E1A基因对喉癌细胞系放射敏感性的影响及机制的初步实验研究

目的 探讨ElA基因对喉癌细胞系(Hep-2细胞)放射敏感性的影响并初步探讨其机制.方法 以腺病毒为载体将E1A基凶及其空载体转染至人Hep-2细胞,经RT-PCR法鉴定获得含ElA的阳性兜隆.设未转染组(PBS)、转染空载体组(Ad-β-gal)和转染组(Ad-E1A),分别给予6 MVx线单次照射0、1、2、4、6、8、10 Gy,成克降实验绘制细胞存活曲线并计算D0、Dq、α、β值以观察E1A基因对Hep-2细胞放射敏感件的影响.设PBS组、Ad-β-gal组、Ad-E1A组、PBS+照射组、Ad-β-gal+照射组、Ad-E1A+照射组,单次照射6 Gy,流式细胞仪检测细胞凋亡及RT-PCR检测血管内皮牛长因子(VEGF)水平并半定量VEGF以初步探讨机制.结果 转染后的阳性克隆细胞RT-PCR结果显示E1A已整合到细胞基因组中并且稳定表达.Ad-E1A组、Ad-β-gal组、PBS组细胞的D0值分别为0.86、1.96、1.98 Gy,Dq值分别为1.02、1.97、1.99 Gy,α值分别为0.536、0.112、0.104(Gy-1)和β值分别为0.521、0.137、0.125(Gy-2).PBS组、Ad-β-gal组、Ad-ElA组、PBS+照射组、Ad-β-gal+照射组、Ad-E1A+照射组的细胞凋亡率分别为1.26%、1.18%、2.16%、2.55%、2.96%、4.96%.Ad-E1A组、PBS+照射组、Ad-βgal+照射组及Ad-ElA+照射组VEGF的表达水平较PBS组及Ad-β-gal组低,且Ad-E1A+照射组表达最低.结论 成功构建了稳定表达E1A基因的喉癌细胞系.EIA基因对人喉癌细胞有放射增敏作用,其机制可能与降低VEGF表达和促进细胞凋亡有关.     

沉默CDKN1A基因对鼻咽癌放射抗拒性CNE-2R细胞放射敏感性的影响

目的：探讨CDKN1A基因的表达与鼻咽癌放射敏感性的关系。方法构建慢病毒表达载体LV-CDKN1A-RNAi并转染鼻咽癌放射抗拒性CNE-2R细胞,设转染LV-CDKN1A-RNAi慢病毒的CNE-2R细胞为实验组,转染阴性对照慢病毒的CNE-2R细胞为阴性对照组,未转染的CNE-2R细胞为空白对照组。用CCK-8法、细胞克隆形成实验及流式细胞术分别检测各组细胞增殖、放射敏感性及细胞周期的变化。结果成功构建了CDKN1A基因沉默的CNE-2R细胞,CCK-8法检测显示实验组CNE-2R细胞在照射6 Gy后生长受到抑制,且随时间延长其抑制作用更为明显。细胞克隆形成实验显示实验组CNE-2R细胞放射敏感性增强（放射增敏比为SER=1.24）。流式细胞术检测显示实验组与对照组细胞相比, G0/G1期和G2/M期细胞分布在X射线照射6 Gy前后明显改变（P约0.05）。结论 CDKN1A基因沉默能增强鼻咽癌放射抗拒性CNE-2R细胞的放射敏感性,CDKN1A基因的表达可能与鼻咽癌放射敏感性相关,有望成为鼻咽癌治疗的新靶点。     

miR-6732-3p对鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R放射敏感性的影响

目的 探讨miR-6732-3p表达对人鼻咽癌CNE-2R细胞放射敏感性的影响。方法 采用RT-qPCR检测miR-6732-3p在CNE-2和CNE-2R细胞株中的表达。用miR-6732-3p慢病毒转染CNE-2R细胞后,将CNE-2R细胞分为三组,分别为CNE-2R组（正常对照组）、miR-6732-3p NC组（转染对照组）、miR-6732-3p inhibition组（转染组）。RT-qPCR检测各组细胞中miR-6732-3p的表达,CCK-8、流式细胞术和克隆形成实验分别检测转染前后的细胞增殖、凋亡能力及放射敏感性。结果 RT-qPCR检测结果显示,miR-6732-3p在CNE-2R细胞中的表达量明显高于CNE-2细胞（P=0.036）。采用慢病毒转染CNE-2R细胞后,转染组细胞miR-6732-3p 的表达量均较转染对照组和正常对照组低（P＜0.05）。CCK-8法检测结果显示,与两个对照组相比,转染组细胞生长受抑制（P＜0.001）;在不同照射剂量下,转染组细胞的存活分数均明显降低（P＜0.001）。流式细胞仪检测结果显示,未经照射（0 Gy）和接受8 Gy照射后转染组细胞凋亡率均较转染对照组及正常对照组明显升高（P＜0.05）。克隆形成实验结果显示,转染组的放射生物学参数D0、Dq、SF2值均低于两个对照组（P＜0.05）;在不同照射剂量下,转染组细胞存活分数亦低于两个对照组（P＜0.001）。结论 沉默miR-6732-3p可提高鼻咽癌CNE-2R细胞的放射敏感性,为鼻咽癌放射抗拒的分子靶向治疗提供新思路。     

