受体血预先经门静脉输入供体延长肝移植大鼠生存时间

目的:探讨受体全血预先经门静脉输入供体对大鼠肝移植排斥反应的作用．方法:采用异系大鼠肝移植模型,供体为ACI大鼠．受体为LEW大鼠．将实验组受体大鼠全血1 mL经门静脉输入供体肝内,7 d后将处理后的供体肝脏移植于受体．经门静脉将生理盐水1 mL输入对照组供体肝内,7 d后将此供体肝脏移植于受体．观察大鼠生存时间,分期分批处死大鼠,从移植肝及受体脾分离T淋巴细胞,测定移植肝及受体脾内中供体来源活化T淋巴细胞的比例,检测细胞因子mRNA的表达．结果:肝移植大鼠生存时间:实验组31．7±7．6 d,对照组11．1±2．1 d．两组差异显著(P< 0．05)．移植后7 d从移植肝分离的浸润T淋巴细胞分析结果:实验组OX76 CD4 细胞25．6%．OX76 CD8 细胞26．6％;对照组OX76 CD4 细胞6．2％,OX76 CD8 细胞7．4％．实验组移植肝内有大量供体来源的活化T淋巴细胞．实验组肝内OX76 CD8 细胞可见IL-10 mRNA及IFN-γmRNA的表达．结论:受体血预先经门静脉输入供体,可以延长异系大鼠肝移植生存时间．有限的移植物抗宿主反应,可能是这种肝移植排斥反应抑制的机制．     

NKT细胞在诱导小鼠皮肤移植免疫耐受中的作用

目的探讨NKT细胞在诱导小鼠皮肤移植免疫耐受中的作用机制。方法 C57BL/6小鼠作为供体,BALB/c小鼠作为受体,建立皮肤移植模型。对照组:单纯行皮肤移植,无其他处理;NKT组:受鼠于术前1 d尾静脉注射供体来源NKT细胞(5×106个/只);CsA组:受鼠于手术当日开始腹腔注射CsA(4mg.kg-1.d-1);NKT+CsA组:受鼠于手术前1 d尾静脉注射供体鼠NKT细胞(5×106个/只),手术当天开始腹腔注射CsA(4mg.kg-1.d-1)。术后每日观察移植皮肤存活情况;术后第10天行混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction,MLR),确定耐受的状态;并通过过继转移实验,进一步探讨NKT细胞在耐受形成中的作用机制。结果术前输注供体NKT细胞,可延长移植皮片存活时间,并且此种耐受可被过继转移。结论 NKT在诱导小鼠皮肤移植免疫耐受过程中起重要作用。     

Fas配体阳性睾丸Sertoli细胞对异种胰岛细胞移植的影响

目的探讨睾丸Sertoli细胞预防异种胰岛移植排斥反应的效果。方法分对照组、1×106细胞组、2×106细胞组、4×106细胞组,每组8只糖尿病大鼠,分离纯化猪胰岛细胞,植入糖尿病大鼠肾被膜下,观察胰岛的有功能存活及排斥反应情况。结果术后胰岛有功能存活时间分别为(6.0±0.6)d、(21.6±5.7)d、(35.7±8.9)d、(48.9±12.7)d,共移植组有功能存活时间较对照组明显延长(P<0.01),移植物存活时间与睾丸Sertoli细胞数量呈剂量依赖,术后第5天移植肾脏免疫组化检查显示4×106睾丸Sertoli细胞移植组有更多的大量结构完整猪胰岛细胞存活,浸润淋巴细胞被诱导凋亡。结论Fas配体阳性表达的SC细胞共移植能明显有效地抑制异种胰岛细胞移植的排斥反应,诱导局部淋巴细胞凋亡。     

