大鼠肝星状细胞和库普弗细胞的分离培养及鉴定

目的 应用改良的方法同步分离、培养和鉴定原代大鼠肝星状细胞(HSC)和库普弗细胞(KC).方法 采用Ⅳ型胶原酶肝脏灌注消化及Percoll密度梯度离心体外同步分离、纯化及培养HSC和KC,并用光学显微镜、免疫组织化学染色、电子显微镜等方法进行鉴定.结果 每只大鼠HSC和KC的细胞获得率分别为(1.8～2.9)×107和(0.8～1.4)×107,平均纯度分别为94.7%±1.7%和95.2%±1.5%,活力分别为95.5%±1.3%和96.4%±2.4%.结论 Ⅳ型胶原酶肝脏灌注消化及Percoll密度梯度离心体外同步分离培养HSC和KC方法简单,细胞获得率、活力和纯度高.     

离心淘洗技术在分离大鼠肝非实质细胞亚群中的应用

目的采用离心淘洗技术分离纯化大鼠肝非实质细胞亚群.方法通过原粒肝脏酶灌注,准备肝非实质细胞悬液,离心淘洗,收集不同流速(20和40ml/min)的细胞群.结果经培养鉴定,流速21ml/min获得的为肝窦内皮细胞,40ml/min的为库普弗细胞,细胞纯度均大于95%.结论在本实验室,离心淘洗技术已能成功应用于肝脏细胞分离过程.     

大鼠移植肝内Kupffer细胞分离及对T细胞增殖的抑制效应

目的:建立分离、纯化和培养大鼠肝脏Kupffer细胞(KC)的方法,并观察KC对同种反应性T细胞增殖的影响。方法:采用在体原位肝脏灌注结合密度梯度离心技术,进行肝移植受体大鼠肝脏KC分离、纯化和培养。在体外实验中进一步观察KC在MLR(混合淋巴细胞反应)体系中对同种反应性T细胞增殖程度的影响。结果:KC得率为(1.1±0.2)×107/肝,平均存活率为(93.5±1.8)%,纯度≥90%,ED-2( )。培养24h可见大量细胞伸展生长,呈现典型的星形或多边形。在MLR体系中加入未经辐照的KC后,反映T细胞增殖程度的每分钟脉冲数值明显降低,且接受联合免疫治疗并长期存活的D、E两组所获得的KC对T细胞增殖有着更为明显的抑制作用。结论:本实验成功建立了分离、纯化和培养大鼠KC的方法。KC对同种反应性T细胞增殖具有抑制作用,尤其从接受联合免疫治疗后长期存活受体大鼠所获得的KC抑制作用更为明显。     

肝再生时前列腺素E_2调控枯否细胞的白介素6生成

实验观察了肝切除后前列腺素E_2(PGE_2)与枯否细胞(KC)生成白介素6的关系。取S-D雄鼠分成70％肝切除和探查对照两大组,每组各再分成高精氨酸和低精氨酸RPMI-1640组织培养基(以下分别简称HA和LA培养基)两小组。分别在术后2、5、7和14天杀死动物,取出肝脏,用Hank平衡盐液(HBSS)灌洗,在铜筛中研碎至HBSS中,经沉淀、孵育等步骤取得肝细胞和非实质细胞,用HA或LA孵育肝细胞4小时,提取KC,其纯度>95％,活力>90％。     

PP2A在肝枯否细胞NF-κB活化中的调控作用及其效应机制

目的 探讨蛋白磷酸酶2A (PP2A)的表达在肝枯否细胞(KC)核因子-κB(NF-κB)活化中的作用,对KC核因子-κB活化的表达调控机制进行理论探索.方法 采用胶原酶灌注和percol密度梯度离心法分离得到高纯度大鼠KC,分为内毒素(LPS)及二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)+LPS分别与KC体外共培养组及一个阴性...     