siRNA沉默Annexin A2基因表达对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响

目的 探讨siRNA沉默Annexin A2基因表达对鼻咽癌CNE-2(R743)细胞放射敏感性的影响。方法 化学合成Annexin A2基因的siRNA经HiPerFect转染入R743细胞。RT-PCR和蛋白印迹法检测转染前后Annexin A2的mRNA和蛋白表达,克隆形成实验分析转染前后对细胞放射敏感性的影响,流式细胞仪和TUNEL实验分别检测转染前后经X线照射后细胞周期、细胞凋亡情况。结果 RT-PCR和蛋白印迹法结果显示转染组细胞Annexin A2基因及蛋白表达下调。克隆形成实验分析结果表明转染组D₀、D_q、SF₂值均低于单纯照射组和转染对照组,其相应放射增敏比(D₀值比)分别为1.30和1.27。X线照射后转染组细胞G₂+M期比例增加并高于单纯照射组和转染对照组(32.46%、9.42%、9.17%,P=0.000、0.000),转染组凋亡率也高于单纯照射组和转染对照组(35.20%、10.87%、11.33%,P=0.000、0.000)。结论 siRNA沉默Annexin A2基因表达可增强R743细胞放射敏感性,可能与DNA损伤修复、细胞周期时相分布变化有关。     

E1A基因对鼻咽癌细胞放射敏感性影响的初步实验研究

目的 探讨E1A基因对鼻咽癌细胞放射增敏作用及相关机制.从而为提高鼻咽癌放射治疗疗效提供实验依据.方法 经腺病毒介导,将E1A基因导入人鼻咽癌细胞系CNE2细胞.经RT-PCR鉴定,获得含E1A的阳性克隆.将未转染的CNE2细胞、转染对照空载体Ad-B-gal的CNE2细胞和转染Ad-E1A的CNE2细胞用6 MV X线分别照射0、2、4、6、 8 Gy后进行成克隆分析并绘制细胞存活曲线,计算放射增敏比.流式细胞术和RT-PCR检测转染前后的细胞周期分布以及wtp53表达情况.结果 转染后阳性克隆细胞RT-PCR结果说明E1A已整合到细胞基因组中并且稳定表达.细胞存活曲线结果显示转染E1A的CNE2细胞放射增敏比分别为1.37(D_0值比)、1.95(D_q值比)、1.46(SF_2值比).未转染及空载体转染后的CNE2细胞照射后细胞存活曲线分析结果显示无差异,D0D_qSF2值分别为1.57 Gy及1.53 Gy、1.82 Gy及1.78 Gy、0.89及0.82.流式细胞术显示细胞周期出现G_2+M期阻滞,RT-PCR结果显示E1A基因能提高wtp53的表达.结论 E1A基因能显著提高人鼻咽癌细胞的放射敏感性,其作用机制可能与E1A基因提高叭p53基因的表达和引起G2+M期阻滞有关.     

