人PIF1全长基因及其截短体真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人PIF1基因5端、3端及全长基因的真核表达载体。方法从pCR2.1-TOPO-PIF1原始质粒中,采用PCR方法扩增目的基因PIF1,PIF1N及PIF1C,将目的基因和目的载体pcDNA3.1(-)分别酶切;纯化酶切产物后定向连接,并将其转化大肠杆菌DH5α,对生长出的克隆行特异限制性内切酶酶切鉴定,鉴定为阳性的克隆送样测序。结果凝胶成像结果显示重组基因pcDNA3.1(-)-PIF1,pcDNA3.1(-)-PIF1N及pcDNA3.1(-)-PIF1C酶切后条带大小分别为1 926,540,1 428bp。结论成功构建hPIF1基因5端、3端及全长基因表达载体,分别为pcDNA3.1(-)-PIF1N,pcDNA3.1(-)-PIF1C及pcDNA3.1(-)-PIF1。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景:阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于(-淀粉样多肽的异常.目的:构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株.方法:采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞(SH-SY5Y)的总cDNA中,扩增出约1.0 kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达.结果与结论:人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株.     

S100A4基因载体的构建及其在人胃癌细胞系中的表达

目的 克隆S100A4 cDNA,构建pcDNA3.1-S100A4重组表达载体,转染胃癌细胞系MKN1,观察S100A4在胃癌细胞中的表达情况。方法 Trizol法提取人胃上皮细胞GES-1的总RNA,逆转录反应获得含S100A4基因的cDNA。聚合酶链反应GenBank获得S100A4基因序列,并设计引物,利用聚合酶链反应(PCR)扩增出分子量为327 bp的产物。构建pMD18-T simple-S100A4重组质粒,转化JM109菌。菌液测序成功后,提取质粒,进行BamHⅠ/HindⅢ双酶切,酶切产物回收纯化,连接表达载体pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-S100A4真核表达载体。利用脂质体介导转染方法将纯化的表达载体转染到胃癌细胞系MKN1中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后MKN1细胞中S100A4 mRNA表达水平。结果 PCR产物连接克隆载体的测序结果与GenBank公布的无突变序列一致,HindⅢ/BamHⅠ双酶切可以成功构建真核表达载体pcDNA3.1-S100A4;在胃癌细胞系MKN1中转染pcDNA3.1-S100A4表达载体,以转染pcD...     

维生素D受体野生型及FokⅠ突变型真核表达载体的构建

目的:克隆人维生素D受体(VDR)全长,构建VDR野生型及FokⅠ突变型重组真核表达质粒.方法:提取总RNA,RT-PCR方法扩增将产物用EcoRⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切后与pcDNA3.1(-) B-myc/his载体连接形成重组载体;对野生型VDR基因行定点诱变,构建突变型FokⅠ VDR质粒.结果:重组质粒被酶切为两条带,一条为1 300 bp(代表人VDR),一条为5 500 bp(空载体);片段大小与理论值相符.测序结果与Genbank序列完全相同.结论:成功克隆了人VDR基因全长并成功构建了人野生型和突变型FokⅠVDR重组真核表达载体pcDNA3.1(-)B-myc/his hVDR,为进一步研究VDR基因变异与相关肿瘤易感性的分子机制奠定了实验基础.     

