HAI-1基因不同功能域的原核表达载体构建及融合蛋白表达

目的:分段克隆1型肝细胞生长因子激活剂抑制因子(HAI-1)基因的功能域并在大肠杆菌中表达,为进一步研究HAI-1的生物学功能打下基础。方法:针对HAI-1的不同功能域设计相应的5对引物,分别扩增KD1、KD1 LDLR、KD2、LDLR KD2和KD1 LDLR KD2片段。将PCR产物克隆至pGEM-TEasy载体中并经测序鉴定。将5个cDNA片段亚克隆至具有6个组氨酸标签(His-Tag)的原核表达载体pIVEX2.3-MCS中。以上述表达不同功能域的载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物以Westernblot进行鉴定,并进一步通过镍亲和层析柱纯化His-Tag标记的KD1 LDLR KD2融合蛋白。结果:成功地构建了HAI-1各功能域基因片段的原核表达载体。Westernblot分析证实,在大肠杆菌BL21(DE3)中分段表达了5种HAI-1不同功能域的His-Tag融合蛋白,并通过亲和层析法纯化到了相对分子质量为22200的KD1 LDLR KD2融合蛋白。结论:重组质粒pIVEX2.3-MCS/HAI-1能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,纯化的融合蛋白可用于研究HAI-1不同功能域的生物学作用。     

小鼠cdc25B蛋白特定序列的克隆及原核表达

目的:构建小鼠cdc25B蛋白特定序列的原核表达载体,并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白。方法:采用PCR方法从小鼠cdc25B野生型及位点突变型蛋白编码序列中扩增出约360个碱基的片段,构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后进行融合蛋白表达。Western blot鉴定表达产物。结果:构建出带有GST标签的原核表达载体,在大肠杆菌BL21中表达出相对分子质量(Mr)为40000的重组蛋白质,经Westernblot鉴定,可与GST单克隆抗体结合,发生特异性反应。结论:利用原核表达系统成功表达出小鼠cdc25B蛋白特定序列的蛋白质,为进一步探讨与其他蛋白相互作用提供了基础。     

BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定

目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirAsubstratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化。结论:成功地制备了具有生物学活性的Bi-rA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。     

鸡IL-2基因的扩增、表达及生物学活性鉴定

目的:扩增鸡IL2基因,并在大肠杆菌中表达及活性鉴定。方法:从ConA激活的AA肉鸡脾淋巴细胞中提取mRNA,以RTPCR法扩增鸡IL2cDNA,将其克隆到原核表达载体pGEX6P1中,构建重组质粒pGEXIL2。以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。并用淋巴细胞增殖试验及Westernblot检测表达产物的生物学活性。结果:以重组质粒转化大肠杆菌经IPTG诱导后,经SDSPAGE后薄层扫描分析证实,融合表达产物GSTIL2表达量占表达菌菌体总蛋白的30.8%。Westernblot分析表明,在相对分子质量(Mr)为42000处有一条特异性的带。经淋巴细胞增殖试验证实,该表达产物可明显增强淋巴细胞增殖。结论:鸡IL2基因在大肠杆菌中获得了高效表达,表达产物具有良好的生物学活性。     

纳豆激酶酶原基因的克隆、融合表达及活性测定

目的:利用基因工程技术, 构建表达具溶栓活性的纳豆激酶的大肠杆菌工程菌。方法:利用PCR方法扩增纳豆激酶酶原(pro-NK)基因, 并克隆到表达载体pET3c上, 构建表达pro-NK和载体上22氨基酸短肽的融合蛋白的表达质粒pENK;表达质粒pENK分别转化溶源化宿主菌BL21(DE3)pLysS^-和BL21(DE3)pLysS⁺, 获得表达菌pENK-(DE3)pLysS^-和pENK-(DE3)pLysS⁺。利用SDS-PAGE和纤维蛋白平板法检测目的蛋白的表达及活性。结果:SDS-PAGE显示两株菌株均表达42kD的目的蛋白。纤维蛋白平板法显示表达产物具溶栓的活性。在pENK-(DE3)pLysS^-中融合蛋白不需异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导就有基础表达, 融合蛋白的表达使表达菌细胞溶解, 菌落中空, 表明表达产物具细胞毒作用。结论:本研究成功实现了在大肠杆菌表达具有溶栓活性的pro-NK融合蛋白, 为开发纳豆激酶成为新一代溶栓药物的研究奠定基础。     