重组溶瘤腺病毒rAd-CMV-E1A的构建及其对人鼻咽癌细胞放射增敏的研究

目的:构建腺病毒rAd-CMV-E1A,将其作用于人鼻咽癌CNE-1细胞,验证目的基因E1A是否具有放射增敏作用及其作用机制.方法:使用"两步转化法",完成质粒pAd-pShuttle-CMV-E1A的构建,将其包装成腺病毒rAd-CMV-E1A;以相同的方法构建腺病毒rAd-CMV.使用噬菌斑法测定滴度.将病毒作用于CNE-1细胞,使用RT-PCR、实时荧光定量PCR检测E1A、p53、p21基因表达情况;联合X射线照射细胞,采用MTT比色法、细胞克隆形成实验、Annexin V-FITC/PI双染检测目的基因功能.结果:成功构建腺病毒rAd-CMV-E1A及腺病毒rAd-CMV,测得病毒滴度分别为1×1010pfu/ml.被转染目的基因E1A的CNE-1细胞能稳定转录E1A基因,会使p53基因转录增加,抑制p21基因转录.在2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy剂量下细胞生长抑制率rAd-CMV-E1A组高于rAd-CMV组(P<0.05);0 Gy下rAd-CMV-E1A组高于rAd-CMV组(P>0.05).射线+rAd-CMV-E1A组凋亡率最高(P<0.05).相同放射剂量下rAd-CMV-E1A组细胞存活分数低于rAd-CMV组、PBS组(P<0.05);放射增敏比:rAd-CMV-E1A组高于rAd-CMV组.结论:成功构建腺病毒rAd-CMV-E1A及腺病毒rAd-CMV,目的基因E1A在CNE-1细胞中能稳定转录,并增加靶细胞对X射线的敏感性,其机制可能是通过诱导下游p53基因高转录、抑制p21基因转录.     

抑制NFBD1基因的表达对鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性的影响

目的:通过短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰NFBD1(nuclear factor with BRCT domains protein 1)基因的表达,并探讨其对鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性的影响。方法:以慢病毒感染的方法将特异性针对NFBD 1基因的shRNA转入CNE-1细胞,并用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞;分别采用实时荧光定量-PCR(real-time fluorogenic quantitative-PCR,RFQ-PCR)及蛋白质印迹法检测NFBD1 mRNA和蛋白的表达;以克隆形成和FCM法检测沉默NFBD 1基因对CNE-1细胞放射敏感性的影响。结果:NFBD1-shRNA慢病毒载体感染后,CNE-1细胞中NFBD1 mRNA和蛋白表达水平明显降低。各组细胞经6 MeV电子线照射后,NFBD1-shRNA组细胞的凋亡率和G2/M期细胞所占的比例均较阴性对照组[negative control-shRNA(NC-shRNA)]明显增加(P<0.05),细胞存活分数较NC-shRNA组明显降低(P<0.05)。结论:采用慢病毒感染的方法靶向NFBD 1基因的RNA干扰可稳定沉默NFBD1的表达,从而增加鼻咽癌细胞对放射治疗的敏感性。     

过表达核凋亡诱导因子1增强鼻咽癌细胞放射敏感性

目的 探究核凋亡诱导因子1(nuclear apoptosis-inducing factor 1,NAIF1)对鼻咽癌细胞CNE-2R放射敏感性的影响。方法 采用Western blot检测NAIF1在鼻咽癌细胞CNE-2和CNE-2R的表达水平。通过慢病毒感染技术将NAIF1过表达慢病毒（LV-NAIF1组）及其阴性对照慢病毒（LV-NC组）分别感染CNE-2R细胞,采用RT-qPCR和Western blot检测NAIF1的mRNA和蛋白表达水平;采用CCK-8、克隆形成实验分别检测各组细胞在不同照射剂量（0、2、4、6、8 Gy）照射下的增殖能力、克隆形成能力并计算相应的存活分数,采用流式细胞术实验检测各组细胞6 Gy照射前后的细胞周期分布情况。结果 与CNE-2细胞相比,NAIF1在CNE-2R细胞中的蛋白表达水平显著降低（P<0.001）。与LV-NC组相比,LV-NAIF1组CNE-2R细胞中NAIF1的mRNA和蛋白表达水平均显著升高（均P<0.001）。经不同剂量照射后,与LV-NC组相比,过表达NAIF1可以抑制CNE-2R细胞的增殖能力（均P<0...     

Salubrinal抑制射线诱导NF-κB活化增加口腔癌细胞凋亡

目的 探讨Salubrinal调控射线诱导口腔癌细胞凋亡的作用机制。方法 构建放射抗拒口腔癌细胞KBR (4 Gy/次,7~10d 1次共4次);克隆形成实验检测Salubrinal预处理后口腔癌细胞放射敏感性;蛋白印迹法检测射线及Salubrinal调控口腔癌细胞NF-κB-HIF-1α信号通路及凋亡标志蛋白cleaved PARP的表达;Annexin V、PI染色、流式细胞仪检测凋亡分数。结果 克隆形成实验示Salubrinal增加口腔癌细胞放射敏感性,KB及KBR细胞放射增敏比分别为1.19和1.24。蛋白印迹法结果示射线诱导口腔癌细胞NF-κB-HIF-1α细胞活化具有时间依赖性,而Salubrinal抑制射线诱导其异常活化。Salubrinal增加射线诱导口腔癌细胞凋亡标志蛋白cleaved PARP表达及凋亡指数,而NF-κB激活剂TNF-α逆转了这一作用,提示Salubrinal通过抑制NF-κB活化增加射线调控口腔癌细胞凋亡。进一步应用NF-κB抑制剂Bay11-7082同样增加射线诱导口腔癌细胞凋亡,KB及KBR细胞系Bay11-7082+IR组cleaved PARP的表达为2.67±0.26、1.91±0.17,IR组为2.1±0.16、1.44±0.15(P<0.05)。结论 Salubrinal抑制射线诱导NF-κB活化增加射线诱导口腔癌细胞凋亡进而调控口腔癌细胞放射敏感性。     