干细胞因子基因cDNA克隆及其在造血干细胞中的表达

目的:克隆人干细胞因子基因cDNA,构建真核表达载体并转导脐带血造血干细胞,观察干细胞因子在造血干细胞中的表达,从而为脐血造血干细胞扩增及移植奠定实验基础。方法:实验于2005-09/12在承德医学院基础医学研究所和湖南师范大学医学院寄生虫病研究室完成。①实验材料:健康胎儿脐带由承德医学院附属医院提供,产妇均签署知情同意书;pcDNA3.1.大肠杆菌E.coliDH5α由本室保存;pUCm-T vector (promega公司);BamHⅠ,XbaⅠ(New England BioLabs公司):②实验方法:无菌收集胎儿脐带,胶原酶 胰蛋白酶 乙二胺四乙酸联合消化,分离培养人脐带内皮细胞。从上述含脐带内皮细胞的培养液中分离提取干细胞因子mRNA,用反转录-聚合酶链反应扩增干细胞因子cDNA.纯化的PCR产物与载体pUCm-T加入连接反应体系,构建及克隆pUCm-T/SCF质粒,其与pcDNA3.1分别进行BamHⅠ、XbaⅠ双酶切反应,产物经琼脂糖凝胶电泳后回收干细胞因子cDNA和pcDNA3.1片段,构建真核表达型载体pcDNA3.1/SCF。以密度梯度法 免疫磁珠法分离收集人脐血CD34~ 造血干细胞.导入pcDNA3.1/SCF,设立未转导对照组。③实验评估:转导后1～7 d检测两组细胞上清液中干细胞因子水平的表达。结果:①人于细胞因子基因cDNA克隆:扩增的人干细胞因子基因cDNA理论上应为690 bp,实际PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,紫外线下可见-预期大小的条带,证明干细胞因子mRNA提取成功,反转录合成的cDNA完整。②分泌型真核表达质粒pcDNA3.1/SCF的构建:BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后电泳可见690 bp的插入片段,与干细胞因子基因序列相同,表明分泌型真核表达质粒pcDNA3.1/SCF构建成功。③脐血造血干细胞培养上清中的干细胞因子水平:培养第1～7天.转导pcDNA3.1/SCF的脐血造血干细胞上清中的干细胞因子表达水平均明显高于未转导对照组(P<0.01)。结论:成功克隆人干细胞因子基因cDNA,并构建了重组质粒pcDNA3.1/SCF,该质粒转导脐血造血干细胞后.能在短期内有效表达。     

人PIF1全长基因及其截短体真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人PIF1基因5端、3端及全长基因的真核表达载体。方法从pCR2.1-TOPO-PIF1原始质粒中,采用PCR方法扩增目的基因PIF1,PIF1N及PIF1C,将目的基因和目的载体pcDNA3.1（-）分别酶切;纯化酶切产物后定向连接,并将其转化大肠杆菌DH5α,对生长出的克隆行特异限制性内切酶酶切鉴定,鉴定为阳性的克隆送样测序。结果凝胶成像结果显示重组基因pcDNA3.1（-）-PIF1,pcDNA3.1（-）-PIF1N及pcDNA3.1（-）-PIF1C酶切后条带大小分别为1 926,540,1 428bp。结论成功构建hPIF1基因5端、3端及全长基因表达载体,分别为pcDNA3.1（-）-PIF1N,pcDNA3.1（-）-PIF1C及pcDNA3.1（-）-PIF1。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA4真核表达质粒的构建

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA4引物,运用PCR方法扩增其基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(-)而构建重组表达质粒pcDNA3.1-GRA4。结果PCR扩增GRA4基因序列正确,构建的重组表达质粒pcDNA3.1-GRA4经PCR、EcoRⅠ/HindⅢ双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3.1-GRA4,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于β-淀粉样多肽的异常。目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞（SH-SY5Y）的总cDNA中,扩增出约1.0kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

肺表面活性物质相关蛋白C真核表达载体的构建及体外表达

目的 克隆人肺表面活性物质相关蛋白C(SP-C)基因,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/SP-C,并检测其在体外的表达,为SP-C的批量生产提供可靠的方法.方法 提取肺癌手术患者病灶周围正常肺组织总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术获得SP-C cDNA序列.用NotI和XhoI内切酶双酶切SP-C cDNA序列和质粒pcDNA3.1(+),胶回收后体外连接.酶切和测序后,用脂质体包裹转染人乳腺癌细胞株MCF-7,采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测SP-C的表达.结果 能够正确克隆人SP-C基因并插入至质粒pcDNA3.1(+)中;重组质粒体外转染MCF-7细胞后可以表达SP-C蛋白.结论 采用体外重组技术,成功构建了人SP-C真核表达载体 pcDNA3.1(+)/SP-C,并能在体外表达SP-C,为下一步构建人SP-C乳腺特异表达载体,利用乳腺生物反应器大量生产SP-C奠定了基础.     

