安徽省中华按蚊钠离子通道蛋白基因的击倒抗性突变

目的探讨安徽省主要传疟媒介中华按蚊拟除虫菊酯击倒抗性机制,并为进一步建立抗性检测分子方法提供基础。方法采用自行设计的引物扩增中华按蚊钠离子通道ⅡS4-S6节段基因序列,扩增产物双向测序,获得的基因序列与GenBank数据库进行比对。结果受试中华按蚊均扩增出约378 bp均一清晰条带。测序比对发现,在相对于冈比亚按蚊钠离子通道1 013和1 014位置发生突变:由TTG突变为TTT或TGT,即L/F或L/C突变。结论安徽省中华按蚊已发生针对拟除虫菊酯的击倒抗性突变。     

安徽省沿淮地区中华按蚊溴氰菊酯抗性及代谢解毒酶活性kdr突变频率调查

目的 了解安徽省沿淮地区疟疾媒介中华按蚊对溴氰菊酯杀虫剂的抗性状况及谷胱甘肽S转移酶 （GSTs）、 细胞色素氧化酶 （P450s） 等代谢解毒酶活性和钠离子通道击倒抗性基因 （Knockdown resistance, kdr） 的突变情况。方法 2011 年8-9月采集安徽省蚌埠市李楼乡、 沫河口镇和沱湖乡中华按蚊成蚊样本, 采用WHO成蚊接触筒药膜滤纸接触法, 调查3 个地区中华按蚊对溴氰菊酯抗性状况。随机挑选样本采用生化法检测代谢解毒酶活性并用PCR扩增产物直接测序法检测分析钠离子通道kdr基因IIS6片段L1014位点基因型。结果 李楼乡、 沫河口镇和沱湖乡3个检测点的中华按蚊对溴氰菊酯60 min内击倒率分别为4.1%、 7.0%和8.2%, 恢复24 h后校正死亡率分别为8.2%、 12.0%、 12.8%, 均为抗性种群。3个检测点的中华按蚊GSTs和P450s活性均显著高于实验室敏感种群 （P < 0.001）。3个检测点的中华按蚊kdr基因均发生突变, 存在 L1014C和L1014F两种突变类型, 无野生纯合型 （TTG/TTG）, 实验室敏感种群kdr基因均为无突变的野生纯合型。结论 安徽省沿淮地区的中华按蚊已对溴氰菊酯产生较强的抗性, 代谢解毒酶活性比实验室敏感种群显著升高, 钠离子通道kdr基因L1014位点出现高频率的突变。     

河南省中华按蚊抗药性及其与kdr突变关联性的初步研究

目的 了解河南省主要传疟媒介中华按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性及其与击倒抗性基因型的关联性.方法 2009年以区分剂量法调查河南省桐柏、淮滨和永城3地中华按蚊对溴氰菊酯和氟氯氰菊酯的抗药性,并抽取部分样本进行了kdr基因序列检测.χ2检验判断其抗药性与kdr基因突变的关联性.结果 河南省3县(市)中华按蚊溴氰菊酯和氟...     

TaqMan?MGB探针实时荧光定量PCR用于中华按蚊kdr基因突变检测的研究

目的 目的 建立一种用于中华按蚊杀虫剂抗性相关kdr基因突变检测的实时荧光定量PCR方法。方法 方法 根据中华按蚊kdr基因序列及其L1014位点常见的突变类型设计一对引物和三条TaqMan?MGB探针, 对TaqMan?MGB探针实时荧光定量PCR反应体系和条件进行了优化, 选择经测序鉴定后的6种中华按蚊kdr基因常见类型对该方法进行验证, 并用该方法对50个实验室和113个现场中华按蚊样本进行检测。结果 结果 实时荧光定量PCR方法能对中华按蚊kdr基因6种不同的基因型进行检测, 单管法可判断kdr基因L1014是否发生突变, 双管法可对具体突变类型进一步鉴别。经检测, 50个实验室样本均为野生型纯合体, 而113个现场样本中, 仅12个样本为野生型纯合体, 其余101个样本均发生了L1014F或L1014C 突变, 突变频率为87.61%。结论 结论 TaqMan?MGB探针实时荧光定量PCR可用于中华按蚊kdr基因L1014位点突变的检测。     