结核分枝杆菌Zmp1基因原核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建结核分枝杆菌锌离子依赖的金属蛋白酶1(Zmp1)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,采用PCR法扩增Zmp1基因;定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-Zmp1;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot法鉴定。结果PCR法扩增出Zmp1基因;重组表达质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;表达的重组Zmp1融合蛋白相对分子质量(Mr)约为94 000,大小与预期融合蛋白一致;重组Zmp1融合蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了Zmp1基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组Zmp1融合蛋白表达。     

融合基因EGFRi-IL-24真核表达载体的构建与表达

人工合成表皮生长因子受体干扰序列(epithelial growth factor receptor interference,EGFRi),应用重叠延伸PCR(Overlapping PCR)技术将其与白细胞介素-24(IL-24)连接,并在其间引入一段柔软短肽(Gly4Ser3)。进行序列分析后,将融合基因EGFRi-IL-24重组到表达质粒pPIC9k中,Sal I酶切线性化重组质粒EGFRi-IL-24/pPIC9k,电击转化毕赤酵母GS115,经G418抗性和PCR筛选得到阳性重组菌株。重组菌株用甲醇进行诱导表达后,通过SDS-PAGE和MTT法分析鉴定蛋白表达产物。结果证实EGFRi-IL-24在毕赤酵母中获得了分泌性表达的活性蛋白,为进一步研究其生物学功能及临床应用奠定了基础。     

抗KDR单链抗体的构建、表达及生物学活性鉴定

目的: 构建并表达抗人血管内皮生长因子受体KDR单链抗体(scFv)蛋白, 并测定其生物学活性。方法: 设计合成抗KDR单抗 (mAb)Ycom1D3VH、VL引物, 通过重叠延伸拼接 (splicingoverlapextensive, SOE)PCR, 在VH 和VL基因间引入柔性短肽(Gly4Ser)3, 构建抗KDRscFv基因并进行序列分析。将其克隆入pAYZH原核表达载体, 在大肠杆菌中诱导表达, 并以ELISA及免疫荧光结合实验测定重组蛋白的生物学活性。结果: 序列分析表明, 抗KDRscFv基因的全长为 729bp, 编码 243个氨基酸。将重组体表达产物进行SDS PAGE及Westernblot分析显示, 融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为 30 000, 同预期的结果一致。表达产物主要以不溶性包涵体的形式存在, 表达量占菌体总蛋白的 20%。表达产物经变性、纯化及体外复性后, 纯度达 90%以上。ELISA和竞争性免疫荧光结合实验显示, 重组小分子scFv可与可溶性KDR抗原及表达KDR受体的人脐静脉内皮细胞特异性结合, 保留了亲本mAb的抗原结合活性。结论: 成功地构建了抗KDRscFv基因, 并在大肠杆菌中功能性表达, 为靶向诊断、治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。     

人FGF12融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的：在原核表达系统中获得高效表达的人成纤维生长因子12融合蛋白。方法：采用逆转录PCR方法获得hFGF12 cDNA，将其连接到pET 28a原核表达载体，转化入BL21(DE3)菌中表达，经金属螯合亲和层析法和肝素亲和层析法纯化，以刺激NIH 3T3成纤维细胞增殖实验；测定纯化的hFGFl2融合蛋白活性。结果：表达产物经SDS-PAGE电泳，在Mr31000附近新增一条明显区带，与预期的相对分子质量相符。重组融合蛋白能刺激NIH3T3细胞增殖。结论：在大肠杆菌中表达了具有促有丝分裂活性的融合蛋白。     

天花粉蛋白突变体TCSRL28-29CG的构建、表达与纯化

目的:构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并进行表达及纯化。方法:应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇,并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模扳,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行N i-NTA层析纯化。结果:目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论:成功地构建了TCS突变体基因TCSRL28-29CG,并获得高效表达。     

Monoclonal antibodies against human basic fibroblast growth factor

Recombinant human basic fibroblast growth factor (hbFGF) was used as an antigen to develop, by a somatic cell fusion technique, four monoclonal antibodies (MAbs), that recognize the complete and amino-terminal truncated form of hbFGF. Isotype identification showed that MAbs designated MAb12 and MAb98 were IgG1; and those designated MAb52 and MAb78 were IgG2b. All these MAbs bound the complete form of hbFGF produced in E.coli. Competition with synthetic polypeptides, a replication of 1-9 aa and of 141-146 aa of hbFGF, and truncated forms of hbFGF by 13 and 40 amino acid residues in its amino-terminal produced in E. coli by recombinant technique, revealed at least two epitopes recognized by the four IgG type MAbs. MAb12 and MAb78 recognized the epitope located within the first 9 amino acid residues at the amino terminal of the complete hbFGF. MAb52 and MAb98 recognized the one located between the amino acid residue no. 14 and 40. None of MAbs bound bovine acidic FGF (aFGF). Using MAb52 or MAb98 and MAb78, a two-site EIA has been developed. This EIA is sensitive enough to detect 0.5 ng/ml of hbFGF. Furthermore, MAb78 was used as a ligand for affinity chromatography to purify hbFGF mutein CS4, which binds weakly to a heparin affinity column.     

