 h,用荧光检测法检测AP-1的相对活性.用AP-1的化学抑制剂姜黄素(curcumin)抑制其活性,观察它与cyclin D1/CDK4和E2F-1/4的上下游关系.采用流式细胞仪检测细胞周期的变化,用Western blot检测细胞中cyclin D1、CDK4和E2F-1/4蛋白水平的改变.结果 2 μmol/LB(a)P作用24 h后,G1期细胞比例由(71±2)%减少为(48±3)%,差异有统计学意义(P＜0.05);AP-1的活性增加;cyclin D1/E2F-1的蛋白含量增加;CDK4/E2F-4的蛋白水平没有明显改变.抑制AP-1活性后,B(a)P诱导的细胞周期的改变被逆转,B(a)P诱导的cyclin D1/E2F-1蛋白含量的增加被抑制,CDK4/E2F-4蛋白含量没有明显改变.结论 B(a)P通过AP-1引起HELF周期的改变.AP-1是cyclin D1/E2F-1的上游信号分子,但对CDK4/E2F-4的表达不具有调节作用.     

ERK和JNK/活化蛋白-1通路在苯并(a)芘诱导人胚肺成纤维细胞周期改变中的作用

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/转录因子活化蛋白-1(AP-1)信号通路在调控苯并(a)芘[B(a)P]致人胚肺成纤维细胞(HELF)周期改变中的作用。方法用AP-1荧光素酶报告基因技术检测AP-1荧光素酶活力,流式细胞术测定细胞周期时相分布,免疫印迹法检测MAPK[包括细胞外调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38激酶]总量及磷酸化水平,用MAPK显性失活突变体(DN)(DN-ERK2、DN-JNK1和DN-p38)证明通路的上下游关系。结果2μmol/L B(a)P分别处理细胞0、6、122、4 h,AP-1活力在12 h达峰值,是对照组的2.22倍,差异有统计学意义(P<0.05);ERK1/2、JNK1/2和p38蛋白激酶的磷酸化水平明显提高,分别是对照组的2.5、14.0和2.1倍;B(a)P处理组S期细胞比例(50.2%±4.6%)与对照组(16.7%±8.1%)相比明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);ERK2和JNK1显性失活突变体的过表达均可明显降低B(a)P诱导的AP-1活力增强,并且明显降低B(a)P处理组S期细胞比例(分别为33.3%±1.7%,30.8%±3.9%),差异均有统计学意义(P<0.05);p38显性失活突变体的过表达对B(a)P引起的AP-1活力增强及S期细胞比例增加无影响。AP-1化学抑制剂姜黄素(20μmol/L)可明显降低B(a)P引起的S期细胞比例增加(13.6%±2.9%),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ERK和JNK通过活化AP-1介导B(a)P诱导的细胞周期改变;而B(a)P诱导的AP-1活力增强及细胞周期改变与p38无关。     

石英诱导细胞cyclin D1-CDK4蛋白表达的降低及其影响因子

目的 探讨石英暴露的人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast,HELF)中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)-细胞周期依赖蛋白依赖激酶4(CDK4)蛋白的表达水平,同时探讨细胞外调节蛋白激酶(ERK)、JNK、p38和核转录因子(AP-1)等信号蛋白在石英诱导eyelin D1-CDK4蛋白表达改变中的作用.方法 石英刺激HELF后,收获细胞,检测cyclin D1和CDK4蛋白表达.选用特异化学抑制剂或分子抑制剂抑制ERK、JNK、p38或AP-1的活性后,分别采用免疫细胞化学和免疫蛋白印迹方法检测HELF中cyclin D1和CDK4蛋白表达变化.结果 HELF暴露于石英粉尘2h后,cyclin D1和CDK4蛋白表达水平分别为(7.91±0.29)x103和(5.17±0.28)x104,均明显低于HELF组,差异有统计学意义(P＜0.05).用ERK的化学抑制剂或分子抑制剂抑制ERK的活力后,能够防止石英诱导的cyclin D1和CDK4蛋白表达降低.用SP600125抑制JNK的活力后,可以防止cyclin DI和CDK4蛋白表达降低.但是抑制p38的活力对石英诱导的cyclin D1和CDK4蛋白表达降低均没有作用.用姜黄素抑制AP-1的活性后,只能防止石英诱导的CDK4的表达降低,而对cyefin D1表达降低没有影响.结论 石英诱导HELF中cyclin D1和CDK4蛋白表达降低与ERK和JNK蛋白激酶有关.AP-1与石英诱导的CDK4蛋白表达降低有关.     