按蚊对拟除虫菊酯抗药性的检测

在人房内用拟除虫菊酯杀虫剂浸泡蚊帐是防制蚊的有效措施。因在蚊的防制和农业上大量使用拟除虫菊酯,按蚊可能对其产生抗药性。近年WHO研制了二氯苯醚菊酯和溴氰菊酯的标准抗性测试盒,暴露时间定为1h。但拟除虫菊酯的快速击倒作用可引起测试结果的不稳定。此外,瓶的放置方法对测试结果也有影响,被击倒的蚊在竖放的瓶中可     

淡色库蚊kdr等位基因突变及抗药性检测方法的研究

目的 了解山东省不同地区的淡色库蚊成蚊对溴氰菊酯的抗药性水平及其kdr等位基因的突变与抗药性水平间的关联情况,并探索建立蚊虫抗药性的现场检测方法。方法 采用RT-PCR和AS-PCR技术,使用特异性引物克隆不同地区野生淡色库蚊成蚊kdr基因序列,并进行基因测序。利用线性回归分析判断其突变情况与抗药性的关联情况。结果 成功克隆出kdr等位基因, 通过基因序列分析发现在淡色库蚊钠通道第II结构域S6节段1014位点上存在2种突变,即L1014F：TTA突变为TTT,相应的亮氨酸(L)被苯丙氨酸(F)取代,L1014S：TTA突变为TCA,相应的亮氨酸(L)被丝氨酸(S)取代。Kdr基因L1014F突变 和L1014S突变与淡色库蚊对溴氰菊酯的抗性表型呈正相关。RT-PCR和AS-PCR技术对蚊虫抗药性现场检测的结果一致。结论 淡色库蚊kdr基因突变与溴氰菊酯抗药性表型呈正相关,RT-PCR和AS-PCR技术都可以应用于蚊虫抗药性的现场检测。     

山东省淄博市淄川区淡色库蚊kdr等位基因突变研究

目的　了解山东省淄博市淄川区淡色库蚊（Culex pipiens pallens）季节消长趋势及蚊虫击倒抗性（Knockdown resistance, kdr）相关钠通道基因多态性分布特征。方法　于2017–2018年蚊媒活动高峰期，使用诱蚊灯法对山东省淄博市淄川区进行蚊虫种群和密度调查，提取淡色库蚊DNA，通过PCR检测kdr等位基因突变类型和频率。结果　在山东省淄博市淄川区共捕获830只蚊虫，包括淡色库蚊、骚扰阿蚊、白纹伊蚊、刺扰伊蚊、中华按蚊和三带喙库蚊6种，其中淡色库蚊占83.13%，密度为12.32只/（台·夜）；淡色库蚊全年密度监测曲线呈双峰趋势，高峰出现在6月和9月。在kdr基因1 014位点共检测发现5种kdr等位基因类型，包括TTA（75.71%）、TTT（10.00%）、CTA（5.71%）、TCA（4.29%）、TTC（4.29%），同时发现2种核苷酸非同义突变，即亮氨酸（L1014）突变为苯丙氨酸（L1014F）、丝氨酸（L1014S）。罗村镇、太河镇两地淡色库蚊kdr基因突变频率分别为10.53%、40.63%，差异具有统计学意义（[χ2] = 8.559，P = 0.003）。结论　淡色库蚊为山东省淄博市淄川区优势蚊种。本研究首次在淡色库蚊中检测发现CTA、TTC两种kdr等位基因突变，kdr基因型呈多态性。     

焦磷酸测序技术检测HBV基本核心启动子变异的研究

目的建立HBV基本核心启动子（BCP）区变异的快速检测方法。方法采用焦磷酸测序（pyrose-quencing）技术，设计一对引物，其中一条经生物素标记，PCR扩增产物含HBVBCPA1762T／G1764A双突变的区域，借用生物素包被葡聚珠纯化单链PCR产物，设计一条测序引物，运用焦磷酸测序技术对A1762T／G1764A两个变异点进行变异分析。通过对已知变异类型的HBV分离株进行测定分析，评价所建立方法的检测敏感性和特异性。结果PCR扩增后，可在2h内得到A1762T／G1764A两个变异点的突变情况。所建立方法的检测灵敏度达到HBV．DNA血清中的含量为10^3copies／ml；在所分析的HBVBCP区均可检测出变异株、非变异株及混合株，且所检测的结果与直接测序方法结果符合率为95％。结论Pyrosequencing技术用于检测病毒基因突变有高通量、自动化程度高和结果准确等特点，适用于对HBVBCP区突变进行快速高通量检测。     

