基因修饰的树突状细胞体外免疫功能的初步研究

目的 制备转染乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因、人外周血单个核细胞(PBMC)来源的树突状细胞(DC)疫苗,观察HBcAg的表达效率,检测其在体外诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)对HepG2.2.15细胞的杀伤效应.方法 体外诱导并培养DC;将HBcAg基因导入...     

致敏树突状细胞疫苗抗小鼠乳腺癌的实验研究

目的研究以EMT6乳腺癌细胞致敏的树突状细胞(DC)疫苗的抗肿瘤作用。方法无菌取小鼠骨髓细胞,在体外培养条件下经细胞因子诱导为DC,用EMT6肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏DC,检测经DC免疫产生的细胞毒T淋巴细胞(CTL)体外杀伤肿瘤细胞的活性。建立EMT6荷瘤小鼠模型,随机分为实验组、实验对照组和空白对照组,于肿瘤接种后第7、14天给予相应DC疫苗治疗,观察致敏DC免疫对小鼠乳腺肿瘤模型的治疗作用。结果致敏DC诱导生成的特异性CTL在体外对肿瘤细胞可产生杀伤作用,与PBS对照组比较,差异有显著性(P<0.05);经致敏DC注射免疫后,小鼠移植瘤得到抑制,与PBS对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。结论以EMT6乳腺癌细胞致敏的树突状细胞(DC)疫苗在体外和小鼠体内均显示了抗肿瘤作用。     

树突状细胞/肿瘤细胞融合诱导的抗肺癌CTL作用的初步究

目的探讨人源树突状细胞/肿瘤细胞融合诱导的抗肺癌CTL作用。方法培养体系中加入rhGM-CSFrhIL-4rhTNF-α等细胞因子诱导人骨髓来源树突状细胞,并与原代培养的人肺癌细胞融合;以融合细胞诱导外周血产生CTL并测定其细胞毒性。结果骨髓单个核细胞在rhGM-CSFrhIL-4rhTNF-α等细胞因子存在下培养10～12d,出现典型的成熟树突状细胞。体外诱导的人骨髓来源树突状细胞（DC）表达较高水平HLA-DR、CD86。对照DC和肿瘤细胞表达相应检测的单种抗原,而融合细胞两种抗原的表达水平均较高。DC/肺癌细胞融合在体外能有效诱导CTL产生,后者对靶细胞产生较强的细胞毒作用。结论通过本课题的研究证实DC与肿瘤细胞融合技术制备的肿瘤疫苗代表一类更为有效的抗肿瘤免疫策略。     

MAGE-1相关肽抗原致敏DC活化的淋巴细胞对HCC细胞的体外杀伤作用

目的观察MAGE-1九肽致敏树突状细胞(DC)活化的淋巴细胞对HCC细胞的体外杀伤作用,确定MAGE-1九肽负载DC作为HCC疫苗的可能性。方法用MAGE-1九肽负载DC并活化T淋巴细胞,以不同效靶细胞的比例对正常肝细胞、黑色素瘤细胞、HCC细胞进行杀伤实验,3H掺入法测定杀伤率。结果用MAGE-1九肽负载DC并活化T淋巴细胞对黑色素瘤细胞及HCC细胞均有明显杀伤作用,而对正常肝细胞无杀伤作用;无关抗原负载的DC所活化的淋巴细胞对三种细胞均无杀伤作用;无抗原负载的DC其活化淋巴细胞对靶细胞亦无杀伤作用。结论MAGE-1九肽致敏DC活化淋巴细胞对HCC细胞有明显杀伤作用,MAGE-1基因可作为免疫治疗HCC的攻击靶点,MAGE-1九肽与DC联合可成为免疫治疗HCC的疫苗。     

多表位BCR—ABL融合抗原体外诱导对白血病原代细胞的特异性杀伤

目的 体外观察多表位BCR—ABL融合抗原诱导对白血病细胞的特异性杀伤效应，探索慢性髓细胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)免疫治疗新途径。方法从外周血单个核细胞培养DC，以BCR—ABL融合抗原脉冲刺激DC，诱导特异性CTL产生；MTT法检测CTL对白血病靶细胞的特异性杀伤活性。结果 融合抗原刺激产生的CTL能特异性杀灭含BCR—ABL融合基因的白血病靶细胞。结论 我们所设计表达的多表位BCR—ABL融合抗原能在体外诱导特异性抗白血病免疫反应，对白血病细胞产生特异性杀伤，为进一步的体内的实验奠定了基础。     