Secretion of biologically active human epidermal growth factor from Escherichia coli using Yersinia pestis Caf1 signal peptide.

BACKGROUND AND PURPOSE: The Caf1 secretion pathway of Yersinia pestis is one of the most well-characterized export machineries. To facilitate the secretion of human epidermal growth factor (hEGF) in Escherichia coli, a DNA fragment containing the synthetic gene for hEGF was joined to a sequence encoding the signal peptide of Yersinia pestis Caf1 protein. METHODS: The gene for hEGF was synthesized by overlapping polymerase chain reaction technique and was placed under the control of the caf1 gene promoter in the recombinant plasmid pHL401 which was used to transfect E. coli BL-21 for production of hEGF. The biological function of recombinant hEGF was measured by estimating its ability to stimulate the proliferation of human embryonic kidney-293 cells. RESULTS: The results indicated that the expressed hybrid protein was processed during the secretion process. The majority of the mature hEGF was recovered from the periplasm and medium fractions, with a small amount of the expressed hEGF deposited in the cytoplasm. Furthermore, it was found that the cell proliferation was enhanced by the recombinant hEGF. CONCLUSION: These results suggested that the recombinant hEGF was successfully secreted through the inner membrane of cells into the periplasm and then through the outer membrane into the medium via the action of the signal peptide of Y. pestis Caf1 in E. coli. The mitogenic activity of hEGF in cells was demonstrated.     

重组人碱性成纤维细胞生长因子结构类似物在大肠杆菌中的高效稳定表达研究(英)

目的：用基因工程的方法获得高效稳定表达的重组人碱性成纤维细胞生长因子结构类似物。 方法： 利用定点突变技术，将天然hbFGF的第78与96位半胱氨酸替换为丝氨酸，通过载体pET-3c，突变基因被克隆并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plysS，IPTG诱导表达后，SDS-PAGE分析蛋白表达结果。 结果： 纯化后突变蛋白的可溶性成分大幅度增加，而二聚体与多聚体显著减少至纯化后总蛋白的8％以下。MTT法的结果表明，结构类似物蛋白具有良好的生物学活性。这种新的结构类似物蛋白能较好地替代天然hbFGF在临床上的使用。 结论： 在不影响生物学活性的条件下，对个别氨基酸残基进行突变以获得新的结构类似物的方法，能够有效提高外源蛋白在大肠杆菌中表达的稳定性及可溶性。     

Production and secretion of biologically active human epidermal growth factor in Yarrowia lipolytica

The gene encoding human epidermal growth factor (hEGF) was expressed as a fusion protein with the leader peptide and pro I region of alkaline extracellular protease in the yeast Yarrowia lipolytica. hEGF was purified from culture supernatant by reverse-phase chromatography and analysed by Western-blot hybridisations. The biologically active hEGF in the purified sample was assayed using the radioreceptor assay and estimated to be 100 μg/l. However, the level of expression was found to be substantially low compared to the levels of homologous protein, alkaline extracellular protease (AEP), possibly due to degradation by secreted acid protease(s). A novel and sensitive bioassay was developed to determine the biological activity of hEGF produced at low levels and is based on the effect produced by hEGF in the regenerating tails of the wall lizard. Intramuscular injections of culture supernatant from the recombinant yeast and the standard hEGF led to a drastic reduction in tail regeneration confirming the biological activity of the recombinant hEGF. Received: 15 August / 19 September 1997     

白细胞介素-24基因重组表达载体的构建及原核表达

目的：构建人白细胞介素-24(hIL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：用PCR从质粒TRAP-IL-24中扩增hIL-24 cDNA片段，并将该片段插入pGEX-KG原核表达载体中，实现插入基因的融合表达。用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GST-IL-24融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实，成功地构建了pGEX-KG-IL-24原核表达载体，并在大肠杆菌中获得稳定的表达，表达产物的相对分子质量(M1)同预期值相-致。GST-IL-24融合蛋白能够抑制THP-1细胞的生长。结论：成功地构建了重组表达载体pGEx-KG-IL-24，并在E．coli BL21中表达了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白，为下-步研究人IL-24的功能奠定了基础。     