湖南地区肝豆状核变性基因突变热区的序列检测与分析

目的检测湖南地区汉族人群肝豆状核变性患者（WD）ATP7B基因常见突变种类和形式。方法提取22例WD患者外周血基因组DNA，聚合酶链反应（PCR）扩增ATP7B基因第5、8、12及13号外显子并进行DNA直接测序检测，应用在线BLAST软件分析。结果22例患者中共发现15例患者存在基因突变。其中10例患者存在8号外显子2273G→T杂合突变（即Arg778Leu），且均伴有2250C→G多态（即Leu770Leu，均为杂合子），未发现纯合突变。12号外显子中共发现2855G→A多态（即Arg952Lys）7例（杂合突变4例，纯合突变3例），其中1例合并12号外显子2828G→A杂合突变（即Gly943Asp），另3例合并Arg778Leu杂合突变。13号外显子2975C→T杂合突变（即Pro992Leu）1例。5号外显子未发现突变。结论Arg778Leu是湖南地区汉族WD患者的突变热点，5号外显子为非突变热点。     

141例慢性骨髓增生性疾病中JAK2基因V617F点突变的研究

目的：研究分子遗传学标记JAK2V617F突变在141例慢性骨髓增殖性疾病（cMPD）患者中发生率、突变类型及其与血液学特征的相关性。方法：应用等位基因特异性PCR（AS-PCR）技术进行JAK2V617F点突变的检测,采用PCR-限制性片断长度多态性（RFLP）方法检测JAK2V617F（＋）者的突变类型,然后DNA测序验证。结合临床资料进一步分析。结果：经AS-PCR发现141例cMPD中有73例为JAK2V617F突变阳性样本,其中21例BCR-ABL阳性的CML中未发现突变样本。JAK2V617F（＋）的病例中19例为纯和型突变,54例为杂和型突变。经酶切及测序验证结果相符。结合临床资料进行分析,JAK2V617F突变阳性患者外周血细胞分析中白细胞数和血红蛋白的量较野生型高,而血小板计数较野生型差异无统计学意义。JAK2V617F纯和型突变患者外周血细胞计数中血红蛋白的量较杂合型高,而血小板计数较杂合型低,白细胞计数差异无统计学意义。结论：JAK2V617F点突变可以作为BCR—ABL阴性的MPD诊断的一个参考依据。在突变类型中纯和型突变较为少见。突变类型对血液学特征有一定的影响。     

153例慢性HBV感染者核苷和核苷酸类药物的耐药变异位点分析

目的通过对153例慢性HBV感染者进行HBV逆转录酶区扩增测序,了解目前上市的核苷和核苷酸类药物耐药位点检出情况,并分析是否存在与替诺福韦耐药可能相关的耐药位点。方法 153例患者分为2组,其中78例是未使用过核苷和核苷酸类药物治疗的HBV携带者,75例是核苷和核苷酸类药物经治的慢性乙型肝炎患者。通过PCR扩增HBV的逆转录酶(RT)区,进行基因测序分析,了解核苷和核苷酸类药物的耐药位点及替诺福韦相关的耐药位点的检出情况。正态分布资料采用t检验,非正态分布的资料采用秩和检验。结果在未治疗组有7例检出核苷和核苷酸类相关的耐药变异,占该组的8.97%,但并无上述替诺福韦耐药相关的位点。治疗组检出16例耐药变异,占该组的21.33%,其中1例为rtA181T+rtN236T,可能与替诺福韦耐药相关。结论未治疗组中有8.97%的患者检出耐药变异。2组患者中耐药变异的检出率与患者的性别、年龄、病毒基因型均无显著相关。所有患者中仅1例检出rtA181T+rtN236T。提示中国慢性HBV感染者体内预存替诺福韦可能耐药位点的比例很低。     

Novel assay of competitively differentiated polymerase chain reaction for screening point mutation of hepatitis B virus