改良双袖套法大鼠原位肝移植500例

目的:改进大鼠肝移植的方法,缩短无肝期,提高手术成功率,总结大鼠原位肝移植经验.方法:正式实验分组:(1)预输注供者凋亡的脾细胞正常大鼠肝移植研究组(分4小组);(2)同期输注供者凋亡的脾细胞对正常大鼠肝移植研究组(分4小组);(3)术后输注供者凋亡的脾细胞正常大鼠肝移植研究组(分4小组);(4)预输注供者凋亡的脾细胞对肝硬化大鼠肝移植研究组(分4小组);(5)预输注供者凋亡的血液淋巴细胞对正常大鼠肝移植研究组(分3小组),每小组各10只大鼠.观察手术时间以及大鼠肝移植2 d和1 wk存活率.结果:在正式实验大鼠肝移植中,供体手术时间30±5 min.供肝热缺血时间2±0.5 min,袖套准备及肝脏修整时间10±2 min,受体手术时间51±10 min;无肝期16±4 min.冷缺血时间61±5 min.正式实验大鼠肝移植2 d存活率96.8%(184/190),1 wk存活率95.3%(181/190).结论:改进显露方法及肝上下腔静脉吻合方法后,手术简化,同时并发症减少,生存率提高.     

转化生长因子β1抗大鼠肝脏移植排斥反应的作用及机制的实验研究

目的研究转化生长因子β1抗大鼠肝脏移植排斥反应的作用及机制。方法选取8~10周龄雄性大鼠230只,其中115只为SD大鼠,作为肝脏移植的供体组,115只为Wister大鼠,为肝脏移植的受体组。将进行肝脏移植Wister大鼠随机分为观察组和对照组,观察组每天腹腔注射转化生长因子β1,10 ml/d,对照组腹腔注射生理盐水,10 ml/d。连续10 d。术后3 d、7 d及14 d收集供体大鼠的血液,检测血清中IL-17、IL-12、IL-15、IL-4、IL-10的表达量,记录肝脏移植大鼠的存活天数,并进行统计分析。结果观察组大鼠存活天数为(48.3±6.8)d,对照组为(27.4±2.3)d,两组比较,差异有统计学意义(P0.05);移植手术后3 d、7 d、14 d,观察组中IL-17、IL-12、IL-15的表达量明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05),而IL-4、IL-10的表达量明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论转化生长因子β1具有抗大鼠肝脏移植排斥反应的作用,其作用机制与抑制Th1类细胞因子的表达量及促进Th2类细胞因子的表达量有关。     

肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠的治疗作用及移植细胞生物学特性的研究

探讨同种异体肝细胞经腹腔、脾脏移植对D 氨基半乳糖 (D gal)诱导的急性肝衰竭大鼠的治疗作用及移植细胞的生物学特性 ;研究基因修饰肝细胞经脾脏移植后的定位及表达。方法　采用D gal诱导大鼠肝衰竭。在D gal诱导后 4 8h ,Ⅰ组 :经腹腔移植 4× 10 7同种异体肝细胞 ;Ⅱ组 :经腹腔注射生理盐水 2ml;Ⅲ组 :经脾脏移植 2× 10 7同种异体肝细胞 ,同时肌注CsA 10mg/kg ;Ⅳ组 :经脾脏注射生理盐水 1ml,同时肌注CsA 10mg/kg ,观察大鼠的存活率、肝脏功能、肝脏病理变化和移植细胞的组织学及G6P活性变化 ;Ⅴ组 :经脾脏移植双顺反子逆转录病毒修饰的大鼠原代肝细胞 ,同时肌注CsA 10mg/kg ,经PCR扩增及X gal染色方法追踪细胞的定位及基因表达。 结果　Ⅰ组大鼠存活率显著高于Ⅱ组 ( 71.4 %对 2 6.7% ,P <0 .0 5) ,肝脏功能及肝脏病理有部分改善。腹腔内移植肝细胞可短暂存活并具有G6P活性。Ⅲ组大鼠存活率与Ⅳ组无差别 ( 30 %对 30 % ,P >0 .0 5) ,肝功能、肝脏病理无明显改善。脾内移植肝细胞可短暂存活并具有G6P活性。Ⅴ组经脾移植基因修饰肝细胞后 ,可在脾内检测到 β gal基因表达并扩增出NeoR基因。 结论　经腹腔移植同种异体肝细胞可改善D gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率 ,部分改善肝功能及肝脏病理 ,移植细胞     