动脉内皮细胞中TIE2启动CREG真核表达质粒pTIE2-CREG-EGFP-N1的表达

背景:血管内皮发生的分子机制是细胞及基因替代治疗的首要前提.目的:构建一种通过血管内皮细胞特异蛋白TIE2 启动子来启动表达的E1A 激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG) 和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP) 融合的真核表达质粒.方法:根据GenBank 中公布的TIE2 基因的启动子序列,人工合成TIE2 启动子DNA 序列,经AseⅠ和NheⅠ双酶切后,亚克隆入表达质粒pEGFP-N1 中构建pTIE2-EGFP-N1.同时,用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG 基因,亚克隆入质粒pTIE2-EGFP-N1 中构建pTIE2-CREG-EGFP-N1,酶切鉴定.应用脂质体法将该质粒转染至体外培养的小鼠动脉内皮细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达;Western blot 检测CREG 蛋白的表达.结果与结论:经酶切鉴定证实实验构建的pTIE2-CREG-EGFP-N1 质粒正确;体外转染48 h,荧光显微镜下可见EGFP的表达,Western blot 检测到CREG 蛋白的表达.说明实验成功构建了pTIE2-CREG-EGFP-N1 重组质粒,其可携带目的基因在小鼠动脉内皮细胞中有效表达.     

大鼠膜联蛋白A_2真核表达载体的构建及表达

目的:克隆大鼠背根神经节膜联蛋白A2(annexin Ⅱ)的基因,构建真核表达载体并检测其表达。方法:以RT-PCR法扩增大鼠背根神经节(DRG)细胞中膜联蛋白A2(annexin Ⅱ)的基因,构建pGMT-Anxa2克隆载体,以此为模板插入flag标签扩增Anxa2-flag序列,将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+),获得表达载体pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag。以PCR、双酶切及序列测定法鉴定该质粒。以脂质体法将表达载体转染到HEK293细胞中,Western印迹和细胞免疫荧光检测annexin Ⅱ蛋白表达及细胞内定位。结果:PCR扩增Anxa2-flag片段大小与预期相同。通过PCR、HindⅢ和NotⅠ双酶切及测序鉴定,证明构建出了含大鼠annexin Ⅱ基因的真核表达载体。Western印迹和细胞免疫荧光的检测表明大鼠annexin Ⅱ基因稳定表达,并可在胞膜和胞质中广泛表达。结论:成功构建pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag真核表达载体,并稳定表达蛋白,为研究annexin Ⅱ调控DRG伤害性感受传导的分子机制奠定基础。     

构建pcDNA3.1/Hygro(+)-Lefty A真核表达载体及Lefty A的稳定表达细胞系

背景:Leffy基因可能通过拮抗转化生长因子β1,信号通路发挥抗肾纤维化作用.目的:为验证其抗纤维化作用,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-LeffyA真核表达载体,并建立LeftyA稳定表达细胞系.设计、时间及地点:基因克隆构建,单一样本观察,于2008-04/07在武汉大学人民医院中心实验室完成.材料:人肾小管上皮细胞株购于中国协和医科大学细胞库;真核表达载体pcDNA3.1/Hygro(+)由美国纽约州石溪大学SiamakTabibzadeh教授惠赠;Leffy A克隆载体pCMV-SPORT6购自武汉晶赛公司.方法:以pCMV-SPORT6为模板经PCR反应获得Leffy A编码区DNA,将其插入pcDNA3.1/Hygro(+)中构建Leffy A真核表达载体;通过LipofectamineTM2000将此重组质粒转染入人肾小管上皮细胞中,通过Hygromycin筛选挑取阳性表达克隆从而构建Leffy A稳定表达细胞系.主要观察指标:PCR扩增产物电泳鉴定结果.重组质粒的酶切鉴定结果.重组质粒基因测序结果.Leffy A稳定表达细胞系的筛选及其细胞内Leffy A mRNA表达.结果:pCMV-SPORT6经针对人Leffy A基因编码区序列的上下游引物PCR扩增后,10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,在10 kb条带处出现稍大于1.0 kb的特异性扩增条带,与预期1.1 kb目的片段大小相符.重组质粒分别被Hind Ⅲ、BamH Ⅰ单酶切后所得片段大小一致,均为6.7 kb,与重组质粒理论大小一致;经双酶切后得到大小分别为5.6 kb和1.1 kb的2条片段,与pcDNA3.1/Hygro(+)及Leffy A片段大小相符.将酶切鉴定阳性重组质粒测序,对测序结果进行生物信息学分析,发现与人Leffy A基因编码区序列完全一致.稳定转染Leffy A重组质粒的人肾小管上皮细胞高表达Leffy A mRNA.结论:pcDNA3.1/Hygro(+)-Leffy A真核表达载体构建成功,并建立了Lefty A稳定表达细胞系.     