AIM: Point mutation, one of the commonest gene mutations,is the most important molecular pathogenesis of cancer and chronic infection. The commonest methods for detection of point mutation are based on polymerase chain reaction (PCR). These techniques, however, cannot be used in large scale screening since they are neither accurate nor simple.For this reason, this study established a novel method of competitively differentiated PCR (CD-PCR) for screening point mutation in clinical practice.METHODS: Two competitively differentiated primers for mutant-type and wild-type templates respectively with an identically complemented region in 3‘ end except for last 2 base pairs and a different non-complemented region in 5‘ end were designed. Thus, competitive amplification might be carded out at a lower annealing temperature at first, and then differentiated amplification at a higher annealing temperature when primers could not combine with initial templates. The amplification was performed in one-tube.The products of CD-PCR were detected using microplate hybridization assay. CD-PCR was evaluated by detecting G1896A variant of hepatitis B virus (HBV) in form of recombinant plasmids and in sera from patients with hepatitis B, and compared with allele-specific PCR (AS-PCR) and competitive AS-PCR.RESULTS: CD-PCR was successfully established, it could clearly distinguish wild-type and mutant-type plasmid DNA of G1896A variant when the amount of plasmid DNA was between 102-108copies/reaction, while for AS-PCR and competitive AS-PCR, the DNA amount was between 10^2-10^4 copies/reaction. CD-PCR could detect one copy of G1896A variant among 10-100 copies of wild-type plasmid DNA. The specificity of CD-PCR was higher than those of AS-PCR and competitive AS-PCR in the detection of HBV G1896A variant in sera from patients with hepatitis B. CD-PCR was independent of the amount of HBV DNA in serum. HBV G1896A variant was more often found in HBeAg (-) patients with a lower level of detectable viremia than that with a higher level of detectable viremia (P=-0.0192).CONCLUSION: CD-PCR is more specific since it is less influenced by the amount of initial templates and the cross amplification between mutant- and wild-type amplified products. It is also simple and time-saving. Thus, CD-PCR might be useful in routine gene typing and point mutation screening. HBV G1896A or other more important mutations have to be routinely detected in patients with a detectable level of viremia after HBeAg/antibody conversion in clinical practice.     

克拉霉素耐药幽门螺杆菌株的基因型分布

背景：根除幽门螺杆菌（H.pylori）治疗在临床上的应用日益普遍。耐药菌株的出现是近年H.pylori根除率下降的主要原因,尤其是目前根除治疗作用最强的抗生素之一——克拉霉素。目的：研究克拉霉素耐药H.pylori菌株的基因型分布,为快速检出抗生素耐药提供基础。方法：以琼脂稀释法筛选出2002年9月～2003年2月13株原发性、22株获得性克拉霉素耐药H.pylori菌株,提取基因组DNA。聚合酶链反应（PCR）-反向斑点杂交法检测克拉霉素耐药H.pylori菌株23SrRNA基因中7种不同的点突变（A2115G、G2141A、A2142G、A2142C、A2143G、A2143C和A2142T）。结果：34株（97.1%）克拉霉素耐药H.pylori菌株发生A2143G突变,其中13株为原发性,21株为获得性;1株（2.9%）获得性耐药菌株发生A2142G突变。结论：我国克拉霉素耐药H.pylori菌株基因型以23SrRNA基因A2143G突变占主导地位,与欧美国家报道的A2142G和A2143G突变率相近不同。     

Real-Time PCR探针法定量检测沙门菌方法的建立及应用

目的建立快速、特异性好、灵敏度高的Real-Time PCR方法定量检测沙门菌。方法根据编码沙门菌肠毒素基因stn的核苷酸序列,设计荧光探针和一对引物,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立定量检测沙门菌的方法。结果建立的Real-Ti me PCR方法有很好的特异性与敏感性,所检测沙门菌结果均为阳性,而非沙门菌均为阴性;标准曲线相关系数为R2=0.993,其敏感性为5CFU。运用该方法对108份鸡粪便、50份鸡肉以及58份水样进行检测,阳性率分别为3.7%(6/108)、4%(2/50)和3.4%(2/58),与传统细菌分离检测结果相符。结论结果表明该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点,此研究为环境及疾病诊断中沙门菌快速检测提供了新方法。     