BALB/c鼠肝脏枯否细胞不同分离培养方法的比较

目的建立简便易行,存活好、产量和纯度高,稳定的枯否细胞（Kupffer Cell,KC）分离培养方法。方法根据酶消化时间不同和裂解红细胞的方法在酶消化之后和之前分方法Ⅰ和方法Ⅱ。分别运用0.1%的Ⅱ型胶原酶、0.05%链酶蛋白酶E和0.005%DnaseⅠ在不同方法中离体消化肝组织并进行密度梯度离心和贴壁培养提取KC,通过吞噬实验观察鉴定KC。结果方法Ⅰ和方法Ⅱ中KC的数量分别是（0.71±0.21）×10^7/g和（0.96±0.20）×10^7/g,细胞贴壁率分别40.1%、45.1%。用0.4%台盼蓝染色鉴定,存活率分别为90%、95%。吞噬实验发现,细胞纯度分别为90%、95%。结论结合碾磨筛网滤过降低酶作用时间并在酶消化之前裂解红细胞分离提取枯否细胞具有存活好产量纯度高的优点。     

一种改进的自体表皮细胞悬液制取方法

目的:探讨新的自体表皮细胞悬液制取方法。方法:选取30只大鼠,应用切削皮法结合胰蛋白酶和组织微粒法结合中性蛋白酶/胰蛋白酶法两种技术获得自体表皮细胞悬液并进行细胞产量和活力的比较。结果实验组整个操作约1h内即可完成,而对照组则需要1.5天的时间。实验组活细胞率0.966±0.35,对照组活细胞率0.971±0.42,两组间比较无明显差异(P0.05)。细胞产量:实验组(1.5±0.52)×106,对照组(1.9±0.72)×106,两组间比较有无差异(P0.05)。结论:切削皮法结合胰蛋白酶法制取表皮细胞悬液,制取的表皮细胞悬液的产量和活力与组织微粒法结合中性蛋白酶/胰蛋白酶法比较无显著差异,但操作简单和耗时少。     

肝脏再生过程中枯否细胞产生α肿瘤坏死因子受抑

研究了切除雌性大鼠68％肝脏以后再生肝枯否细胞(KC)产生α肿瘤坏死因子(αTNF)的能力,并以单纯剖腹组为对照。手术均在上午8～10时进行,术后24小时以胶原酶消化大鼠肝脏,粘附法分离纯化KC。培养24小时,取含5×10~5KC的培养液1ml,与细菌脂多糖(LPS)一起培养。分别于8、12、24、48小时取上清液,以L929成纤维细胞溶解法测定αTNF活性。结果显示,假手术组5×10~5KC在用2.5μg/mlLPS刺激后8小时,αTNF产量明显     

抑制Caspase-8基因表达对减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用

目的 观察抑制半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶8(Caspase-8)基因的表达对减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用.方法 构建针对大鼠Caspase-8基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体.将Lewis大鼠随机分为3组,每组8只.(1)假手术组:麻醉后,取腹部正中切口,缝合关腹;(2)磷酸盐缓冲液(PBS液)组:阻断肝门血流前48 h经门静脉注射PBS液1 ml,然后行肝脏缺血再灌注;(3)shRNA组:阻断肝门血流前48 h经门静脉注射Caspase-8 shRNA 50 μg(总体积为1 ml),然后行肝脏缺血再灌注.肝脏缺血再灌注的方法为阻断大鼠70%入肝血流40min.于再灌注6 h、12 h、24 h、3 d、5 d、7 d时检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平;检测肝组织中Caspase-8 mRNA的表达、细胞凋亡情况、丙二醛(MDA)以及超氧化物岐化酶(SOD)的含量.结果 与PBS液组比较,shRNA组再灌注6、12、24 h,血清中ALT和AST水平显著降低(P<0.05);肝组织中Caspase-8 mRNA水平、肝细胞凋亡指数(shRNA组和PBS液组分别为22.33%±4.28%和35.24%±2.33%)以及肝组织中MDA含量[shRNA组和PBS液组分别为(94.5±11.2)nmol/mg和(133.5±12.4)nmol/mg]均显著降低(P<0.05),而肝组织中SOD活性显著升高[shRNA组和PBS液组分别为(21.6±3.7)U/mg和(12.2±3.1)U/mg,P<0.05].结论 通过RNA干扰Caspase-8基因的表达可以抑制肝细胞凋亡的发生,减轻肝脏缺血再灌注损伤.     