共刺激阻断剂与雷帕霉素联合应用对移植胰腺存活的影响

目的探讨共刺激阻断剂PD-L1Ig与雷帕霉素(rapamycin,RPM)联合应用对大鼠移植胰腺存活的影响。方法以F344大鼠为供体,Lewis大鼠为受体,各40只。Lewis大鼠先注射链脲佐菌素制备成糖尿病模型,随后建立原位胰腺移植模型。随机分为移植组、PD-L1Ig治疗组(PD-L1Ig组)、RPM治疗组(RPM组)和PD-L1Ig RPM组(联合组),观察各组术后血糖和移植胰腺病理改变、移植胰腺存活时间。移植后第7天各组处死2只大鼠,取受体与供体脾细胞做混合淋巴细胞反应(MLR)。结果移植后第1天血糖恢复正常,第7天移植组血糖较各治疗组明显升高(P<0.01),各治疗组中以联合组降糖效果最显著。PD-L1Ig组、RPM组的移植胰腺平均存活时间分别为(9.1±1.3)d和(12.5±1.2)d,较移植组的存活时间(5.2±0.7)d明显延长(P<0.01);联合组的存活时间则长达(23.9±1.8)d,与其他各组差异显著(P<0.01)。移植后7d,PD-L1Ig组、RPM组移植胰腺有较多淋巴细胞浸润,联合组移植胰腺淋巴细胞浸润很少。结论PD-L1Ig与RPM联合应用可有效抑制细胞免疫应答,干预排斥反应,显著延长大鼠移植胰腺存活时间。     

TGF-β1基因修饰的肝干细胞诱导大鼠移植肝脏免疫耐受的实验研究

目的探讨TGF-β1基因修饰的肝干细胞对大鼠移植肝脏的免疫耐受的影响。方法采用Kamade的"二袖套法"行SD大鼠对Wistar大鼠的异种原位肝脏移植动物模型,根据处理方式的不同将动物分为对照组(生理盐水和地塞米松)、干细胞组(肝干细胞和地塞米松)和实验组(TGF-β1基因修饰的肝干细胞和地塞米松)。记录各组动物的手术基本情况,观察受鼠的存活时间,相比术后24 h后移植肝组织的肝功能指标冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、丙氨酸转氨酶(ALT)和白蛋白(ALB),比较各组动物肝脏的病理。结果与对照组和干细胞组相比,实验组动物存活时间明显延长,肝功能好转。实验组AST、TBIL、ALT和ALB与其他两组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。在肝脏病理中,实验组的免疫排斥反应明显降低。结论 TGF-β1基因修饰的肝干细胞对移植肝脏具有保护作用,在急性免疫排斥方面具有明显的抑制作用。     

共刺激阻断剂与雷帕霉素联合应用对移植胰腺存活的影响

目的 探讨共刺激阻断剂PD-L1Ig与雷帕霉素(rapamycin, RPM) 联合应用对大鼠移植胰腺存活的影响.方法 以F344大鼠为供体,Lewis大鼠为受体,各40只.Lewis大鼠先注射链脲佐菌素制备成糖尿病模型,随后建立原位胰腺移植模型.随机分为移植组、PD-L1Ig治疗组(PD-L1Ig组)、RPM治疗组(RPM组)和PD-L1Ig + RPM 组(联合组),观察各组术后血糖和移植胰腺病理改变、移植胰腺存活时间.移植后第7天各组处死2只大鼠,取受体与供体脾细胞做混合淋巴细胞反应(MLR).结果 移植后第1天血糖恢复正常,第7天移植组血糖较各治疗组明显升高(P＜0.01),各治疗组中以联合组降糖效果最显著.PD-L1Ig组、RPM组的移植胰腺平均存活时间分别为(9.1±1.3)d和(12.5±1.2)d,较移植组的存活时间(5.2±0.7)d明显延长(P＜0.01);联合组的存活时间则长达(23.9±1.8)d,与其他各组差异显著(P＜0.01).移植后7 d, PD-L1Ig 组、RPM组移植胰腺有较多淋巴细胞浸润, 联合组移植胰腺淋巴细胞浸润很少.结论 PD-L1Ig与RPM联合应用可有效抑制细胞免疫应答, 干预排斥反应,显著延长大鼠移植胰腺存活时间.     

