疏水层析法和凝胶过滤法分离HI47抗CD20 F(ab'''')2之比较

目的　比较疏水层析和凝胶过滤两种方法分离纯化HI4 7抗CD2 0F(ab’) 2 的优缺点。方法　采用亲和层析柱protein G对发酵菌体裂解液进行粗纯化,分别采用疏水层析法和凝胶过滤法进行抗CD2 0F(ab’) 2 的分离纯化:疏水层析采用梯度洗脱,80 %B液洗脱2 0min ,10 0 %B液洗脱30min ;凝胶过滤以5 0mmol LPB缓冲液(pH 7.0 ) ,0 .8mL min洗脱4h。结果　粗纯化产物主要含F(ab’) 2 、Fab’,含量分别为19.6 %、5 9.7%。采用疏水层析法1h即可完成分离,F(ab’) 2 回收率为6 7% ,纯度为89.3% ;凝胶过滤4h完成分离,F(ab’) 2 回收率为6 5 % ,纯度为90 .5 %。FACS结果表明,两者结合Raji细胞的阳性率分别为99.93%和99.97%。结论　疏水层析分离纯化抗CD2 0F(ab’) 2 简单、快速、回收率高、纯度高,适用于大规模的工业化生产。     

嵌合抗CD20Fab诱导Daudi细胞凋亡

为了研究嵌合抗CD20基因工程抗体Fab的抗肿瘤活性及其抗肿瘤机制,本研究采用竞争性免疫荧光抑制实验,证实抗CD20 Fab片段能竞争性抑制亲本鼠源性抗CD20单克隆抗体HI47和Daudi细胞CD20的结合。MTT法测定嵌合抗CD20 Fab对Daudi细胞生长的影响,结果显示嵌合抗CD20 Fab对Daudi细胞的生长具有抑制作用,抑制作用呈剂量依赖性,其IC50为69μg/ml;利用流式细胞仪测定嵌合抗CD20 Fab诱导细胞凋亡作用,结果显示嵌合抗CD20 Fab可诱导 Daudi细胞凋亡,其凋亡率是Rituxan的2倍。这些实验结果证实嵌合抗CD20 Fab通过诱导Daudi细胞凋亡的机制抑制Daudi细胞生长。     

疏水层析法和凝胶过滤法分离H147抗CD20F（ab’）2之比较

目的比较疏水层析和凝胶过滤两种方法分离纯化H147抗CD20F(ab’)2的优缺点。方法采用亲和层析柱protein-G对发酵菌体裂解液进行粗纯化，分别采用疏水层析法和凝胶过滤法进行抗CD20F(ab’)2的分离纯化：疏水层析采用梯度洗脱，80％B液洗脱20min，100％B液洗脱30min；凝胶过滤以50mmol／L PB缓冲液(pH7．0)，0．8ml/min洗脱4h。结果粗纯化产物主要含F(ab’)2、Fab’，含量分别为19．6％、59．7％。采用疏水层析法1h即可完成分离，F(ab’)2回收率为67％，纯度为89．3％；凝胶过滤4h完成分离，F(ab’)2回收率为65％，纯度为90．5％。FACS结果表明，两者结合Raji细胞的阳性率分别为99．93％和99．97％。结论疏水层析分离纯化抗CD20 F(ab’)2简单、快速、回收率高、纯度高，适用于大规模的工业化生产。     

嵌合抗CD20抗体Fab片段在大肠杆菌中表达及活性鉴定

目的 :构建抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段表达载体 ,并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达。方法 :利用PCR方法从抗CD2 0 单链抗体 (ScFv)表达载体上扩增抗CD2 0 抗体轻链可变区基因 (VL)、重链可变区基因 (VH) ,然后将VH、VL 基因重组到Fab表达载体pYZF中 ,构建抗CD2 0 Fab表达载体pYZF1cd2 0 ,并在 2 7C7菌中高效表这。结果 :经Fab表达载体转化的 2 7C7菌株 ,进行表达培养 ,经分离纯化获得具有CD2 0 特异结合活性的Fab片段 ,竞争性免疫荧光抑制实验表明 ,表达产物Fab片段能竞争性抑制鼠源性抗CD2 0 抗体HI47和CD2 0 表达细胞Raji细胞结合。结论 :在大肠杆菌中高效可溶性分泌表达有活性的抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段。     