人紧密连接蛋白claudin-6真核表达载体的构建

目的构建人紧密连接蛋白claudin-6的cDNA真核表达载体。方法应用RT-PCR、T-A克隆、限制性内切酶切及亚克隆等技术将claudin-6基因全长克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结果酶切鉴定、PCR扩增以及序列分析表明已经将claudin-6基因全长序列克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结论获得了人claudin-6基因的全长cDNA片段,构建了claudin-6原核克隆载体和真核表达载体。实验中发现,中国人claudin-6基因的461位点碱基为A,而GeneBank中西班牙人claudin-6基因的461位点碱基为G,说明claudin-6基因461位点可能存在多态性。     

胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区与IgG Fc段融合基因疫苗的构建及鉴定

目的:构建及鉴定胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区(mIA-2i)和IgGFc嵌合蛋白的真核表达载体pEGFP-N2/mIA-2i-mIgGFc。方法:实验于2004-09/2005-07在南京医科大学病原生物学系完成。①采用反转录-聚合酶链反应方法从ICR小鼠的脑组织和脾脏中分别扩增胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区(mIA-2i)和IgGFc段(mIgGFc),并引入相应的酶切位点(XhoⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/EcoRI)。②分别将扩增后的片段克隆入pUCm-T质粒,通过XhoⅠ/BamHⅠ双酶切和连接后,获得pUCm-T/mIA-2i-mIgGFc重组质粒。③经过XhoⅠ/EcoRI双酶切后,将融合基因mIA-2i-mIgGFc克隆入真核表达载体pEGFP-N2。通过酶切、聚合酶链反应及插入片段序列测定对重组质粒pEGFP-N2/mIA-2i-mIgGFc进行鉴定。结果:①从ICR鼠的脑组织和脾脏中反转录-聚合酶链反应获得胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区和IgGFc段。②通过基因工程操作,获得重组克隆质粒pUCm-T/mIA-2i和pUCm-T/mIgGFc,并经酶切鉴定克隆成功。③获得重组克隆质粒pUCm-T/mIA-2i-mIgGFc,经聚合酶链反应和双位点酶切鉴定重组成功。④获得重组质粒pEGFP-N2/mIA-2i-mIgGFc和pEGFP-N2/mIA-2i,经聚合酶链反应、酶切及测序鉴定证实特异性片断插入真核表达载体成功。结论:pEGFP-N2/mIA-2i-mIgGFc真核表达载体的构建,为利用胰岛细胞瘤相关蛋白2基因疫苗预防非肥胖性糖尿病小鼠发生自身免疫性糖尿病的研究奠定了基础。     

HSV-TK单基因及其与hIL-12融合基因表达载体的构建

目的构建HSV-TK单基因和TK/hIL12融合基因的真核表达载体。方法 PCR扩增质粒pGT60-hIL12中HSV-TK与hIL12治疗基因片段,同时引入pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点,构建HSV-TK单基因及其与hIL12融合基因的真核表达载体。结果 DNA测序分析、限制性双酶切鉴定证实构建的真核表达载体中治疗基因的序列、大小和方向正确。结论成功构建了pcDNA3.1-TK和pcDNA3.1-TK/hIL12真核表达载体,为进一步探索HSV-TK与hIL12基因的协同抗瘤作用提供实验基础。     

不同亚型神经细胞黏附分子重组质粒的构建及鉴定

目的:构建不同亚型神经细胞黏附分子(NCAM)的重组质粒载体.方法:取成年小鼠大脑皮质提取总RNA,以提取的总RNA为模板,利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到NCAM-120cDNA、NCAM-140cDNA和NCAM-180cDNA后用Xba Ⅰ、HindⅢ酶切,在T4DNA连接酶的作用下,将酶切产物定向插入于质粒pcDNA4相应位点中,经PCR、酶切及测序鉴定其序列正确性.结果:PCR、酶切和测序鉴定证实pcDNA4-NCAM-120、pcDNA4-NCAM-140及pcDNA4-NCAM-180构建成功.结论:成功构建pcDNA4-NCAM-120、pcDNA4-NCAM-140和pcDNA4-NCAM-180的重组质粒,有助于进一步研究不同亚型NCAM的作用及其作用的差异性.     

