产毒性大肠杆菌不耐热和耐热肠毒素基因克隆及序列分析

目的：用基因工程方法克隆产毒性大肠杆菌（ETEC）不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）基因,以制备检测ETEC的单克隆抗体.方法：利用PCR技术扩增LT和ST基因并将它们插入T-easy载体中,采用全自动测序仪进行核苷酸序列分析.结果：DNA序列分析表明,克隆的ETEC-LT-B DNA序列与GenBank公布序列比较在17、69、101、102位点有碱基变异,同源性98.9%;ETEC-STDNA序列与GenBank公布序列一致.结论：成功获得正确的ETEC的LT和ST基因,为其重组表达及后续研究奠定了实验基础.     

葡萄球菌对甲氧西林耐药性表达及其影响因素

耐甲氧西林葡萄球菌的临床分离株具有一个对所有β-内酰胺类抗生素显示耐药性的耐药基因(mecA).在金葡菌中,这种mecA基因位于—不明来源和性质的、大小为30～40kb的DNA片断中,后者在金葡菌染色体中位于SmaIG中(介于spa和purA之间).含有mecA基因的DNA具有至少一种类插入序列(IS-like)——IS 431/IS 257,后者作为其它非相关药物耐药决定簇,导致细菌的多重耐药性.而且与细胞粘附性及其调节作用有关的基因也可能位于mecA基因内.1 mecA基因表达及其调节mecA基因已被克隆和定序,且对青霉素结合蛋白(PBP)编码的研究已涉及PBP2a(即PBP2’).这种低青霉素亲和力的膜结合蛋白插入正常的PBPs中,并被认为在β-内酰胺类抗生素存在时可替代PBPs的作用,以避免这些药物的杀菌作用.     

产毒性大肠杆菌不耐热和耐热肠毒素基因克隆及序列分析

目的:用基因工程方法克隆产毒性大肠杆菌(ETEC)不耐热肠毒素(LT)和耐热肠毒素(ST)基因,以制备检测ETEC的单克隆抗体.方法:利用PCR技术扩增LT和ST基因并将它们插入T-easy载体中,采用全自动测序仪进行核苷酸序列分析.结果:DNA序列分析表明,克隆的ETEC-LT-B DNA序列与GenBank公布序列比较在17、69、101、102位点有碱基变异,同源性98.9%;ETEC-STDNA序列与GenBank公布序列一致.结论:成功获得正确的ETEC的LT和ST基因,为其重组表达及后续研究奠定了实验基础.     

细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因研究

目的检测与分析细胞壁缺陷结核分枝杆菌的耐药性相关基因，探讨细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因基础。方法分别分离16株自发形成和用利福平、异烟肼、乙胺丁醇诱导形成的结核分枝杆菌的染色体DNA，PCR扩增IS986序列以及rpoB、katG和embB基因后进行凝胶电泳和序列分析。结果自发形成及抗结核药物诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型可在含利福平（4μg／ml）、异烟肼（0．2μg／ml）、乙胺丁醇（7．5μg／ml）的培养基内生长与传代培养。基因检测与分析显示，结核分枝杆菌稳定L型仍然保留IS986基因，rpoB、katG、embB基因也未见突变。结论结核分枝杆菌稳定L型可自发形成，也可被利福平、异烟肼和乙胺丁醇诱导形成。结核分枝杆菌稳定L型对利福平、异烟肼、乙胺丁醇形成耐药性，但其染色体上耐药相关基因并没有发生突变。除染色体耐药相关基因突变可造成结核分枝杆菌形成耐药性外，细胞壁缺陷也是造成结核分枝杆菌形成耐药性的一个重要机制。     

5SrRNA基因间隔区DNA序列在穿心莲道地性中的可行性研究

目的探讨5SrRNA基因间隔区DNA序列在穿心莲道地性研究中的可行性。方法提取不同产地穿心莲总DNA后,PCR特异扩增5SrRNA基因间隔区,采用荧光标记末端终止子双脱氧末端终止法测序,对测序结果进行多序列联配分析。结果成功得到321bp的5SrRNA基因间隔区碱基序列,经过多序列联配分析发现,不同产地穿心莲的此段5SrRNA基因间隔区DNA序列之间没有差异。结论5SrRNA基因间隔区DNA序列不适合用于研究穿心莲药材的道地性。     

大鼠脑源性神经营养因子基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的表达序列,构建大鼠BDNF基因真核表达载体.方法 以RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增BDNF cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-BN,以限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为783bp特异片段,重组质粒酶切后产生783bp和5.2 kb的片段,DNA测序证实783bp片段的碱基序列与大鼠BDNF基因序列完全一致.结论 成功克隆大鼠BDNF基因表达序列并构建了BDNF基因真核表达栽体pcDNA3-BN.     