热休克蛋白抗原肽致敏的脐血树突状细胞治疗肺癌的实验研究

目的研究热休克蛋白抗原肽致敏的脐血树突状细胞体外对肺癌细胞的杀伤作用。方法用体外构建的热休克蛋白-抗原肽复合物刺激经组合细胞因子诱导的脐血树突状细胞,MTT法检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。结果所得蛋白经电泳及Western blot进行蛋白分子量及性质鉴定为热休克蛋70。热休克蛋白-抗原肽负载可以促进脐血树突状细胞对T细胞的激发作用,使其对靶细胞有了更强的生长抑制作用。各组T细胞杀伤活性分别为:负载抗原组(85.77±1.03)%(正常T细胞)、(45.01±1.66)%(肺癌患者T细胞);未负载抗原组(41.92±1.38)%(正常T细胞)、(13.99±3.07)%(肺癌患者T细胞)。组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论热休克蛋白抗原肽负载脐血树突状细胞能有效激发外周血T淋巴细胞,使其对靶细胞有了更强的生长抑制作用。本研究为解决树突状细胞的来源及开发特异性CTL的治疗开创了条件。     

MAGE—1相关肽抗原致敏DC活化的淋巴细胞对HCC细胞的体外杀伤作用

目的 观察MAGE—1九肽致敏树突状细胞(DC)活化的淋巴细胞对HCC细胞的体外杀伤作用，确定MAGE—1九肽负载DC作为HCC疫苗的可能性。方法 用MAGE—1九肽负载DC并活化T淋巴细胞，以不同效靶细胞的比例对正常肝细胞、黑色素瘤细胞、HCC细胞进行杀伤实验，^3H掺入法测定杀伤率。结果 用MAGE—1九肽负载DC并活化T淋巴细胞对黑色素瘤细胞及HCC细胞均有明显杀伤作用，而对正常肝细胞无杀伤作用；无关抗原负载的DC所活化的淋巴细胞对三种细胞均无杀伤作用；无抗原负载的DC其活化淋巴细胞对靶细胞亦无杀伤作用。结论 MAGE—1九肽致敏DC活化淋巴细胞对HCC细胞有明显杀伤作用，MAGE—1基因可作为免疫治疗HCC的攻击靶点，MAGE—1九肽与DC联合可成为免疫治疗HCC的疫苗。     

人树突状细胞融合肝癌细胞体外诱导特异性抗肿瘤免疫

目的 探讨人树突状细胞(DC)融合肝癌细胞(HCC)体外诱导T淋巴细胞产生特异性抗肝癌免疫的作用.方法 应用人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素4(rhIL-4)对人外周血单个核细胞进行体外诱导产生树突状细胞,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平,聚乙二醇融合DC与肝癌细胞HerG2,MTT法测定融合细胞(HerG2/DC)刺激T淋巴细胞增生、分化能力,细胞毒性实验检测HerG2/DC诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对HerG2的特异性杀伤作用.结果 融合细胞HerG2/DC刺激T淋巴细胞增值能力明显提高,HerG2/DC活化的CTL对HerG2具有明显的特异性杀伤作用.结论 人树突状细胞融合肝癌细胞可有效诱导T淋巴细胞产生特异性的抗肝癌肿瘤免疫.     

树突状细胞瘤苗诱导的抗神经胶质瘤作用体外实验研究

目的 :研究负载自体神经胶质瘤抗原的树突状细胞 (DCs)瘤苗在体外诱导的特异性细胞毒性淋巴细胞 (CTL)对神经胶质瘤细胞的杀伤效应。方法 :以组合酶消化法从新鲜神经胶质瘤手术标本中获取神经胶质瘤细胞 ,冻融制备神经胶质瘤抗原。GM -CSF、IL -4体外诱导外周血单个核细胞 (PBMC)获得DCs并负载神经胶质瘤抗原 ,继而以其刺激自体T淋巴细胞制备神经胶质瘤抗原特异性CTL ;用CytoTox96TM检测CTL对患自身神经胶质瘤细胞体外杀伤效应。结果 :负载神经胶质瘤抗原DCs诱导的特异性CTL对患者自身神经胶质瘤细胞的杀伤率达88 17 % ,显著高于LAK细胞的杀伤率 (P<0 05)。且其对同种不同分化类型的神经胶质瘤细胞株 (P<0 01)。结论 :负载神经胶质瘤抗原的DCs体外可诱导出高效而特异的抗神经胶质瘤效应 ,提示以DCs为中心的肿瘤生物治疗作用可望提高神经胶质瘤综合治疗水平     