铜蓝蛋白在石英诱导的JNK/ERK/AP-1信号通路改变中的作用

目的探讨铜蓝蛋白(Cp)在石英诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)中JNK/ERK/AP-1信号通路改变中的作用。方法分别在100μg/ml石英作用前1 h、同时和作用后1h加入30μg/ml Cp,同时设立单独用石英和单独用Cp处理以及不做任何处理的细胞组,刺激细胞24 h后,用噻唑蓝(MTT)比色法观察Cp对石英诱导的HELF细胞增殖的影响。用100μg/ml石英分别作用于HELF细胞、转染JNK显性失活突变体质粒的HELF细胞(DN-JNK)和转染ERK显性失活突变体质粒的HELF细胞(DN-ERK)24 h;用100μg/ml石英作用1 h后,加入30μg/ml Cp作用24 h;同时设立不做任何处理的对照组。用MTT法检测分别抑制JNK和ERK后对细胞增殖的影响;用蛋白免疫印迹(Western blotting)实验检测JNK、ERK、c-Jun、c-Fos及其磷酸化水平的改变。结果石英作用1 h后加入Cp,对石英诱导的细胞增殖有促进作用,后续的实验选择这种作用模式。Cp可以明显增加JNK、ERK蛋白及磷酸化ERK(pERK)、磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化c-Jun(p-c-Jun)和磷酸化c-Fos(p-c-Fos)蛋白水平。抑制JNK蛋白活性后,Cp诱导的p-JNK、p-c-Jun和p-c-Fos蛋白水平的增加被抑制,Cp、石英以及Cp和石英共同诱导的细胞增殖加快被抑制;抑制ERK蛋白后,Cp诱导的p-ERK和p-c-Fos的增加被抑制,Cp、石英以及Cp和石英共同诱导的细胞增殖加快被抑制。结论 Cp通过JNK/c-Jun和c-Fos及ERK/c-Fos通路进一步增强石英诱导的促细胞增殖作用。     

细胞外信号调节激酶/c-Jun氨基末端激酶在炭黑诱导的人胚肺成纤维细胞毒性中对激活蛋白-1信号通路的作用

目的探讨细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)在炭黑诱导的人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblasts, HELF)毒性中对激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)信号通路的作用。方法分别在含0、15、30、60、120和240μg/mL炭黑的RPMI 1640培养液中培养HELF细胞24 h,用噻唑蓝比色法确定炭黑致HELF细胞毒性的剂量。100μg/mL炭黑分别处理HELF细胞(CB)、转染ERK显性失活突变体质粒(DN-ERK)HELF细胞(CB-DN-ERK)、转染JNK显性失活突变体质粒(DN-JNK)HELF细胞(CB-DN-JNK),同时设立细胞不做任何处理的对照组。CB组在染毒0、1、2、4、8、12、24和36 h用Western blot实验检测ERK、JNK、p38、c-Jun、c-Fos及其磷酸化水平,用荧光素酶法检测其AP-1活性。CB-DN-JNK和CB-DN-JNK组在染毒24 h用荧光素酶法检测AP-1活性,用Western blot实验检测ERK、JNK、c-Jun、c-Fos及其磷酸化水平。结果 CB组ERK和p-ERK蛋白表达水平在1～36 h各时间点均大于0 h时,而p38蛋白在1～36 h各时间点均小于0 h时;AP-1活性在8 h时下调至最低(0.72±0.12),在36 h时则上调至峰值(1.38±0.11);c-Fos、p-c-Fos、c-Jun蛋白表达水平在染毒1～24 h各时间点均大于0 h时,且p-c-Jun蛋白表达水平在1、2、4、8和36 h也大于0 h时。CB组AP-1活性,以及ERK、JNK、p38、c-Fos及其磷酸化蛋白水平变化呈双相模式。与CB组HELF细胞相比,虽然CB-DN-ERK组(1.02±0.04)及CB-DN-JNK组(1.09±0.10)AP-1活性差异均无统计学意义(分别为:t=0.16,P=0.88;t=0.73,P=0.50),但CB-DN-JNK组c-Fos(t=5.31,P=0.01)、p-c-Fos(t=4.33,P=0.01)、p-c-Jun(t=10.95,P0.01),以及CB-DN-ERK组c-Fos蛋白表达水平(t=42.72,P0.01)均显著降低。结论在炭黑诱导HELF细胞ERK、c-Jun、c-Fos及其磷酸化蛋白表达水平增高过程中,JNK正调控c-Fos、p-c-Fos、p-c-Jun蛋白表达水平,ERK正调控c-Fos蛋白表达水平。     