供体凋亡细胞输注对胰岛移植糖尿病大鼠CD4^＋CD25^＋T细胞的影响

目的探讨供体凋亡细胞输注对诱导胰岛移植免疫耐受大鼠CD4^＋CD25^＋T细胞的影响。方法糖尿病SD大鼠23只,随机分为4组,分别输注Hanks液（Hanks组）、供体正常脾细胞（正常细胞组）、供体坏死脾细胞（坏死细胞组）及供体凋亡脾细胞（凋亡细胞组）。输注后第7天行同种异体胰岛移植,测血糖,观测胰岛移植物存活时间,流式细胞仪检测受体大鼠CD4^＋CD25^＋T细胞的比例变化。结果预输注供体凋亡脾细胞能显著延长同种异体胰岛移植物存活时间（中位生存时间达31天）,预输注凋亡细胞组CD4^＋CD25^＋T细胞比例明显高于其他各组（P均〈0．05）。结论供体凋亡细胞输注能够诱导同种异体大鼠胰岛移植免疫耐受,CD4^＋CD25^＋T淋巴细胞可能在其中发挥重要作用。     

阻断可诱导共刺激分子刺激通路抑制大鼠异体肢体移植急性排斥反应的实验观察

目的 通过RNA干扰并阻断可诱导共刺激分子(ICOS)刺激通路,观察对大鼠异体肢体移植急性排斥反应的抑制作用.方法 成年Wistar、SD大鼠各27只,按体质量将大鼠随机分为排斥组、对照组、干扰组.每组9例.大鼠肢体移植采用改良法.将Wistar大鼠(供体)右下肢体移植到SD大鼠(受体)左下肢体上.移植术后排斥组不给予特殊处置;对照组阴茎背静脉注射梭华-Sofast-pSileneer 4.1空载体复合物;干扰组注射梭华-Sofagt-pSileneer 4.1-ICOSshRNA干扰质粒复合物.术后8 d每组处死SD大鼠3只,取移植肢体皮肤、肌肉及骨骼进行病理学检查;流式细胞仪及RT-PCR检测淋巴细胞表面ICOS和基因mRNA表达:分别用Wistar、Lewis大鼠脾细胞刺激,进行单向混合淋巴细胞培养,计算细胞刺激指数;ELISA双抗体夹心法检测大鼠血清细胞因子γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4);另6只大鼠观察生存情况及肢体存活时间.结果 排斥组大鼠肢体平均存活时间(11.34±1.21)d,对照组平均存活时间(11.14±1.32)d,干扰组平均存活时间(16.85±1.73)d,组间比较差异有统计学意义(F=8.72,P<0.05).排斥组和对照组病理学结果提示,肢体出现了中、重度急性排斥反应,干扰组急性排斥反应轻微.光镜下排斥组和对照组皮肤出现表皮坏死、大泡形成伴有血管周围炎及大量淋巴细胞浸润,肌肉组织有弥散性淋巴细胞浸润,间质水肿同时伴有肌细胞坏死.脾淋巴细胞ICOS基因mRNA表达显示,干扰组(18.75%)明显低于排斥组(100%)和对照组(98.51%),组间比较差异有统计学意义(X2=13.57,P<0.01).淋巴细胞表面ICOS表达荧光强度,干扰组为45.59±12.87,排斥组为103.72±21.76,对照组为93.47±29.55,组间比较差异有统计学意义(F=6.89,P<0.05).单向混合淋巴细胞反应刺激指数(SI),排斥组(5.26±0.42、5.18±0.29)和对照组(5.37±0.27、4.93±0.44)明显高于干扰组(2.37±0.35、4.87±0.36),组间比较差异有(无)统计学意义(F=7.29,P<0.05;F=6.19,P0.05).IFN-γ和IL-4表达.干扰组(230.17±38.47、160.32±59.13)较排斥组(490.73±51.48、230.67±45.21)和对照组(480.15±43.96、240.53±47.36)均降低,组间比较差异有统计学意义(F值分别是7.23、6.75,P<0.05).结论 体内转染pSilencer4.1-ICOSshRNA干扰质粒能有效阻断T细胞共刺激通路,抑制急性排斥反应,延长移植肢体存活时间.     