人树突状细胞融合肝癌细胞体外诱导特异性抗肿瘤免疫

目的探讨人树突状细胞（DC）融合肝癌细胞（HCC）体外诱导T淋巴细胞产生特异性抗肝癌免疫的作用。方法应用人重组粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF）和重组人白细胞介素4（rhIL-4）对人外周血单个核细胞进行体外诱导产生树突状细胞,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平,聚乙二醇融合DC与肝癌细胞HerG2,MTT法测定融合细胞（HerG2／DC）刺激T淋巴细胞增生、分化能力,细胞毒性实验检测HerG2／DC诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTL）对HerG2的特异性杀伤作用。结果融合细胞HerG2／DC刺激T淋巴细胞增值能力明显提高,HerG2／DC活化的CTL对HerG2具有明显的特异性杀伤作用。结论人树突状细胞融合肝癌细胞可有效诱导T淋巴细胞产生特异性的抗肝癌肿瘤免疫。     

冻融人外周血树突状细胞基因疫苗体外抗肿瘤活性研究

目的观察EB病毒潜伏膜蛋白重组腺病毒(rAd-EBV-LMP2)转染的冻融人外周血树突状细胞(DC)诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗肿瘤活性。方法人外周血来源的单核细胞经细胞因子扩增培养为成熟DC,液氮冻存;rAd-LMP2重组腺病毒转染冻融DC制备疫苗。动态观察细胞形态学特征,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测DC疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖活性,以及诱导的CTL对肿瘤细胞的杀伤活性。结果rAd-LMP2转染的冻融DC疫苗具有形态迥异、多突起的典型形态学特征,其刺激同种T淋巴细胞的增殖能力明显高于对照组(P<0.01),能诱导高效的CTL活性(P<0.01),与新鲜DC疫苗差异无统计学意义(P>0.05)。结论rAd-LMP2转染冻融DC疫苗在体外能激发较强的EBV-LMP2特异性的功能性CTL,为EBV相关的鼻咽癌(NPC)的免疫治疗提供策略。     

CpG ODN联合肿瘤抗原致敏的树突状细胞疫苗抑制和预防小鼠黑色素瘤的研究

探讨非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的脱氧寡核苷酸(oligodeoxynucleotide, ODN)联合肿瘤抗原致敏树突状细胞(DC)治疗和预防黑色素瘤的作用。首先从小鼠骨髓中分离得到骨髓来源的树突状细胞(BMDC),并将小鼠黑色素瘤B16细胞来源的全抗原与DC共孵育,采用全硫代修饰的CpG ODN作DC免疫刺激剂,制备DC疫苗。通过测定T淋巴细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对靶细胞B16的杀伤作用来评价该疫苗的体外免疫活性。将疫苗经小鼠腹腔注射,观察其治疗和预防小鼠黑色素瘤的效果。所有动物实验均在中国科学院上海药物研究所实验动物管理委员会(IACUC)的指导和标准下进行。结果显示, CpG ODN和肿瘤抗原联用致敏的DC疫苗能够促进T淋巴细胞增殖,并提高活化的T淋巴细胞对靶细胞B16的杀伤活性。体内实验表明,无论是治疗实验还是预防实验, DC疫苗组的平均瘤重和瘤体积均低于PBS对照组。实验结果证明基于CpG ODN和黑色素瘤肿瘤抗原制备的DC疫苗对肿瘤具有较好的抑制作用,为恶性黑色素瘤治疗提供了一个潜在的方案。     

树突状细胞诱导的淋巴因子激活的杀伤细胞对肺癌细胞系A549的体外杀伤作用

目的:探讨负载肺癌抗原的树突状细胞(dendritic cells,DC)诱导淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞对肺癌细胞A549的杀伤作用.方法:采用肺癌患者外周血单个核细胞(PBMC)经rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-a诱导和肿瘤冻融抗原刺激诱导获得的DC与LAK细胞按1:20比例共培养2 d,获得Ag-DC-LAK细胞作效应细胞,分别用Ag-Dc-LAK、DC-LAK、Ag-LAK和LAK对肺癌细胞系A549细胞进行杀伤实验.结果:以30μg/mL蛋白的肿瘤抗原负载的DC其表型CD1a、CD80、CD86、HLA-DR均显著升高(P<0.05),高于单纯细胞因子诱导成熟的DCs表型,由其刺激增殖的LAK细胞对肺癌细胞A549杀伤率为(71±5)%,明显高于对照组(P<0.05).结论:经肿瘤抗原刺激诱导成熟的DC可有效传递抗原,增加T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用.     