石英致MAPK/cyclinD1-CDK4信号转导通路的活化

目的探讨石英诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)中丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)/细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin D1-CDK4)信号转导通路的活化。方法两种处理方式:(1)石英刺激细胞2h后,收获细胞;(2)石英长时间(2个月)作用于细胞,使细胞具有部分转化细胞的特征(S-HELF),检测信号蛋白因子和细胞周期的变化。分别采用Western blot、免疫细胞化学和流式细胞术方法检测细胞内信号蛋白和细胞周期的改变。选用特异化学抑制剂或分子抑制剂抑制上游激酶,检测下游激酶的变化。结果HELF暴露于石英粉尘2 h后,可以导致MAPK家族中ERK1/2、p38和JNK1/2 3个亚家族的磷酸化水平升高。在S-HELF中,只有细胞外调节蛋白激酶(ERK)和C-Jun氨基末端激酶[JNK1(p46)]较未处理的HELF磷酸化水平增高,而JNK2(p54)的磷酸化水平没有变化,p38的磷酸化水平反而下降。cyclin D1和CDK4蛋白在S-HELF中较HELF中表达增多。抑制ERK和JNK活化或者抑制核转录因子活化蛋白1(AP- 1)的活化后,S-HELF中cyclin D1和CDK4蛋白过表达得到控制。而抑制p38的活性不能改变cyclin D1和CDK4蛋白过表达。结论石英刺激HELF2h后可诱导ERK、JNK和p38的活化,而S-HELF中ERK、JNK活化,p38没有被活化。S-HELF中,cyclin D1和CDK4蛋白质过表达与ERK、JNK和AP-1活化有关。     

ERK和JNK/AP-1通路参与石英诱导的细胞周期改变

目的 探讨在石英刺激的人胚肺成纤维细胞(human embryo lung fibroblasts,HELF)中转录因子活化蛋白-1(activator protein-1,AP-1)的活性改变,以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK),AP-1通路在石英诱导的细胞周期改变中的作用.方法 用200 μg/ml石英处理HELF细胞;用免疫荧光法检测细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regdated protein kinase,ERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)蛋白磷酸化水平及细胞分布;运用AP-1荧光素酶报告基因技术检测AP-1荧光素酶活力;用MAPK显性失活突变体(dominant negative mutant,DN)(DN-ERK2、DN-JNKl和DN-p38)证明通路的上下游关系;用流式细胞术检测细胞周期变化.结果 用200μg/ml石英分别处理转染AP-1报告基因的细胞(HELF-AP-1)6、12、24h,结果显示,AP-1活性随着时间变化而发生变化,6 h活性增强,12 h活性达峰值,24 h活性略有降低;用200 μg/ml石英分别处理细胞1和2 h,结果显示,ERK和JNK在石英刺激1 h后,磷酸化水平升高,主要集中于胞浆,2 h后磷酸化水平进一步升高,并主要集中于胞核;200 μg/ml石英处理细胞24 h,G1期细胞所占比例从(63.80±9.57)%下降到(32.23±7.22)%,S期细胞所占比例从(35.17±10.33)%升高到(66.00±8.07)%;AP-1化学抑制剂姜黄素(20μmol/L)可明显减弱石英引起的G1期细胞比例减少和S期细胞比例增加;DN-ERK和DN-JNK的过表达均可明显降低石英诱导的AP-1活性增强,DN-p38的过表达对石英诱导的AP-1活性增强无明显影响.结论 200 μg/ml石英可诱导AP-1活性增强,并通过ERK、JNK/AP-1通路诱导细胞周期改变.     