RNA聚合酶Ⅰ抑制剂通过NF-κb调控鼻咽癌细胞系CNE-1的增殖、侵袭与凋亡

 目的 探讨RNA聚合酶Ⅰ抑制剂CX-5461对人鼻咽癌细胞CNE-1增殖、侵袭与凋亡的作用机制。方法 免疫组织化学染色检测鼻咽癌与癌旁组织NF-κb的表达。Western blot检测相关效应蛋白在蛋白质水平的表达。CCK-8法检测不同浓度药物处理后CNE-1细胞系的增殖情况。Transwell法比较药物处理后CNE-1细胞系的侵袭能力变化。流式细胞术检测不同浓度药物处理后鼻咽癌细胞系CNE-1细胞周期和凋亡的变化。结果 鼻咽癌组织中磷酸化NF-κb表达较癌旁组织明显增高（P<0.01）。NF-κb总蛋白在蛋白水平无明显变化，但磷酸化水平在药物处理后明显降低（P<0.01）。Bax较对照组明显增高（P<0.01），Bcl-2较对照组明显降低（P<0.01）。药物处理后，发现CNE-1 细胞系的增殖、侵袭能力较对照组明显降低且差异具有统计学意义（均P<0.01）；细胞凋亡较对照组明显增多（P<0.01），药物处理组较对照组细胞周期明显阻滞在G₂期（P<0.01）。结论 RNA聚合酶Ⅰ抑制剂CX-5461能够通过调控 NF-κb磷酸化促进鼻咽癌CNE-1细胞系凋亡及周期阻滞，抑制其增殖与侵袭能力。     

下调VEGF表达影响鼻咽癌细胞放射敏感度的机制

目的　应用RNA干扰技术抑制人鼻咽低分化鳞状上皮细胞癌细胞株CNE-2中血管内皮生长因 子（VEGF）表达,研究阻断VEGF基因表达对鼻咽癌细胞放射敏感度的影响及机制。方法 构建针对 VEGF的siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA（CNE-2组）、1个阴性对照质粒（CNE-2/Neg-siRNA 组）、经脂质体转染至CNE-2细胞（CNE-2/VEGF-siRNA组）,用平板克隆形成实验检测在6MV-X线 0、2、4、6、8、10 Gy照射后克隆形成能力及通过单击多靶模型、线性二次模型拟合放射生物学参 数,流式细胞检测分析细胞周期和细胞凋亡的变化,用RT-PCR定量分析三组细胞中Cyclin D1、Cyclin E、P16和P53的mRNA表达。结果 经6MV-X线0、2、4、6、8、10 Gy照射后细胞存活率显著下降, CNE-2/VEGF-siRNA组细胞经D0和2 Gy照射后的存活分数明显低于CNE-2组、CNE-2/Neg-siRNA组; CNE-2/VEGF-siRNA组中G1/S期细胞周期阻滞更为明显。在Cyclin D1、Cyclin E、p16和p53基因中, Cyclin D1mRNA表达在放疗后6、12和24 h进行性升高,差异有统计学意义,而其他基因变化差异无统 计学意义,Western blot检测显示Cyclin D1蛋白表达在放疗后24 h明显升高。结论 下调VEGF表达可 增加鼻咽癌细胞的放射敏感度,其机制可能是通过Cyclin D1信号通路途径使细胞周期发生G1/S期阻滞。     