转化生长因子β_1基因沉默脂肪干细胞移植对盐敏感性高血压大鼠心肌纤维化和心肌细胞的影响研究

目的探讨转化生长因子β_1(TGF-β_1)基因沉默脂肪干细胞(ADSCs)移植对盐敏感性高血压大鼠心肌纤维化和心肌细胞凋亡的影响。方法本实验于2015年6月—2016年7月在陕西省医学实验动物中心实验室完成。体外培养ADSCs,构建TGF-β_1为靶向基因的mRNA和siRNA表达质粒,病毒转染至ADSCs,取第三代ADSCs进行慢病毒转染,转染时分为空白组、对照组、TGF-β_1-siRNA转染组。采用Western blot法检测基因转染后第3天和第14天不同基因转染组ADSCs TGF-β_1蛋白表达情况。选取80只SPF级雄性Dahl盐敏感大鼠构建盐敏感性高血压大鼠模型,采用随机数字表法分为正盐组、高盐组、ADSCs组及TGF-β_1基因沉默组,每组20只。正盐组给予0.3%氯化钠饮食;高盐组给予8%氯化钠饮食;ADSCs组予8%氯化钠饮食6周后尾静脉移植ADSCs,持续3 d;TGF-β_1基因沉默组大鼠给予8%氯化钠饮食6周后尾静脉移植TGF-β_1基因沉默ADSCs,持续3 d。细胞移植2周后,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测4组大鼠心肌组织TGF-β_1mRNA表达情况,采用Western blot法检测4组大鼠心肌组织TGF-β_1蛋白表达情况,采用超声心动图检测4组大鼠左心室射血分数(LVEF)和缩短分数(FS),并计算左心室质量指数(LVMI),VG染色测算胶原容积积分,HE染色观察心肌细胞形态,荧光显微镜下观察心肌组织中CM-Dil标记的ADSCs分布情况,采用TUNEL法检测4组大鼠心肌细胞凋亡情况。结果 (1)荧光显微镜下显示,CM-Dil标记的ADSCs呈橘红色,标记率为97%。(2)基因转染后第3天和第14天空白组和对照组ADSCs TGF-β_1蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05),而TGF-β_1-siRNA转染组ADSCs TGF-β_1蛋白相对表达量低于空白组和对照组(P<0.05)。(3)细胞移植2周后,TGF-β_1基因沉默组大鼠心肌组织TGF-β_1mRNA、蛋白相对表达量低于正盐组、高盐组及ADSCs组,ADSCs组大鼠心肌组织TGF-β_1mRNA、蛋白相对表达量低于正盐组、高盐组,高盐组大鼠心肌组织TGF-β_1mRNA、蛋白相对表达量高于正盐组(P<0.05)。(4)细胞移植2周后,高盐组和ADSCs组大鼠LVEF和FS低于正盐组和TGF-β_1基因沉默组,LVMI高于正盐组和TGF-β_1基因沉默组(P<0.05);ADSCs组和TGF-β_1基因沉默组大鼠LVEF和FS高于高盐组,LVMI低于高盐组(P<0.05);正盐组与TGF-β_1基因沉默组大鼠LVEF、FS及LVMI比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(5)细胞移植2周后,高盐组、ADSCs组和TGF-β_1基因沉默组大鼠胶原容积积分高于正盐组,ADSCs组和TGF-β_1基因沉默组大鼠胶原容积积分低于高盐组,TGF-β_1基因沉默组大鼠胶原容积积分低于ADSCs组(P<0.05)。(6)HE染色结果显示,细胞移植2周后高盐组大鼠心肌出现明显纤维化且巨噬细胞浸润明显增多,ADSCs组大鼠心肌纤维化较轻,TGF-β_1沉默组大鼠心脏纤维化最轻、巨噬细胞浸润最少。(7)荧光显微镜下显示,细胞移植2周后正盐组和高盐组大鼠心肌组织中未发现CM-Dil标记的ADSCs,TGF-β_1基因沉默组大鼠心肌组织中CM-Dil标记的ADSCs多于ADSCs组(P<0.05)。(8)细胞移植2周后,正盐组大鼠心肌细胞凋亡率为0,ADSCs组和TGF-β_1基因沉默组大鼠心肌细胞凋亡率低于高盐组,TGF-β_1基因沉默组大鼠心肌细胞凋亡率低于ADSCs组(P<0.05)。结论TGF-β_1基因沉默ADSCs移植能有效减轻盐敏感性高血压大鼠心肌纤维化,减少心肌细胞凋亡。     