活化蛋白-1和细胞周期蛋白在石英诱导的细胞周期改变中的作用

目的 探讨在石英刺激的人胚肺成纤维细胞(HELF)中AP-1/细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)通路在细胞周期改变中的作用.方法 建立稳定转染空载体PXJ的HELF系(HELF-PXJ)及空载体PXJ与反义cyclin D1质粒或反义细胞周期蛋白依赖激酶(CDK4)质粒分别共转染的HELF系(简称anti-D1和anti-K4),将HELF-PXJ、anti-D1和anti-K4细胞分为对照组和石英刺激组(共6组),各对照组不加任何处理,石英刺激组用200 μg/ml石英处理细胞24h.检测AP-1对石英诱导的cyclin D1、CDK和E2F-4表达改变的影响.AP-1的化学抑制剂姜黄素(curcumin) 20μmol/L预处理细胞1h后,200 μg/ml石英刺激24 h,将HELF分为4组,分别为HELF对照组、HELF+石英组、HELF+curcumin对照组、HELF+curcumin+石英组.用免疫印迹(Western blot)法和免疫荧光法检测cyclin D1、CDK4和E2F-1/4蛋白表达;运用反义RNA技术证明通路的上下游关系;用流式细胞术检测细胞周期变化.结果 200 μg/ml石英处理HELF细胞,cyclin D1和CDK4蛋白表达升高,E2F-4蛋白表达明显降低,而E2F-1蛋白的表达没有明显改变.HELF-PXJ+石英组G1期细胞所占比例下降,S期细胞所占比例升高,与HELF-PXJ对照组的差异有统计学意义(P＜0.05).抑制cyclin D1或CDK4表达后,与对照组比较,anti-D1+石英组和anti-K4+石英组G1期细胞和S期细胞百分比无明显变化.抑制AP-1活性,与HELF+石英组比较,HELF+curcumin+石英组cyclin D1和CDK表达均减低,E2F-4表达增多.结论200μg/ml石英可诱导cyclin D1和CDK4蛋白表达增高,E2F-4蛋白表达减少,并通过AP-1/cyclin D1通路诱导细胞周期改变.     

苯并(a)芘引起静止期二倍体人胚肺成纤维细胞可逆的G1期阻滞

目的研究苯并（a）芘[B（a）P]对静止期的二倍体人胚肺成纤维细胞（HELF）细胞周期的影响。方法血清饥饿法使细胞同步化于G0期;20μmol／LB（a）P作用细胞4h后,采用流式细胞术分别检测遗传损伤发生后0、24、48h细胞周期分布的改变,并采用Western blotting分析0、5、10、20μmol／LB（a）P作用24h后及20μmol／LB（a）P作用4h后24h内细胞周期主要调节基因p53、p21和p16表达的改变。结果0．5％低血清培养48h能够较好的达到G0同步化效果,处于G0期细胞占78％;正常培养细胞持续进入细胞周期进行DNA合成,24h时S期细胞达43．9％,而20μmol／LB（a）P处理组细胞发生G1期阻滞;48h后对照组细胞完成一个细胞周期回到以G1期为主的状态,B（a）P处理组细胞则从G1期阻滞中恢复,继续进入细胞周期,S期细胞达到了26．5％,延迟约24h。不同浓度B（a）P作用后引起P53、P21蛋白表达明显增加,20μmol／LB（a）P处理后4h即可诱导蛋白表达增加。P53在12h后逐渐恢复,P21直至24h仍未下降。P16初始略有下降,24h恢复。结论B（a）P引起同步化于G0期的细胞发生可逆转的G。期阻滞,该阻滞和p53-p21途径相关。     