树突状细胞诱导的淋巴因子激活的杀伤细胞对肺癌细胞系A549的体外杀伤作用

目的:探讨负载肺癌抗原的树突状细胞(dendritic cells,DC)诱导淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞对肺癌细胞A549的杀伤作用.方法:采用肺癌患者外周血单个核细胞(PBMC)经rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-a诱导和肿瘤冻融抗原刺激诱导获得的DC与LAK细胞按1:20比例共培养2 d,获得Ag-DC-LAK细胞作效应细胞,分别用Ag-Dc-LAK、DC-LAK、Ag-LAK和LAK对肺癌细胞系A549细胞进行杀伤实验.结果:以30μg/mL蛋白的肿瘤抗原负载的DC其表型CD1a、CD80、CD86、HLA-DR均显著升高(P<0.05),高于单纯细胞因子诱导成熟的DCs表型,由其刺激增殖的LAK细胞对肺癌细胞A549杀伤率为(71±5)%,明显高于对照组(P<0.05).结论:经肿瘤抗原刺激诱导成熟的DC可有效传递抗原,增加T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用.     

K562白血病株树突状细胞诱导及其抗肿瘤功能的体外研究

目的将K562细胞诱导分化为树状突细胞(DC),并以K562-DC作为刺激细胞诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应,观察其体外特异性抗肿瘤效应,对白血病细胞来源DC用于白血病免疫治疗进行初步探讨。方法(1)低浓度丙戊酸钠将K562细胞诱导分化为DC(K562-DC)。(2)DC的鉴定:①形态学:倒置显微镜(Olympus)下观察细胞形态并摄相。②免疫表型:PE结合的鼠抗人CD1a、HLADR、CD83、CD80及CD86单抗用流式细胞仪分析检测细胞表面标志。③功能鉴定:采用同种异体混合淋巴细胞反应。(3)MTT杀伤实验检测DC诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞的杀伤活性。结果(1)丙戊酸钠(VPA)培养第7天时,细胞均匀分散,变形,体积增大,数量增多,细胞表面可见多个突起,且具有刺状突起的细胞数量较前增多。(2)通过流式细胞术检测诱导的K562DC表面分子的表达,结果发现丙戊酸钠(VPA)诱导的K562DC各表面标志的表达,与K562细胞相比均明显上调(P<0.05)。(3)丙戊酸钠(VPA)诱导的K562DC具有较强的诱导CTL杀伤肿瘤细胞的能力且随效靶比例增高而增强,并显著高于未负载肿瘤可溶性抗原的DC及单纯T细胞组(P<0.05)。结论以K562细胞为靶细胞,观察VPA对K562细胞诱导向树突状细胞分化作用。进一步的实验证实,VPA可以诱导K562细胞向树突状细胞分化,而且诱导的树突状细胞具有较强的抗原呈递功能和诱导特异性细胞毒性T淋巴细杀伤活性作用。     

痤疮丙酸杆菌促树突状细胞前体细胞动员及其对胃癌的治疗效应

目的利用痤疮丙酸杆菌（P．aches）引起的炎症反应，促进小鼠外周血中树突状细胞（DC）的动员并研究P．aches动员的DC在体外对胃癌细胞的作用。方法C578BL／6J（B6）小鼠注射P．aches后外周血分离单个核细胞，用流式细胞仪分选F4／8013220-CD11c^＋细胞，在体外加入细胞因子GM-CSF、IL4和TNFα共培养，通过形态学观察、表型分析和混合淋巴细胞反应鉴定它们是否能分化为成熟DC。将P．aches动员的DC负载胃癌抗原后致敏T细胞，观察活化的T细胞在体外对胃癌细胞的杀伤效应。结果注射P．aches1h后外周血F4／80B220-CD11c^＋细胞数量即开始升高，24h后逐渐达到高峰。新鲜分离的细胞不具有成熟DC的特征。与细胞因子共培养后即具有典型的DC形态和表型，在混合淋巴细胞反应中具有极强的刺激T细胞增殖的能力。P．aches动员的DC负载胃癌抗原后致敏T细胞对胃癌细胞的杀伤率明显高于未致敏T细胞。结论P．aches可迅速动员F4／80-B220-CD11c^＋细胞进入小鼠外周血，经细胞因子的诱导后可分化为成熟DC，并可在体外诱导出针对胃癌细胞的特异性杀伤T淋巴细胞，对胃癌细胞有明显的杀伤作用，并伴有高水平的INF-γ分泌。     