兔抗人唾液酸转运蛋白抗体的制备及特性鉴定

目的：制备兔抗人唾液酸转运蛋白（sialin）的抗体，并进行特性鉴定。方法：应用RT—PCR从培养的人颌下腺细胞系HSG中扩增编码sialin N端1～38氨基酸的DNA序列，构建重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin，测序鉴定后，转化大肠杆菌JM109，在0．1 mmol／L IPTG的诱导下表达GST—sialin融合蛋白。经SDS-PAGE鉴定后，利用GSTrap FF^TM柱纯化融合蛋白，并以其免疫家兔制备抗人sialin抗体。用ELISA法测定兔抗sialin血清的效价；用Western blot及免疫细胞化学等方法鉴定抗血清的特异性。结果：构建了重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin；以其转化大肠杆菌在IPTG诱导下，获得以可溶性形式表达的GST-sialin融合蛋白；表达的GST—sialin经GSTrap FF^TM柱纯化后，免疫家兔制备出抗sialin抗血清，ELISA法测定抗血清的效价为1：32000。Western blot鉴定表明，制备的抗sialin抗体可特异地识别HSG细胞中相对分子质量（Mr）约55000的sialin蛋白。免疫细胞化学检测表明，sialin抗血清识别的抗原定位于HSG细胞的细胞质和胞核。结论：成功地制备出兔抗人sialin抗血清，为进一步研究sialin在涎腺组织的功能奠定了基础。     

重组基因c-Aβ-c的构建及其表达蛋白的免疫原性分析

目的:构建原核表达质粒pHGhis/c-Aβ-c,并在大肠杆菌中表达,观察融合蛋白c-Aβ-c的免疫原性,为阿尔茨海默病(AD)基因工程疫苗的研究打下基础。方法:采用PCR法,分别扩增编码HBcAg的1~71、88~144氨基酸的基因片断(HBc1~71和HBc88~144),以及编码淀粉样肽Aβ1-42的基因。将后者连接于HBc1~71和HBc88~144之间,构建重组质粒pGEMEX/c-Aβ-c,并将重组基因亚克隆于原核表达载体pHGhis中,构建表达质粒pHGhis/c-Aβ-c,通过温度诱导表达。用SDS-PAGE(考马斯亮蓝染色)检测融合基因的表达。以融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-Aβ抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、DNA序列测定证实,融合基因重组于表达质粒之中,表达质粒与理论设计相符。诱导表达后,表达蛋白约占细菌沉淀的16%。BALB/c小鼠经3次免疫后,其血清中抗-Aβ抗体的滴度可达1∶16000,且检测不到抗-HBcAg抗体。结论:c-Aβ-c融合基因在大肠杆菌中可高效表达,表达的融合蛋白具有较强的免疫原性。     

人GITR_(aa27-165)蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的: 表达和纯化人GITR胞外段(hGITRaa27-165)融合蛋白, 制备hGITRaa27-165融合蛋白的兔源性多克隆抗体(pAb).方法: 利用PCR从pGEM T-hGITR获得hGITRaa27-165编码序列, 将其亚克隆至原核表达载体pQE30, 构建重组表达质粒pQE30-hGITRaa27-165; 将阳性重组质粒转化大肠杆菌, IPTG诱导表达融合蛋白, 通过Profinity IMAC Ni-Charged Resin亲和层析柱进行纯化; 纯化蛋白免疫新西兰大白兔, 获取多克隆抗血清并利用Protein A Sepharose柱进行纯化, ELISA法检测抗体效价, Western blot法检测抗体特异性.结果: 构建了pQE30-hGITRaa27-165原核表达载体, 原核蛋白hGITRaa27-165蛋白以包涵体形式在大肠杆菌得到高水平表达, 通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的hGITRaa27-165蛋白, 蛋白浓度为400 mg/L, 制备的抗hGITRaa27-165多抗效价高达1:1.6×105, Western blot鉴定其具有良好的特异性.结论: 获得高纯度hGITRaa27-165蛋白, 并制备特异性pAb, 将为进一步研究hGITR的生物学功能提供实验基础.     

人CD154-GST融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:为制备重组人CD154-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(hCD154-GST),用于人CD154单克隆抗体研制。方法:根据人CD154基因序列设计合成特异性引物,RT-PCR扩增人CD154基因,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154;用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD154蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果:从人外周血淋巴细胞扩增出820bp的hCD154cDNA;将其克隆至pGEX-4T-1质粒中,经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因;IPTG诱导后的大肠杆菌经SDS-PAGE电泳鉴定出现明显的55kD蛋白带。结论:成功构建了人CD154-GST原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出人CD154-GST融合蛋白,为人CD154单克隆抗体的研制及进一步抗排斥反应的研究打下了基础。