五指山小型猪胰岛对糖尿病大鼠的治疗作用

目的:探讨小型猪胰岛治疗糖尿病大鼠的作用和功效.方法:成年健康♂五指山小型猪和普通家猪作为胰岛供体.胰腺获取后经胶原酶消化后进行胰岛提取纯化,纯化后的胰岛通过门静脉移植到糖尿病SPF大鼠的肝内,术后每天肌注环孢菌素(20mg/kg)作为免疫抑制剂,并通过检测糖尿病大鼠的血糖变化和肝脏组织学检查来判定胰岛移植后的存活情况和纠正胰岛移植的效果.结果:五指山小型猪胰腺消化后胰岛产量为4608 IEQ/g±593 IEQ/g,纯化后为3820 IEQ/g±718 IEQ/g,纯度为85%,取自屠宰场猪胰岛产量为纯化前为3500 IEQ/g±625 IEQ/g,纯化后为2720 IEQ/g±435 IEQ/g,纯度为80%.两组84.6%糖尿病大鼠在移植术后第1天,血糖降至正常.维持时间:小型猪胰岛术后存活时间为3-5d(中位存活时间:4.5d),普通家猪胰岛存活时间为2-4d(中位存活时间:3.7d).经Kaplan-Meier分析,两组胰岛存活时间无差别.结论:封闭群五指山小型猪分离纯化后的胰岛产量高,功能良好,可以纠正糖尿病大鼠的高血糖,适合作为异种胰岛移植的理想供体.     

联合应用供体未成熟树突状细胞与CD40L mAb诱导大鼠小肠移植免疫耐受

目的:研究供体骨髓来源的未成熟树突状细胞(imDC)联合CD40L mAbi诱导大鼠小肠移植免疫耐受.方法:体外培养供体大鼠树突状细胞(DC),实验动物分为3组,受体于手术前分别预处理后进行小肠移植.A组(n=15):注射生理盐水;B组(n=15):注射供体来源的imDC;C组(n=151:同时注射供体来源的imDC CD40L mAb.观察受体存活时间(n=6),移植小肠病理学检查,用ELISA法检测受体血清IL-2、INF-γ和IL-10水平(n=5).结果:C组受体动物存活时间明显长于A、B两组,统计学有显著差异(22.67±7.09 d vs7.17±1.47 d,11.00±2.61 d,P＜0.01),C组移植小肠炎性细胞浸润、黏膜结构破坏程度、血清IL-2、INF-γ水平均明显低于A、B组,有统计学差异(IL-2:225.4±48.7 ng/Lvs 374.1±13.2 ng/L,353.6±10.4 ng/L;INF-γ:56.9±2.6 ng/Lvs 229.2±20.6,125.4±18.5 ng/L,P＜0.05),血清IL-10水平C组明显高于A、B组,有统计学意义(186.4±10.6 ng/Lvs 91.7±5.4,162.2±8.1 ng/L,P＜0.05).结论:联合应用CD40L mAb和imDC可抑制小肠移植后的排斥反应,诱导受体产生免疫耐受.     

供体凋亡细胞预输注抑制肝移植急性排斥反应的实验研究

目的探讨供体凋亡细胞预输注抑制肝移植急性排斥反应的效果及机制。方法无菌取SD大鼠脾脏,分别采用光照法和水浴法制备凋亡细胞和坏死细胞,并经流式细胞仪检测证实。将sD（供体）、Wistar（受体）大鼠各40只随机分为A组12例、B组14例、C组14例,分别经阴茎背静脉注射生理盐水1ml、坏死细胞1×10^7个、凋亡细胞1×10^7个,至第7天参照Kamada法行原位肝移植术。观察三组围术期一般情况;术后第4天各组均取外周血检测肝功能指标ALT、AST、TBIL及血清IL-2、IL-10水平;术后第4天各组分别处死3只大鼠,取肝组织行病理学检查,判断急性排斥分级,取石蜡切片检测凋亡指数;分别取SD及F344大鼠脾淋巴细胞与Wistar大鼠脾淋巴细胞混合培养,测定淋巴细胞转化率。结果C组存活期明显长于A、B组,术后肝功能、病理改变及肝细胞凋亡指数均优于A、B组,淋巴细胞转化率显著低于A、B组。结论术前预输注供体特异性凋亡细胞可通过诱导供体特异性免疫耐受抑制大鼠肝移植术后急性排斥反应,改善移植肝功能,延长存活时间。     