云南省埃及伊蚊对拟除虫菊酯类抗性群体的击倒抗性基因突变分析

目的 检测云南省登革热重点地区对氯菊酯和高效氯氟氰菊酯杀虫剂已产生抗性的埃及伊蚊的击倒抗性(knockdown resistance,kdr)基因,进行基因突变分析,阐明抗性表型与kdr基因突变的关系。方法 收集云南省景洪市、勐腊县、勐海县、瑞丽市和耿马县经过氯菊酯和高效氯氟氰菊酯杀虫剂测定的埃及伊蚊成蚊样本,分别提取单蚊基因组DNA,Allele-specific PCR(AS-PCR)扩增和分析其kdr部分基因片段,统计抗性与敏感表型中kdr突变的基因型和基因频率。结果 共580份雌性埃及伊蚊样本被用于V1016G和F1534C击倒抗性突变的检测。V1016G的突变频率为99.83%(579/580),F1534C的突变频率为46.38%(269/580)。V1016G和F1534C突变频率差异存在统计学意义(χ²=421.338,P=0.000)。5个埃及伊蚊种群中,V1016G突变率除了瑞丽市外,其他区域均达到100.00%。F1534C突变率景洪市最高为84.16%,耿马县最低为5.66%。抗性表型与敏感表型的V1016G和F1534C突变率差异均存在统计学意义(χ²=7.298,P=0.007;χ²=14.010,P=0.000)。580份样本中,有65份样本同时存在V1016G和F1534C位点突变,突变率为11.21%;不同地区同时突变率范围为0~33.66%,景洪市同时突变率最高为33.66%。结论 云南省登革热重点地区埃及伊蚊种群存在V1016G和F1534C突变,V1016G突变率高且分布广,F1534C突变以景洪市埃及伊蚊种群为最高。敏感表型与抗性表型V1016G和F1534C突变存在差异,提示抗性产生与突变存在一定的关系。     

幽门螺杆菌对甲硝唑的耐药性分析

目的探讨幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）甲硝唑耐药菌株相关基因的突变与耐药性的关系。方法收集临床60例有胃部不适患者的胃活检组织,微需氧培养得到Hp菌株。E-Test法检测Hp对甲硝唑的最低抑菌浓度（MIC）,PCR扩增rdxA、frxA、fdxB,并对该基因进行测序,对耐药株的rdxA、frxA、fdxB的基因序列与标准株Hp26695相应序列进行同源性分析。结果 60例病人胃粘膜标本成功分离出11株Hp耐甲硝唑株（MIC均≥256μg/mL）。11株临床株和1株国际标准测序株（Hp26695）均扩增出rdxA、frxA、和fdxB;基因rdxA、fdxB和frxA突变有一定的规律性,除了存在共同突变外,还存在随机位点散在突变。结论 Hp对甲硝唑耐药性与rdxA、fdxB和frxA基因突变相关。     

慢性乙型肝炎肝硬化结节样变与病毒变异的关系

目的：分析慢性乙型肝炎肝硬化结节样变与 HBV 变异的关系以及 HBV 变异在慢性肝硬化、肝癌进展中的作用。方法收集临床诊断慢性乙型肝炎肝硬化患者104例,其中不典型结节样增生病例43例,单纯肝硬化患者41例,肝癌患者20例。采用荧光探针实时定量 PCR 试剂盒提取 HBV 基因组,选取 PCR 强阳性产物用 Sanger 双脱氧链末端终止法对 HBV 前 C 区变异基因 G1896A ,BCP 区 G1764A、A1762T 位点在全自动核苷酸分析仪上测序,测序结果与 Gene Bank 中 pADR 标准株序列作对比分析。结果结节性增生组、单纯肝硬化组、肝癌组患者 HBV 前 C Gl896A 变异检出率分别是52．3％、40．1％和37．4％,差异无统计学意义（χ2＝0．547,P ＝0．05）;结节性增生组 BCP A l762T 变异率68．4％,与单纯硬化组36．3％比较,差异有统计学意义（P ＝0．038）,与肝癌组 G1764A 变异检出率分别是73．0％,与对照组比较具有显著性差异（P ＝0．0411）。单纯肝硬化组、结节性增生组 BCP 基因变异（＋）组,HBV DNA 载量2．18×107、1．2×106高于基因变异（-）组1．18×104、2．95×103,差别有统计学意义（P ＝0．0451,P ＝0．0412）;结节性增生组、肝癌组 BCP 基因变异（＋）组HBeAg 定量750．00 IU／mL,1300．00 IU／mL 高于基因变异（-）组416．13 IU／mL,927．60 IU／mL 差别有统计学意义（P ＝0．0451,P ＝0．0073）。结论前 C 区变异与乙肝肝硬化结节样变临床进展为肝癌无关,而 BCP 区变异与乙肝结节样变临床进展为肝癌有关。