BALB/c鼠枯否细胞的分离培养与鉴定

目的 :肝脏是肿瘤转移的好发部位 ,而肝脏含有丰富的免疫细胞 -枯否细胞 (Kupffer Cell,KC)。为研究枯否细胞的抗癌活性 ,旨在探讨 BAL B/ c鼠枯否细胞的分离培养方法。方法 :选用健康雄性 8～ 10周龄 BAL B/ c鼠 ,麻醉无菌取肝 ,注射冲洗去血并剪去部分结缔组织 ,小玻璃瓶中剪碎肝组织 ,加入 0 .0 4 %的 EDTA和 0 .0 5 %链霉蛋白酶 E溶液 ,交替轻轻吹打消化。不锈钢筛网滤过 ,用 0 .0 0 4 % Dnase 的 16 4 0液清洗细胞液 ,加 Tris-氯化胺溶解红细胞。 30 %～ 70 % Percoll梯度离心 ,10 % FBS贴壁培养 4～ 6 h洗去非贴壁细胞。通过对比体内、体外枯否细胞吞噬墨水和体外吞噬聚苯乙烯乳珠 (latexbeads,D1.1μm )鉴定枯否细胞。结果 :Kupffer细胞的得率为 (7.5 7± 1.92 )× 10 6 个 /鼠肝 ,即 6 .15× 10 6 个 / g,贴壁率为4 0 .18%。用 0 .4 %台盼蓝染色鉴定 ,细胞存活率在 95 %以上 ,吞噬鉴定发现 Kupffer细胞的纯度可达 90 %。贴壁 Kupffer细胞的形态多样 ,可见不规则 ,多边形 ,多角伪足 ,典型的星形及多角形。体外培养枯否细胞存活 2周后未见再有吞噬功能。结论 :酶消化法结合梯度离心和贴壁培养是分离 BAL B/ c鼠枯否细胞的可靠方法 ,为进一步实验打下了基础     

雪旺细胞胞浆神经营养蛋白的分离纯化和理化性质测定

目的：分离纯化雪旺细胞胞浆神经营养蛋白并测定其等电点。方法：培养收集新生１－３天ＳＤ乳鼠四肢神经雪旺细胞，超声粉碎，超速离心，取上清胞浆成份超滤浓缩，收集分子量＞１０ＫＤａ浓缩蛋白液，通过ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ离子交换层析，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤层析和Ｄｉｏｌ－１５０高压液相分子筛层析进行分离纯化，等电聚焦电泳测定纯化的活性蛋白质等电点和ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其亚基分子量。结果：成功地分离纯化出一种活性蛋白质，分子量约５８ＫＤａ，等电点４．５５，结论：联合应用超滤浓缩、离子交换层析、凝胶过滤层析和高压液相能较理想地分离纯化雪旺细胞胞浆蛋白     

人和兔雪旺氏细胞的体外培养及形态学观察和生物特性研究

雪旺氏细胞(Schwann cell,SC)在神经再生过程中起着重要作用。我们取人胚及兔之坐骨神经,采用“植块多次移出法”培养出纯净度达99％的人和兔的SC。对培养的SC进行了冻存和复苏处理,复苏后的细胞可保持原有的生长特性。     

肝干细胞的研究进展及应用前景

目的阐述肝干细胞（liver stem cell，LSC）的研究进展并展望其应用前景。方法广泛查阅近年来相关文献，根据研究成果，综述LSC研究的最新进展。结果LSC向特定的细胞分化和增殖受多种因素影响。LSC活化、分离培养、筛选及鉴定等方法尚未成熟。结论随着研究不断地深入，LSC有望成为肝病治疗的新型种子细胞，但其研究有待进一步完善。     