大鼠肝肠联合移植后肝对小肠的免疫保护作用

目的：建立大鼠肝肠联合整体移植模型,研究移植肝是否对移植小肠具有免疫保护作用．方法：选用封闭群SD大鼠和近交系Wistar大鼠．实验分5组：同基因小肠移植组、同基因肝移植组、异基因小肠移植组、异基因肝移植组、肝肠联合移植组．同基因移植供受体均为Wistar大鼠,异基因小肠移植、肝移植和肝肠联合移植供受体分别选用SD和Wistar大鼠．肝肠联合移植在切取移植物后,利用供体胸段下腔静脉在门静脉侧壁建立一袖套,并安置套管．受体手术时,将此门静脉侧壁袖套与受体门静脉残端套管法吻合．供体肠系膜上动脉与受体右肾动脉吻合．免疫保护作用通过术后5,7,14 d从各组随机取出4只大鼠的移植物普通病理检查及细胞凋亡检测评估．结果：肝肠联合移植模型建立手术成功率73．3%(22/30)．同基因移植组术后仅表现为缺血-再灌注损伤所致的轻度组织损伤及炎症反应,移植物细胞凋亡数逐渐减少．异基因移植术后均出现急性排斥、移植物细胞凋亡数递增,并且较同基因移植多,差别有显著性．小肠移植术后5,7,14 d分别表现为轻度、中度和重度排斥．而肝肠联合移植的小肠移植物术后5,7,14 d分别表现为轻度、轻度和中度排斥,且14 d时小肠细胞凋亡数较异基因小肠移植组少,差别具有显著性(16．9±4．3 vs 20．5±6．3,P＜0．05)．术后各时间点异基因肝移植和肝肠联合移植的移植肝排斥反应严重程度相同,细胞凋亡数比较无显著差异．结论：此法建立大鼠肝肠联合移植模型可行．肝肠联合移植时肝对小肠具有免役保护作用．     

同种异体大鼠骨髓移植诱导肝移植免疫耐受

目的:建立同种异体大鼠骨髓及肝联合移植动物模型,探讨骨髓移植诱导肝移植术后免疫耐受的可行性及其可能机制.方法:将SD大鼠(♂)、Wistar大鼠(♀)分成三组:Ⅰ、Ⅱ组和Ⅲ组,Ⅱ组Wistar大鼠(♀)TBI(11 Gy),4惦输入SD大鼠(♂)BMC(8×107),Ⅲ组wistar大鼠(♀)TBI(7 Gy),4 h后输入SD大鼠(♂)BMc(8×107),2 d后CTX(50 mg/kg)腹腔注射,三组均于28 d后Kamada"二袖套法"行SD→Wistar大鼠肝移植.分别于BMT后10、20 d通过PCR方法检测Ⅱ组和Ⅲ组Wistar大鼠体内的SD大鼠源性Y染色体特异性片段.并比较三组大鼠肝移植术后1 wk生存率、生存状况、生存时间,以及移植肝脏的病理变化.结果:Ⅱ组和Ⅲ组大鼠外周血均检测出SD大鼠源性嵌合体.DTH检查结果显示Ⅱ组和Ⅲ组大鼠对SD大鼠产生免疫耐受,Ⅱ组和Ⅲ组DTH足掌厚度差值较Ⅰ组小(0.22±0.028mm,0.23±0.032 mm vs 0.71±0.026 mm,均P<0.01).肝移植结果显示:Ⅱ组和Ⅲ组Wistar大鼠对SD大鼠肝移植的存活时间较Ⅰ组大鼠肝移植物存活时间明显延长(8.14±2.53 d,8.33±2.11 d vs 3.79±0.83 d.均P<0.01).依据Banff方案病理评分,Ⅱ组和Ⅲ组为轻度(Ⅰ级),Ⅰ组为重度(Ⅲ级).结论:应用7 Gy TBI+CTXI+供体BMT可成功建立同种异体大鼠嵌合体模型,诱导特异性免疫耐受,可提高肝移植术后大鼠的生存状况及生存时间.     