两株抗人CD40配体单克隆抗体的制备及生物学特性的研究

目的 :研制功能性抗CD4 0L单克隆抗体 ,探讨其生物学特性及其运用价值。方法 :采用B淋巴细胞融合、免疫荧光、免疫印迹和竞争抑制等方法获得鼠抗人CD4 0LmAb ,通过Daudi细胞生长抑制试验、混合淋巴细胞反应观察抗CD4 0LmAb的生物学功能。结果 :经表型分析、Westernblot和竞争抑制试验 ,证实mAbB1、mAb4F1是识别人CD4 0L分子的特异性单抗 ,且识别的位点不同 ;mAbB1、mAb4F1均能不同程度地拮抗CD4 0L TC介导的Daudi细胞生长抑制和抑制混合淋巴细胞反应。结论 :成功地获得两株能稳定分泌特异性抗人CD4 0L单克隆抗体的杂交瘤 (1B1、4F1) ,这两株单抗对CD4 0L的生物学功能具有明显的阻断作用 ,为阻断型单抗     

抗人CD20单克隆抗体诱导Daudi细胞凋亡的功能研究

目的　观察由基因重组抗原制备的抗人CD2 0单克隆抗体 (CD2 0 McAb) 1- 2 8对B淋巴瘤细胞的促凋亡作用 ,并探讨其作用机理。方法　利用流式细胞术测定所获 1- 2 8单抗对标准CD2 0 FITC单抗的竞争抑制作用及对胞内游离钙的影响 ;通过电镜观察其诱导Daudi细胞凋亡后形态上的改变 ,免疫印迹实验显示Daudi细胞凋亡后功能上的变化。结果　 1- 2 8能明显竞争标准CD2 0 FITC单抗与Daudi细胞表面CD2 0分子的结合。电镜结果证实了 1- 2 8能够促进Daudi细胞发生凋亡的结论 ;实验结果显示Daudi细胞与 1- 2 8作用后胞内游离钙浓度明显升高 (P <0 .0 5 ) ,细胞内Bcl 2蛋白和caspase酶原的表达量下降 ,而Bax蛋白和caspase酶原降解的活性产物表达增加。结论　 1- 2 8能竞争结合Daudi细胞表面的CD2 0分子并诱导其发生凋亡     

抗人卵巢癌×抗人CD3×抗CD28VH单链三特异抗体的胞内可溶表达、纯化及体外活性测定

目的　研究抗人卵巢癌 (ovariancarcinoma ,oc)×抗人CD3×抗CD2 8VH 单链三特异抗体(singlechaintrispecificantibody,scTsAb)在大肠杆菌中的可溶表达与纯化及纯化后产物的活性测定 ,从而为其应用于卵巢癌治疗的临床研究打下基础。方法　将已构建的scTsAb表达载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)Star菌株 ,采用低温 (30℃ )、低剂量IPTG(0 .2mmol L)诱导 ,进行胞内可溶表达。根据抗卵巢癌三特异抗体 (ocTsAb)等电点较高 (pI9.0 ) ,而菌体蛋白大多为酸性蛋白的特点 ,利用DEAE弱阴离子交换层析(pH8.0 )进行一步纯化 ,并利用ELISA及FACS的方法检测纯化后抗卵巢癌三特异抗体的活性。结果　(1)SDS PAGE鉴定低温诱导时可溶比例达到 5 6 %。 (2 )绝大多数菌体蛋白被DEAE层析柱吸附 ,而抗卵巢癌三特异抗体在穿透液中流出 ,SDS PAGE检测纯度达到 90 %。 (3)ELISA结果显示纯化后的抗卵巢癌三特异抗体与重组CD2 8纯抗原 ,Jurkat(CD3 )细胞膜提取抗原 ,SKOV3细胞膜提取抗原均有特异性结合。 (4 )FACS结果证明纯化后的抗卵巢癌三特异抗体与Jurkat(CD3 )活细胞、SKOV3活细胞有特异性结合。结论　低温诱导胞内可溶表达的抗人卵巢癌×抗人CD3×抗CD2 8VH 单链三特异抗体经弱阴离子交换层析一步纯化后仍保持原有免疫学活性 ,这     