苯并芘诱导人胚肺成纤维细胞cyclinD1、CDK4和E2F-1/4的表达改变

目的建立苯并芘诱导的具有转化细胞部分特征的人胚肺成纤维细胞(T-HELF)模型,并观察T-HELF细胞中cyclin D1、CDK4和E2F-1/4蛋白表达的改变。方法以200、100、50、25、5、1μmol/L的苯并芘处理人胚肺成纤维细胞(HELF)24小时,用噻唑蓝(MTT)比色法测定苯并芘的细胞毒性。根据MTT结果确定以100和200μmol/L苯并芘给HELF细胞染毒3次,染毒结束后培养6周观察细胞的形态变化,培养12周后观察其形态变化及软琼脂中细胞克隆的生长。用流式细胞仪检测T-HELF细胞周期的变化,用Western blot检测T-HELF细胞中cyclin D1、CDK4和E2F-1/4蛋白表达的改变。结果MTT结果显示苯并芘浓度在25~200μmol/L之间时,细胞存活率为78%~80%。苯并芘200μmol/L组染毒4周后细胞死亡。100μmol/L组染毒结束后培养6周,观察到细胞变大,核增大或多核;12周后,在软琼脂中可以生长为细胞克隆,说明HELF细胞具有了转化细胞的部分特征。T-HELF细胞在无血清培养时,细胞周期没有停滞。用Western blot检测发现和正常HELF细胞相比T-HELF细胞的cyclin D1表达明显增加,CDK4、E2F-1和E2F-4的表达没有明显变化。结论建立了苯并芘诱导的具有转化细胞部分特征的人胚肺成纤维细胞模型,可用于苯并芘致癌的分子机制研究。无血清培养时,T-HELF细胞周期没有停滞,和正常HELF细胞相比T-HELF细胞cyclin D1表达明显增加,cyclin D1可能与T-HELF细胞的快速增殖有关。     

cyclinD1/E2F通路在苯并(a)芘引起人胚肺成纤维细胞周期改变中的作用

目的探讨细胞周期蛋白D1（cyclinD1）／细胞周期蛋白依赖激酶4（CDK4），E2F-1／4通路在苯并（a）芘[B（a）P]引起的人胚肺成纤维细胞（HELF）周期改变中的作用。方法分别用2μmol／L的B（a）P作用HELF24h和100μmol／LB（a）P作用3次，每次24h，细胞具有转化细胞的部分特征（THELF）。用转染反义cyclinD1和CDK4质粒的HELF（A-D1，A-K4）和T-HELF（T-A-D1，T-A-K4）研究cyclinD1／CDK4与E2F-1／4的上下游关系。用流式细胞仪和Western blot法检测细胞周期、cyclin D1、CDK4和E2F-1／4蛋白表达的改变。结果2μmol／LB（a）P作用24h HELF中G1期细胞数明显减少。在A-D1和A-K4的HELF中，cyclinD1和CDK4表达的抑制阻断了由B（a）P引起的细胞周期从G1期进入S期的变化。B（a）P刺激后HEIF中cyclinD1和E2F-1的表达明显增加。在A-D1中，E2F-1的高表达被抑制。B（a）P作用A-K4细胞后，CDK4表达明显升高，E2F-4表达明显降低。T-A-D1和T-A-K4的T-HELF多数停留在G1期。与HELF相比，T-HELF中cyclin D1的表达明显增加；与T-HELF相比，T-A．D1和T-A-K4中E2F-4表达明显增加。结论在2μmol／L B（a）P作用的HELF中，B（a）P通过cyclinD1／CDK4-E2F-1／4信号转导通路引起细胞周期的改变。在T-HELF中，B（a）P通过cyclinD1／CDK4-E2F-4信号转导通路引起细胞周期的改变。     