胰岛素及丹参对体外培养成纤维细胞影响的实验研究

为了探讨胰岛素、丹参在伤口愈合过程中对胶原合成与分解代谢的影响，应用人胚皮肤培养成纤维细胞，分设胰岛素组、丹参组及对照组，培养２，４和６天，观察细胞的生长情况。成纤维细胞生长曲线显示：胰岛素组高于对照组，对照组高于丹参组。细胞核分裂率三组分别为１９．６０‰，２．５０‰和３．７７‰。扫描电镜观察发现胰岛素组成纤维细胞周围及表面有大量纤维状物，丹参组成纤维细胞表面光滑，仅有少量纤维状物。认为，胰岛素对成纤维细胞增殖和胶原合成有促进作用，而丹参对成纤维细胞增殖和胶原合成则有抑制作用     

SQUAMOUS CELL CARCINOMA OF THE SKIN OF THE TRUNK AND LIMBS: THE INCIDENCE OF METASTASES AND THEIR OUTCOME

The incidence and outcome of metastatic squamous cell carcinoma of the skin is poorly documented. This study, undertaken in a population accessible to long-term follow-up, documents the metastatic aspects of squamous cell carcinoma of the skin of the trunk and limbs. In a review of 695 cases, metastases occurred in 34 cases, with a metastatic rate of 4.9%, an overall mortality of 3.4%, and a 70.6% mortality in the metastatic group. Forty-six per cent of overall mortality was associated with inoperable or recurrent regional disease without evidence of distant metastases. The risk factors associated with the development of metastatic disease were; delayed presentation: large neglected lesions: misdiagnosis; and multiple treatments to the primary lesions. In this series no correlation was found between the histological degree of differentiation of the primary tumour and the development of metastases. The mean latent period between treatment of the primary and the diagnosis of metastases was 11 months. Histopathological review of the regional lymph nodes in the operable group showed that adverse pathology such as multiple nodes, extracapsular spread, vascular and perineural invasion. were associated with regional recurrence and short survival. Twenty-one patients with operable metastases had a mean survival of 53.8 months. This was compared with 13 patients with inoperable disease, in whom the mean survival was 12.2 months (P< 0.05).     

复合可降解基质膜片制备及血管内皮细胞在其吸附生长的实验研究

目的　制备几种复合可降解基质膜片 ,观察血管内皮细胞在其上的生长情况。方法　用胶原酶消化法分离牛主动脉血管内皮细胞 (VEC) ,另采用两步盐析法提取牛骨 型胶原。将交联胶原包埋处理聚羟基乙酸 (PGA)、聚乳酸 (PL A)及聚β羟基丁酸 (PHB)形成可降解基质材料膜片 ,并接种牛 VEC,采用 MTT法比较 VEC在几种可降解基质材料膜片的生长情况。结果　胶原、PGA/胶原、PL A/胶原膜质地均匀柔韧 ,固定成形 ,具有一定弹性和吸水性 ;MTT比色实验表明 VEC在胶原、PGA/胶原、PL A/胶原上均生长良好 ,优于 PHB/胶原组。尤以 PGA/胶原所形成的基质材料固定成形 ,弹性和韧性好 ,VEC在其上贴附生长良好。结论　通过生物材料与人工可降解材料有机结合 ,PGA/胶原物理性能互补 ,是组织工程再造血管较理想的基质材料之一。     