分化抗原gp42在人免疫细胞的表达

目的　明确gp4 2蛋白为分化抗原 ,检测它在人免疫细胞的表达。方法　用gp4 2蛋白免疫小鼠 ,制备抗gp4 2蛋白的单抗。用反义技术制备gp4 2蛋白表达抑制的 3D5细胞。用免疫荧光染色和Western印迹确定gp4 2单抗的特异性。用胞膜蛋白免疫沉淀和流式细胞术确定gp4 2蛋白为分化抗原。用双色免疫荧光染色流式细胞术检测gp4 2分化抗原在多种人免疫细胞的表达。结果　制备了抗gp4 2蛋白的特异性单抗。用gp4 2单抗作探针 ,从 3D5细胞膜免疫沉淀到相对分子质量 (Mr)为4 2 0 0 0的一条蛋白带 ,并在活 3D5细胞见阳性免疫荧光染色。gp4 2分化抗原在人外周围血CD19+ 、CD14 + 、CD4 + 、CD8+ 和CD5 6 + 细胞的表达率分别为 5 9.71%± 11.36 %、89.0 8%± 4 .87%、2 6 .0 3%±9.75 %、2 4 .2 4 %± 15 .2 9%和 2 4 .2 0 %± 15 .72 % ,在人免疫细胞株的表达率分别为 5 8.0 % (Nalm6 )、72 .7% (3D5 )、5 3.6 % (BJAB)、6 1.0 % (Daudi)、6 .9% (SKW6 )、6 .3% (Jurkat)、5 .8% (Peer)、2 1.3% (K5 6 2 )和 39.1% (U937)。结论　gp4 2蛋白为一个分化抗原 ,在人外周围血CD14 + 细胞的表达率最高 ,其次为CD19+ 细胞 ,CD4 + 、CD8+ 和CD5 6 + 细胞的表达率较低。     

CD80人-鼠嵌合抗体对B淋巴瘤细胞株Raji与Daudi的生长抑制及杀伤作用

目的:研究CD80人-鼠嵌合抗体(命名为ch-4E5)对天然高表达CD80分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji与Daudi的生长抑制及杀伤作用.方法:采用免疫荧光及流式细胞术(FCM)分析ch-4E5对Raji及Daudi细胞膜型CD80分子的识别;将ch-4E5分别加入到Raji及Daudi中共培养, 终浓度为10 mg/L.在培养的第0、 4、 10、 16、 24及48 h, 采用FCM检测细胞表面Fas及FasL的表达;培养至72 h, MTT法检测细胞的增殖;以人外周血PBMC为效应细胞, Raji与Daudi为靶细胞, 效靶比为20∶ 1, 加入ch-4E5, 终浓度为10 mg/L.培养至24 h, MTT法分析ADCC效应.结果:ch-4E5与Raji及Daudi的阳性结合率分别为98.6%和96.4%.ch-4E5分别与Raji及Daudi共培养至4 h, Raji细胞表面FasL的表达开始上调, 16 h的阳性表达率为16.8%, 与人IgG1对照组1.5%比较明显升高(P<0.01);Fas的表达从10 h起逐渐增高, 24 h达高峰, 阳性表达率为15.6%, 与人IgG1对照组4.5%比较具有统计学意义(P<0.01).Daudi的FasL及Fas的变化趋势与Raji一致.ch-4E5分别与Raji及Daudi共培养至72 h, 细胞增殖的抑制率分别为34.60%和32.64%(P<0.01);ch-4E5介导PBMC对Raji及Daudi的杀伤率分别为55.61%及54.42%(P<0.01).结论:CD80人-鼠嵌合抗体能够通过其Fab段及Fc段发挥双重的抗肿瘤效应.     