人CCL21基因克隆及其序列分析

目的克隆人次级淋巴组织趋化因子CCL21基因。方法设计合成克隆人CCL21基因的引物,从人淋巴结组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到人CCL21基因,克隆到pEASY-T1 simple载体中,PCR、酶切鉴定及DNA序列分析。结果成功克隆出人CCL21基因。结论序列分析显示克隆出的目的基因与GenBank中序列完全一致。     

葡萄糖脑苷脂酶基因多态性与帕金森病的相关性

目的 研究贵州人群帕金森病(PD)患者的葡萄糖脑苷脂酶(GBA)基因N370S、V394L和IA44P突变位点多态性,探讨GBA基因突变与PD的相关性.方法 选取50例PD患者和50例正常对照组的基因组DNA,通过PCR扩增GBA基因的外显子8-11 DNA片段,再以纯化的PCR产物作模板,通过PCR分别扩增GBA基因外显子9和外显子10 DNA片段,纯化后测序.结果 PD患者和正常对照组的GBA基因外显子9和外显子10核苷酸序列完全一致,未发现突变点.结论 在中国贵州人群中,GBA基因N370S、V394L和LA44P突变位点无多态性,提示GBA基因N370S、V394L和L444P突变与中国贵州人群的PD不具有相关性.     

WWOX基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的 构建人WWOX基因真核细胞表达载体.方法 采用RT-PCR方法 ,从人新鲜卵巢组织的总RNA中扩增出1245 bp的人WWOX cDNA片段, 然后用Hind III和Eco RI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA 3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 WWOX基因的序列测定结果 与文献报道完全一致,其真核细胞表达载体被成功构建.结论 成功克隆出WWOX基因,并成功构建其真核细胞表达载体.     

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及稳定感染HepG2单克隆细胞株的建立

目的 构建PRL -3基因RNA干扰慢病毒载体并建立被稳定感染的HepG2单克隆细胞株.方法 设计PRL -3基因特异性RNAi靶序列,合成靶序列的DNA oligo,退火形成双链DNA,与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的pGCL- GFP线性化载体连接,产生重组慢病毒质粒LV - PRL3 - siRNA,转化感受...     

PML-RARα245与hGM-CSF双基因DNA疫苗的构建与表达

目的 采用长度为245 bp的急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因片段构建新的PML-RARα与hGM-CSF真核双表达载体.方法 用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增长度为245 bp的PML-RARα基因片段,PCR技术从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因,分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点A和B中,构建真核双表达载体.用酶切和序列分析方法验证所构建载体的正确性.将重组质粒转染K562细胞,利用RT-PCR和点杂交技术检测重组质粒在真核细胞中的转录和翻译情况.结果 双酶切结果证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hGM-CSF基因,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列完全正确.该重组质粒能够在真核细胞中正常转录和翻译.结论 成功构建了含有PML-RARα245及hGM-CSF的双表达载体,为筛选合适的抗原片段用于构建治疗急性早幼粒细胞白血病的PML-RARαDNA疫苗提供重要资料.     

应用Tail-PCR分析sul1和tetW侧翼功能序列

目的基于对抗生素抗性基因(sul1和tetW)侧翼序列分析,为研究其水平或垂直传递相关保守元件和机制提供方法学基础和理论依据。方法运用普通PCR对天津海河流域底泥中抗性基因进行定性分析,以多个样品的总DNA提取物为模板,运用Tail-PCR扩增分析sul1、tetW的侧翼序列。结果磺胺类和四环素类抗性基因sul1和tetW普遍存在,并获得了sul1的左侧序列1 100 bp,tetW右侧序列两条为608 bp、862 bp。结论通过序列分析发现了多种保守结构域相关序列,以及全新的序列特征,结果表明磺胺抗性基因与氨基糖苷类药物抗性基因存在连锁现象,四环素抗性基因与TnB1230存在连锁,并成功摸索了从混合模板中Tail-PCR获取特定位点多个侧翼序列的方法。     

用聚合酶链式反应技术检测人类性别决定区域Y基因

Saiki等在1985年首次应用聚合酶链式反应(PCR)技术合成人类β球蛋白基因,其后这项快速高效的体外DNA特异扩增技术在临床医学研究和诊断中获得广泛应用。本文应用PCR技术检测正常男性、女性基因组中的X重复序列,Y重复序列     