IL-21重组载体的构建及其诱导T细胞活化增殖的研究

目的构建小鼠IL-21基因真核重组表达载体,为IL-21基因治疗肿瘤奠定基础。方法分离BALB/c小鼠脾细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增IL-21基因片段,构建重组质粒pcDNA3.1(-)-IL-21,分组免疫小鼠,检测其脾细胞膜表面CD分子。结果重组质粒测序结果与GenBank中序列一致,大小为490 bp。核酸疫苗免疫组小鼠脾细胞表面CD分子表达量明显高于PBS和pcDNA3.1(-)空质粒组。结论成功的构建了重组质粒pcDNA3.1(-)-IL-21,该核酸疫苗免疫小鼠后,可有效地诱导其体内T细胞的活化增殖。     

小鼠结缔组织生长因子基因克隆及其真核表达载体构建

背景:研究证实结缔组织生长因子在动脉粥样硬化血管平滑肌中呈高表达,构建结缔组织生长因子真核表达载体以特异性上调结缔组织生长因子在血管平滑肌内的表达是进一步通过细胞及动物实验研究其作用机制的基础.目的:克隆小鼠结缔组织生长因子基因、构建其真核表达载体,并在血管平滑肌细胞中瞬时表达.设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2007-09/2008-04在辽宁医学院省高校分子细胞生物学与新药开发重点实验室完成.材料:1个月龄昆明小鼠10只.真核表达载体{pcDNA3.1(+)由辽宁医学院分子生物学实验室保存.方法:以小鼠肾脏总RNA为模板,通过反转录-聚合酶链反应方法获得结缔组织生长因子(CTGF)目的基因,连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定测序,克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体.主要观察指标:酶切测序鉴定重组体pcDNA3.1(+)-CTGF.将pcDNA3.1(+)-CTGF转入血管平滑肌细胞,Western观察结缔组织生长因子蛋白表达.结果:酶切、测序鉴定证实成功扩增出小鼠结缔组织生长因子目的基因并构建其真核表达载体,Western检测证实,重组体转入血管平滑肌细胞后,细胞内高表达结缔组织生长因子蛋白.结论:成功克隆小鼠结缔组织生长因子目的基因并构建其真核表达载体,重组体能在血管平滑肌中表达.     

Bcl-x微基因及其突变微基因的构建与鉴定

背景:Bcl-xL/Bcl-xS比值的增高与肿瘤的发生密切相关,其机制尚未阐明.Bcl-x微基因是研究其选择性剪接机制的重要工具.目的:构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因,为进行Bcl-x基因选择性剪接方面的研究打下基础.方法:首先采用PCR法从人白血病细胞K562基因组DNA中扩增出Bcl-x基因外显子2及内含子2的5'部分序列片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,然后扩增出Bcl-x基因内含子2的3'端及外显子3部分序列,定向插入上一片段下游,构建成pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因,测序鉴定无误后,用pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因瞬时转染HL-60,通过RT-PCR方法对其在细胞内表达作进一步鉴定.另外,以pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板,利用反向PCR法构建突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M).结果与结论:以人白血病细胞K562基因组DNA为模板,P1和P2为引物,经PCR扩增得约686 bp的目的片段;以P3和P4为引物扩增出约178 bp的目的片段.微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x分别经Xba Ⅰ和Eco R Ⅰ双切、Xba Ⅰ和Xho Ⅰ双切鉴定均得到预期的片段,突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M)经EcoR Ⅰ单酶切后,均得到预期片段,测序结果正确,表明成功构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因.     

pcDNA3.1-flag-pygo2真核表达载体的构建及在C6细胞中的表达

目的构建pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并在C6细胞中进行表达。方法从小鼠脑胶质细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成CDNA，设计引物，调取目的片段，与pcDNA3．1-flag载体连接后转化大肠杆菌DH5α，LB平板筛选菌落，提取质粒。重组质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经过酶切鉴定及测序后，阳离子脂质体法转染C6细胞并经免疫细胞化学染色及蛋白印迹检测重组体的表达。结果重构质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经限制性核酸内切酶EcoRⅠ，HindⅢ酶切分析及测序检查，表明真核表达载体构建正确；瞬时转染C6细胞后，免疫细胞荧光染色及蛋白印迹检测表明转染细胞能够表达外源Pygo2基因。结论成功构建了pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并能够在真核细胞中进行表达，这为今后研究pygo2基因在胶质瘤中的作用机制奠定了基础。