小鼠抗人B7-1单克隆抗体抑制肿瘤细胞增殖的蛋白质组学分析

目的：研究鼠抗人单克隆抗体B7-1对恶性肿瘤细胞株Daudi（天然表达B7-1分子）体外生长、蛋白表达谱及信号通路的影响。方法：(1)采用诱生腹水法制备小鼠抗人B7-1单克隆抗体（4E5 mAb）,应用Protein A免疫层析法进行亲和纯化,流式细胞术对其纯化后产物的活性进行识别鉴定;(2)利用MTT法检测不同浓度的4E5 mAb(5、10、20、40μg/ml)对Daudi细胞体外增殖的影响;(3)应用Label-free蛋白定量技术分析比较4E5 mAb(20μg/ml)处理Daudi细胞48 h后与其对照组（同型对照IgG）蛋白质的差异表达情况,采用平行反应监测（PRM）对差异表达蛋白进行定量验证;(4)根据蛋白质的GO注释和生物信息学工具KEGG数据库将鉴定出来的差异蛋白质进行生物信息学富集分析。结果：(1)获得单克隆抗体的量为3.83 mg/ml,该抗体与Daudi肿瘤细胞的阳性结合率为93.7%;(2)当抗体终浓度为20μg/ml时,4E5 mAb显著抑制Daudi细胞的增殖;(3)与IgG对照组相比,4E5实验组鉴别出169个蛋白质的定量水平差异有统计学意义,其中131...     

Modes of Inheritance of Errors of Refraction

Eighteen families in which both parents had refractions within the range of +4·0 D to −4·0 D and axial lengths seen in emmetropia (22·3-26·0 mm) showed coefficients of correlation of the order 0·5 indicative of polygenic inheritance. Such coefficients were seen for axial length (0·407) and for the cornea (0·487), but not for the lens (which is known to be yoked to the axial length). No such coefficients were seen in 19 families in which one of the parents had axial length outside the emmetropic range (nine families with long axes and 10 with short axes).

The pattern of polygenic inheritance for emmetropia (completely correlated optical components) and errors of refraction up to 4·0 D (inadequately correlated components: correlation ametropia) follows that seen in stature and other measurable characters. In contrast the high refractive errors with their abnormal axial lengths (component ametropia) are—like the extremes in stature—pathological anomalies with monofactorial inheritance.

     

Level of functioning of siblings and parents of probands of varying degrees of retardation

A further analysis of already published data supports the position that retardates of low ability level less frequently have retarded siblings, retarded parents, and parents low in occupational level than do retardates higher in ability level. The analysis supports the position that there are two types of retarded individuals, persons retarded as a result of gene or chromosomal anomalies, brain injury, etc., who more frequently occur in the lower-level retardate group, and persons whose retardation represents polygenic segregation, who more frequently occur in the higher-level group.     

局部注射辛伐他汀对骨质疏松大鼠股骨髁骨小梁的改建效应

背景：局部注射具有成骨作用的辛伐他汀,可显著增加骨质疏松大鼠股骨颈及股骨髁部的骨密度及力学强度,分析局部注射辛伐他汀对股骨髁骨小梁的影响。 目的：进一步研究骨质疏松大鼠股骨内局部注射辛伐他汀对股骨髁骨小梁的影响。为将辛伐他汀应用于临床骨质疏松局部治疗提供实验基础。 方法：18只雌性SD大鼠双侧卵巢切除后3个月,制备大鼠骨质疏松模型。实验大鼠随机数字表法均分为3组,分别在实验大鼠的右侧股骨髓腔内单次注射辛伐他汀溶液5 mg、10 mg,对照组单纯注射空白载体。分别在注射后1个月处死大鼠并取材。Micro-CT扫描并定量分析骨组织形态变化。 结果与结论：给药后1个月,Micro-CT扫描结果显示,辛伐他汀治疗组的骨微结构参数如骨皮质厚度、骨小梁密度及连接率明显优于对照组。说明疏松骨骼单次注射小剂量辛伐他汀可显著促进股骨髁部骨小梁改建,改善骨骼微结构,可为强化局部、防治骨质疏松骨折的新选择进一步提供实验基础。