脾内移植基因修饰鼠胎肝细胞的生物学特征

目的探讨基因修饰(genemodification,GM)胎肝细胞(fetallivercells,FLC)脾内移植途径介导细胞因子基因治疗的可行性和有效性,为肿瘤放疗病人免疫和造血功能的恢复提供一种治疗手段和途径.方法将经LacZ或粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因体外修饰的小鼠FLC脾内注射后,观察其生物学行为.结果①病毒/细胞感染比率(MOI)为50,转染时间为2h时,能获得80%～85%的转染效率;②通过FACS分析,基因转移体系对FLC群体的细胞周期、凋亡细胞比例以及CD34+细胞含量无明显影响;③照射小鼠尾静脉注射FLC-GM后,其8d脾克隆形成单位(CFU-S8)数目明显升高,提示GM-CSF基因转染有助于促进FLC中较晚期定向干细胞的增殖、分化以及体内植入;④[1]1In标记的FLC脾内移植后2h即有20%～25%细胞转位于肝脏,48h肝内移入量最高,达50%～55%,并持续至检测第5天,只有22%左右的肝细胞滞留于脾脏;⑤血清分泌水平在脾内移植后48h最高,达(356±58)pg/ml,此时行脾切除,GM-CSF仍具有一定量的表达水平;⑥同种异体FLC-GM脾内移植引起的宿主迟发型变态反应(DTH)强度明显弱于同种异体脾细胞皮下致敏组(对照组).结论基因修饰的FLC能够保持其原有的生物学性质,脾内注射后能转位于肝脏,同化人宿主肝内长期存活,并发挥正常功能.     

大鼠Smad7真核表达质粒的构建及在肝星状细胞中的表达

目的:构建并鉴定大鼠Smad7真核表达质粒,观察外源Smad7对肝星状细胞HSC-T6的转染.并进一步研究其对TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA达水平的影响.方法:采用基因重组技术将Smad7 cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1( ),构建大鼠Smad7真核表达质粒.脂质体介导转染HSC-T6细胞,分为正常对照组、空质粒组及转染组,G418筛选,挑取阳性细胞,运用Western blot检测Smad7蛋白表达情况,RT-PCR检测Smad7、TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平.结果:酶切和测序结果证实Smad7真核表达质粒构建成功.Smad7转染组与正常对照、空质粒组比较,Smad7 mRNA表达显著增加(1.053±0.009 VS 0.984±0.054,0.986±0.044,P<0.01或0.05),蛋白水平显著上调(0.083±0.02 VS0.058±0.050,0.056±0.064,均p<0.05:Smad7转染组TGF-β1、Ⅰ型胶原mRNA表达降低(0.961±0.013 VS 1.039±0.013,1.032±0.037;0.592±0.096 VS 0.767±0.085.0.770±0.090,均P<0.01);Ⅲ型胶原mRNA表达差异无统计学意义.正常对照、空质粒组Smad7 mRNA和蛋白水平、TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNAA达差异无统计学意义.结论:smad7可能参与TGF-β/smad信号转导,在一定程度上具有抗纤维化的生物学活性.     

巨细胞病毒感染对大鼠肝移植慢性排斥反应的致病机制探讨

目的探讨巨细胞病毒（CMV）感染对大鼠肝移植慢性排斥反应的致病机制。方法将84只肝移植术受体大鼠随机分为实验组和对照组各42只，实验组移植后当天腹腔注射人巨细胞病毒（HCMV）0．4ml，对照组腹腔注射生理盐水0．4ml；两组均于移植后0、1、2d肌肉注射氨苄青霉素200mg／（kg·d）。比较两组移植肝病理学变化及排斥反应活动指数（RAI）；检测移植肝组织及外周血中纤维增生因子转化生长因子β1（TGF-β1）、血小板衍生生长因子（PDGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达。结果实验组动脉阻塞性病变及肝脏纤维化程度显著高于对照组，RAI明显低于对照组；肝组织PDFGmRNA、bFGFmRNA表达明显高于对照组，P均〈0．05；两组肝组织TGF-β1，mRNA及外周血TGF-β1、bFGF比较无统计学差异；但实验组外周血PDGF水平显著高于对照组。结论CMV感染能加重慢性排斥反应程度并加快其进程，其机制可能为HCMV感染后PDGF和bFGF早期表达增加。