冬凌草甲素联合地塞米松对多发性骨髓瘤U266细胞增殖及凋亡的影响

目的：探讨冬凌草甲素联合地塞米松对多发性骨髓瘤 U266细胞增殖与凋亡的影响及其相关分子机制。方法培养 U266细胞至对数生长期,分别采用高、中、低浓度的地塞米松、冬凌草甲素单独或联合处理 U266细胞,以二甲基亚砜（DMSO）处理为对照,于处理后24、48、72 h 利用 CCK-8法检测细胞增殖情况;应用 Annexin V-FITC／PI 标记及流式细胞术检测细胞凋亡;利用实时荧光定量 PCR 法检测细胞 Notch1、NF-κB／p65、bcl-2基因表达水平的变化;Westernblot 法分析 Notch1、cleavedNotch1、NF-κB／p65、bcl-2蛋白表达水平的变化。结果与对照组相比,不同剂量的药物处理组均能有效抑制 U266细胞的增殖并促进其凋亡（P＜0.05）,两种药物联合应用对 U266细胞的抑制增殖和诱导凋亡具有协同作用（P＜0.05）。 U266细胞经地塞米松处理后其 NF-κB／p65、bcl-2 mRNA 和蛋白表达水平均有所下调（P＜0.05）,冬凌草甲素处理组及联合处理组 U266细胞 Notch1、cleaved Notch1、NF-κB／p65、bcl-2蛋白表达水平均显著下调（P＜0.05）。结论冬凌草甲素联合地塞米松对 U266细胞增殖的抑制作用及凋亡诱导作用显著增强,其作用机制可能与抑制 Notch1信号通路有关。     

重组TFAR19蛋白对鼻咽癌CNE 1细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响

目的：研究重组TFAR19（TF-1 cell apoptsis-related gene 19）蛋白对鼻咽癌细胞株CNE-1端粒酶活性及端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA表达的影响，探讨重组TFAR19蛋白促CNE．1细胞凋亡的作用机制。方法：将不同浓度的高纯度重组TFAR19蛋白分别和人类鼻咽癌细胞株CNE-1共同培养后，通过7-AAD及Annexin V-PE标记进行流式细胞术分析，检测TFAR19蛋白对细胞的促凋亡效应；PT-PCR法比较试验组和对照组CNE-1细胞株端粒酶hTERTmRNA的表达水平；TRAP-银染法检测重组TFAR19蛋白作用下CNE．1细胞株端粒酶活性的改变。结果：（1）一定浓度的TFAR19蛋白在未加载体的情况下，可促进细胞凋亡，加入5、10、15、20、30mg／L的TFAR19蛋白后，CNE-1细胞的凋亡率分别是：15．26％，29．48％，37．11％，54．20％，72．36％。阳性对照组（凋亡诱导剂stuanrosporin处理）与阴性对照组（PBS处理）的细胞凋亡率分别是98．37％、13．40％。（2）试验组与对照组CNE-1细胞株端粒酶hTERTmRNA表达无显著差异。（3）与20mg／L以上浓度的重组TFAR19蛋白共同培养后，CNE-1细胞株端粒酶活性明显降低。结论：重组TFAR19蛋白在较高浓度下可降低鼻咽癌细胞株CNE-1的端粒酶活性，明显促进肿瘤细胞凋亡。     

丙戊酸钠对奥沙利铂化疗痛大鼠的镇痛作用及其机制探讨

目的:探讨丙戊酸钠对奥沙利铂（oxaliplatin,OXA）化疗痛大鼠的镇痛作用及其机制。方法:连续5天腹腔注射OXA构建化疗痛大鼠模型;鞘内注射丙戊酸钠进行干预;将大鼠随机分成对照组、模型组以及丙戊酸钠给药组,记录大鼠痛觉行为及运动能力变化;分子对接分析丙戊酸钠与组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC6）结合;免疫荧光和免疫印迹法检测各组动物脊髓组织中HDAC6、星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(glail fibrillary acidic protein,GFAP)、促炎细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)以及Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）/核因子κB（nuclear factor κB,NF-κB）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）信号途径各成分蛋白的表达变化。结果:行为学检测表明,与对照组相比,连续腹腔注射OXA诱导大鼠自发缩足次数增加（P<0.05）,机械痛觉阈值下降（P<0.05）,运动能力受损（P<0.05）。免疫印迹和免疫荧光分析显示,与对照组相比,模型组脊髓组织中HDAC6、IL-1β、GFAP、TLR4、MyD88、NF-κB和Caspase-1蛋白表达水平均增加（P<0.05）。与模型组相比,丙戊酸钠鞘内给药后减少大鼠自发缩足次数（P<0.05）,增加机械痛觉阈值（P<0.05）,转棒停留时间及运动距离增长（P<0.05）;降低HDAC6、IL-1β、GFAP、TLR4、MyD88、NF-κB和Caspase-1蛋白表达水平（P<0.05）。结论:丙戊酸钠可能通过靶向阻断HDAC6抑制脊髓TLR4/NF-κB/IL-1β炎症信号缓解大鼠化疗痛。