寡聚酰胺化学与生物学研究进展

含有吡咯和咪唑的寡聚酰胺是一类人工合成的小分子化合物，其分子形状与DNA小沟的曲率相吻合，能高亲合力和特异性地与DNA 小沟中特定序列进行识别并结合，从而起到调控基因表达的作用。寡聚酰胺易透过细胞膜、无细胞毒性、结构稳定和不易降解，是一类很有前途的基因调控工具。本文从寡聚酰胺配对规则、对DNA序列的选择性与结合力、合成方法、透膜吸收、基因调控和动物体内实验等方面的研究进展进行综述，并讨论其在研究中面临的问题，为寡聚酰胺的研究提供参考。     

LZ-8基因在大肠杆菌中的表达

根据Murasugi等人发表的ZL－8基因的DNA序列，设计了两条引物，从灵芝孢子粉的基因组DNA中扩增到LZ－8基因（356bp）。利用此基因及pET-3d质粒，构建了该基因的原核表达 载体质粒，进一步将其转化进大肠杆菌HB1010菌株中获得了表达该基因的基因工程菌株，并对IPTG诱导后的LZ－8蛋白进行了初步的SDS－PAGE分析。     

DNA家族改组技术的进展及应用

DNA家族改组(DNA family shuffling)是一项高效的体外进化技术,该技术利用自然界中具有同源序列的基因家族--如来自不同种属的相同基因以及同一种属的相关基因等进行改组,为蛋白质定向进化和结构--功能关系分析等研究提供了有效获得突变文库的方法.近年来,DNA家族改组技术不断取得新的发展,应用领域日益扩展,在生物合成途径的改造、植物抗病能力的加强、环境污染的治理、医药工业的发展、异源表达体系的建立等方面都发挥了重要作用.文章综述了这项技术在近年来的新发展和新应用,并展望了DNA家族改组技术的发展前景.     

骨肉瘤基因改变的研究现状

骨肉瘤是骨的高度恶性肿瘤，从分子水平的角度看其形成机制：一是致癌基因的过度表达，一是抑癌基因的突变或被抑制。本文综述骨肉瘤的基因改变及其预后。一、抑癌基因的改变最常见的抑癌基因是P53，定位于染色体17PP13，野生型的P53的蛋白在NH。末端具有转录因子的活性，可与启动子上特异性的DNA序列相结合而激活靶基因（如P刀），如果启动子上没有可与P53结合的特异性的DNA序列，P53反过来就抑制转录。利用SSCP方法检查127例骨肉瘤标本的P53基因发现21例发生改变，其中13个属误义突变引起氨基酸序列的改变，6个属无意义的突变。大…     

结核分枝杆菌DNA指纹分析研究

目的：采用结核分枝杆菌IS6110－RFLP DNA分型的方法分析上海近年分离的部分结核分枝杆菌临床分离株，并进行分子流行病学分析。方法：提取结核分枝杆菌基因组DNA，纯化后经限制性内切酶PvuⅡ切割，琼脂糖凝胶电泳和Southern转印后，用荧光标记的IS6110 DNA序列中245bp探针杂交，以核酸化学发光试剂盒探测荧光信号，比较各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型，分析各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型。结果：经245bp探针杂交后的指纹图谱显示大部分菌株含9－21个IS6110拷贝,但有1菌株不含IS6110拷贝。另一株含1个IS6110拷贝。结论：结核分枝杆菌上海分离株指纹图谱呈高度多态性。零拷贝菌株和单拷贝菌株不能用IS6110－RFLP DNA指纹分析方法分析。     

古核嗜热菌组蛋白基因多点突变的新方法

嗜热菌组蛋白基因序列中精氨酸密码子在大肠杆菌中的表达率极低，限制了组蛋白的大量获得。运用分子生物学技术，在传统PCR定点突变技术的基础上进行改进，参照古核嗜热菌组蛋白基因序列和大肠杆菌偏爱密码子表，设计了一对含有5个精氨酸突变密码子的单链DNA，全长为115nt，在3‘端有20nt互补序列。将单链DNA在94℃，45℃复性，使其互补结合，72℃进行延伸反应，得到含有突变位点的组蛋白基因；再以此基因为模板设计相应的一对引物进行PCR扩增反应，得到大量组蛋白突变基因。该研究为一些序列已知，片段较小基因的多态突变提供了一种简单、易行的方法。     

DNA高甲基化与肿瘤的研究进展

在哺乳动物DNA分子中,DNA甲基化是指甲基（-CH）3在DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferases,DNMTs）催化下,共价结合到DNA分子的胞嘧啶（C）碱基的5位碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶（5mC）的表观遗传学修饰过程。DNA甲基化发生在DNA复制完成之后,因此不改变DNA序列,是一种可逆的变化[1],是通过影响基因的表达以改变其功能。