Cyelin D1和CDK4正性调节苯并(a)芘所致人胚肺成纤维细胞周期改变

目的 研究苯并(a)芘[B(a)P]对人胚肺成纤维细胞(HELF)的细胞周期分布及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)蛋白表达的影响,并探讨两种蛋白含量改变与细胞周期效应之间的关系.方法 将反义cychn D1质粒和反义CDK4质粒导入HELF细胞内.建立两种质粒稳定转染的细胞模型.用0.1、0.5、2.5和12.5μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h.用蛋白印迹方法检测cvclin D1和CDK4蛋白表达水平;利用流式细胞技术检测B(a)P处理对HELF细胞及两种稳定转染细胞系细胞周期的影响.结果 成功建立了反义cyelin D1和反义CDK4稳定转染的细胞系.不同剂量B(a)P处理可引起cvclin D1蛋白表达的显著增加,但对CDK4蛋白表达无明显影响;2.5/μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h后,引起其细胞周期G1期显著下降,S期显著增加;2.5μmol/L的B(a)P处理反义cyclin D1和反义CDK4稳定转染的HELF细胞24h后,对其细胞周期的分布无显著影响.结论 Cyelin D1和CDK4基因均参与了B(a)P所致细胞周期改变过程,并发挥正性调节作用.     

全反式视黄酸阻断苯并(a)芘致成纤维细胞周期改变的通路

目的 观察全反式视黄酸（ATRA）逆转苯并（a）芘诱导的人胚肺成纤维细胞（HELF）细胞周期紊乱过程中细胞周期素D1（cyclin D1）、细胞周期素依赖性激酶K4（CDK4）、转录因子E2F-1和E2F-4的作用.方法 用0.1 μmol/L ATRA预处理细胞后,再用2 μmol/L苯并（a）芘作用细胞,用Western blotting方法测定其蛋白表达水平;建立稳定转染了反义cyclin D1质粒和反义CDK4质粒的细胞系,应用反义技术证明上下游关系;用流式细胞技术 测定细胞周期.结果 2μmol/L苯并（a）芘作用于HELF24h后,cyclin D1、E2F-1蛋白表达水平明显增高,CDK4和E2F-4蛋白表达水平无明显变化;用0.1 μmol/LATRA预处理24h后,cyclin D1、E2F-1蛋白表达水平明显下降;与相同作用的对照组相比,苯并（a）芘刺激反义cyclin D1或反义CDK4细胞后E2F-1表达增加的幅度明显降低;与相同作用的对照组相比ATRA预处理的反义cyclin D1或反义CDK4细胞中,苯并（a）芘诱导的E2F-1过表达水平降低的幅度明显降低;流式细胞术测定结果显示,苯并（a）芘诱导细胞从G1期进入S期,ATRA通过聚积G1期细胞而阻滞苯并（a）芘诱导的细胞周期进程.结论 ATRA通过cyclin D1/E2F-1途径阻断苯并（a）芘诱导的HELF的细胞周期改变.     

多环芳烃致4种细胞彗星尾矩和双核细胞微核率变化差异的研究

目的探讨彗星尾矩和双核细胞微核(CBMN)率两个指标对多环芳烃反应动力学的差异。方法应用4株细胞系,分别是中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1、小鼠成纤维细胞NIH3T3、中国仓鼠肺成纤维细胞CHL、人胚肺成纤维细胞HELF,给予不同浓度的苯并(a)芘[B(a)P]处理,观察彗星尾矩和CBMN率的变化情况。阳性对照分别是过氧化氢和环磷酰胺。结果在所应用的B(a)P浓度范围内,4种细胞均在较低剂量下就出现了明显的拖尾(CHO-K1:0.5μmol/L;NIH3T3:0.75μmol/L;CHL:0.5μmol/L;HELF:0.3125μmol/L),并且随作用浓度的增加,彗星尾矩呈直线形上升趋势,各组与其邻近的较低剂量组相比,差异有显著性。CBMN率在中剂量组才出现显著升高(CHO-K1:2.0μmol/L;NIH3T3:1.5μmol/L;CHL:2.0μmol/L;HELF:1.25μmol/L),达到一定作用剂量后,CBMN率的上升趋于平缓,其剂量反应曲线基本呈S型。结论彗星尾矩和CBMN率对多环芳烃动力学反应模式不同,敏感性不同,在进行环境致癌物早期效应标志物研究时,应合理地将两种方法相结合,综合评价化学物所致遗传损伤。