骨巨细胞瘤的治疗及复发病例分析

目的分析骨巨细胞瘤（giant cell tumor of bone，GCT）患者的临床特点、治疗方法及复发相关因素，探讨GCT治疗方法的选择。方法分析1993年1月～2005年1月收治的获随访的GCT患者38例，男13例，女25例。年龄14～59岁，平均31．1岁。经术前穿刺活检及术后证实为GCT，总结其临床特点并进行同顾性分析。所有患者均经病理诊断证实，Campanicci’s放射学分级：I级5例，Ⅱ级22例，Ⅲ级11例。按Enneking分期：I期9例，Ⅱ期21例，Ⅲ期8例。Jaffe’s病理分级：I级7例，Ⅱ级24例，Ⅲ级7例。29例GCT位于膝关节周围（股骨远端13例，胫骨近端16例），股骨近端、尺骨近端、桡骨远端、骶尾部各2例，腰椎1例。3种基本手术方法分别为：单纯刮除植骨4例；刮除植骨＋磨钻、石碳酸、50％ZnCl2、3％碘酒、骨水泥等辅助治疗26例；瘤段截除8例。结果38例术后获随访12～144个月，平均67个月。4例行单纯刮除植骨均复发；8例行瘤段切除，术后无复发；26例刮除植骨＋辅助灭活方法，8例复发。按Campanicci’s放射学分级：I级5例无复发，Ⅱ级22例复发6例，Ⅲ级11例复发6例。按Enneking分期：I期9例复发2例，Ⅱ期21例复发6例，Ⅲ期8例复发4例。术后共复发12例，复发率31．6％，均位于膝关节周围，复发时间为2～36个月，平均14．3个月。复发12例患者均行二次手术治疗，其中8例选择瘤段切除，4例行刮除植骨＋辅助灭活方法，术后均无复发。结论GCT术后复发多发生于膝关节周围，以胫骨侧为主，Campanicci’s放射学分级的Ⅱ级和Ⅲ级，且临床表现侵蚀性较高者。单纯刮除植骨复发率较高，正确使用辅助方法结合现代广泛刮除技术及现代的诊疗技术是降低复发率的重要手段。     

去细胞猪主动脉瓣叶的获取和内皮细胞的种植

目的　探讨猪主动脉瓣叶去细胞后作为组织工程心脏瓣膜支架的可行性。　方法　经胰酶 - EDTA、表面活性剂和核酸酶处理 ,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分 ,测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性 ,并在其表面种植新生牛主动脉内皮细胞 (BAECs) ;分别行大鼠皮下包埋实验。　结果　猪主动脉瓣叶中的细胞成分能完全去除 ,获得完整无细胞的纤维网状支架 ,断裂强度和断裂伸长率无明显变化 ;种植的 BAECs在去细胞瓣叶表面可形成一层连续的细胞层 ,其分泌前列环素 (PGI2 )的能力同直接种植在 2 4孔板中的比较 ,差异无统计学意义 (P>0 .0 5 )。　结论　猪主动脉瓣去细胞后获得的纤维支架可以用来构建组织工程瓣膜 ,适宜于血管内皮细胞的生长。     

体外培养血管平滑肌细胞与内皮细胞增殖的影响

目的 研究在外体培养条件下兔血管内皮细胞条件培养基（ＥＣＣＭ）、内皮素－１（ＥＴ－１）、内皮素转化酶抑制剂（Ｅｎ－ｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｃｏｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ对血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）增殖的影响,同时研究了血管平滑肌细胞条件培养基（ＳＭＣＣＭ）对血管内皮细胞（ＥＣ）增殖方面的影响。方法 ＥＣ和ＳＭＣ均来源于兔主动脉,在获得了ＥＣ和ＳＭＣ的条     

细胞凋亡及增殖细胞核抗原双染色在肝细胞肝癌组织中的研究

目的 研究肝细胞肝癌细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）／凋亡细胞比值与肝细胞肝癌分化程度的关系。方法 应用原位末端标记法（TUNEL）及免疫组化双染色技术,对35例肝细胞肝癌石蜡包埋组织进行检测。结果 不同分化程度癌组织中细胞凋亡和PCNA的阳性率不同。分化程度高,细胞凋亡阳性率高、PCNA阳性率偏低;分化程度低,细胞凋亡阳性率偏低、PCNA阳性率高。随分化程度的降低,PCNA／凋亡细胞的比值显著增加,二者有良好的相关性。结论 PCNA／凋亡细胞的比值可作为评估肝细胞肝癌分化程度的指标。