急性粒细胞白血病可溶性蛋白抗原诱导细胞毒性T淋巴细胞抗白血病作用

目的探索纳米粒包裹白血病可溶性蛋白抗原致敏树突状细胞介导的细胞毒性T淋巴细胞对白血病细胞的抑制作用。方法体外培养树突状细胞。冻融法制备白血病细胞可溶性蛋白抗原．用自制的纳米粒包裹抗原并致敏DC,在体外诱导出特异性CTL．采用MTT法测定CTL活性。结果用人骨髓单个核细胞诱生树突细胞,通过形态、表型及功能进行综合鉴定。利用去溶剂化法制备出白蛋白纳米粒并包裹抗原。体纳米粒包裹抗原组CTL活性强于未包裹组,两者有明显差异（P〈0．05）。结论用白血病细胞可溶性蛋白抗原及纳米粒包裹的抗原均可诱导特异性的抗自血病CTL作用．后者的CTL活性明显高于前者。通过DC介导特异性CTL可有效地抑制白血病细胞,是一种实用而可行的治疗方法。具有良好的临床应用前景。     

hKDR融合基因致敏树突状细胞对小鼠肝癌细胞杀伤活性研究

目的:探讨hKDR融合基因致敏树突状细胞(DC)激发的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对小鼠肝癌细胞的杀伤活性.方法:自小鼠骨髓中获取DC,以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和hKDR融合基因的mRNA致敏DC;用致敏的DC免疫小鼠取其脾脏获得CTL,即效应细胞,用脂质体将pCDNA hKDR转染至小鼠肝癌Hepal-6细胞株中,作为靶细胞;将效应细胞与靶细胞按不同比例混合,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒作用.结果:未经修饰的DC激活的CTL与靶细胞比例为100:1、50:1、25:1情况下,其杀伤率分别为19.2%、12.3%、6.9%;经hKDR修饰的DC激活的CTL与靶细胞比例为100:1、50:1、25:1情况下,其杀伤率分别为71.6%、55.8%、22.7%,将两组结果在相同的比例下两两比较,均有显著性差异(P＜0.05).结论:hKDR融合基因致敏DC激活的CTL对小鼠肝癌细胞具有较强的杀伤作用,且杀伤能力随效应细胞与靶细胞比例增高而增强.     

hKDR融合基因致敏树突状细胞对小鼠肝癌细胞杀伤活性研究

目的:探讨hKDR融合基因致敏树突状细胞(DC)激发的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对小鼠肝癌细胞的杀伤活性.方法:自小鼠骨髓中获取DC,以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和hKDR融合基因的mRNA致敏DC;用致敏的DC免疫小鼠取其脾脏获得CTL,即效应细胞,用脂质体将pCDNA hKDR转染至小鼠肝癌Hepal-6细胞株中,作为靶细胞;将效应细胞与靶细胞按不同比例混合,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒作用.结果:未经修饰的DC激活的CTL与靶细胞比例为100:1、50:1、25:1情况下,其杀伤率分别为19.2%、12.3%、6.9%;经hKDR修饰的DC激活的CTL与靶细胞比例为100:1、50:1、25:1情况下,其杀伤率分别为71.6%、55.8%、22.7%,将两组结果在相同的比例下两两比较,均有显著性差异(P＜0.05).结论:hKDR融合基因致敏DC激活的CTL对小鼠肝癌细胞具有较强的杀伤作用,且杀伤能力随效应细胞与靶细胞比例增高而增强.     

负载肝癌排斥抗原肽的树突状细胞瘤苗活化T细胞的应用

目的　探讨负载肝癌排斥抗原肽SLIVHLNEV(C met突变肽 ) [1 ] 的树突状细胞瘤苗活化的T细胞在体外及裸鼠肝癌模型体内诱导的特异性抗肿瘤免疫。方法　用肝癌排斥抗原肽SLIVHLNEV致敏从脾脏中分离培养的树突状细胞 ,再与同源T淋巴细胞混合培养。乳酸脱氢酶 (LDH)释放法检测细胞毒作用。同时建立荷人肝癌细胞系HHCC的裸鼠移植瘤模型 ,观察DC瘤苗活化的T细胞预防移植瘤发生和抑制移植瘤生长的作用。结果　在体外实验中 ,DC瘤苗诱导的CTLs能够特异性杀伤HHCC肝癌细胞。在裸鼠模型中 ,CTLs不但能预防裸鼠移植瘤的发生 ,而且抑制裸鼠移植瘤生长。结论　负载肝癌排斥抗原肽SLIVHLNEV的树突状细胞瘤苗活化的T细胞在体外和裸鼠模型中均可诱导较强的抗肿瘤免疫