shRNA干扰Survivin基因后胶质瘤细胞中Survinvin及mcm2的表达及意义

目的观察小发夹状RNA(shRNA)干扰生存素(Survivin)对脑胶质瘤细胞株U251中Survivin及微小染色体维持蛋白2(MCM2)表达的影响。方法通过脂质体介导对脑胶质瘤细胞株U251、转染Survivin shRNA质粒PG-sur(p Genesil-Suvrivin)及无意义shRNA质粒PG,采用RT-PCR、Western-blot分别对未转染组(U251)、转染无意义序列组(U251-PG)及转染干扰序列组(U251-sur)检测Survivin的mRNA及蛋白表达情况,流式细胞术(FCM)定量测定各组细胞的细胞周期和细胞凋亡,MTT检测细胞增殖能力。采用RT-PCR、Western-blot分别检测转染前后细胞MCM2的mRNA和蛋白的表达情况。结果与其他两组比较,转染干扰序列组细胞Survivin基因的mRNA及蛋白表达抑制效果显著,细胞增殖能力降低,细胞周期G2/M期阻滞显著,细胞凋亡率升高(p<0.05)。MCM2的mRNA和蛋白表达显著降低。结论靶向Survivin基因的特异性shRNA能够在体外明显抑制U251细胞的生长并诱导其发生凋亡及细胞周期阻滞。且本试验结果表明MCM2是一可靠的细胞增殖标记物,且与Survivin之间不是各自孤的,两者间可能起协同作用共同参与胶质瘤的发生。     

shRNA靶向干扰Notch2对人脑胶质瘤细胞株U251的影响

目的 研究Notch2信号对人脑胶质瘤细胞株U251的增殖、凋亡和细胞周期的影响.方法 应用脂质体将pGFP-V-RS Notch2 shRNA干扰质粒导入胶质瘤细胞株U251后,应用MTT法检测细胞增殖变化、流式细胞仪检测转染效率、细胞凋亡和细胞周期的改变、RT-PCR和Westen blot检测Notch2基因的抑制效果和干扰后细胞周期、凋亡相关蛋白的表达改变.结果 pGFP-V-RS Notch2 shRNA干扰质粒转染效率为86.68%±2.54%,转染后在mRNA水平和蛋白水平均发生Notch2的表达抑制,与无关序列组和未转染组相比干扰组细胞自第5天开始增殖明显减慢(P<0.05),干扰组G0/G1 期细胞百分数(68.2 %±1.29%)显著高于无关序列组和未转染组(35.8 %±2.37% 和47.7%±1.03%, P<0.01),而干扰组G2/S期细胞(20.4%±1.56%)显著低于无关序列组和未转染组(49.1%±3.65% 和35.4%±2.42%, P<0.05),干扰组凋亡率显著升高(P<0.05).细胞周期、凋亡相关蛋白P21上调,cyclinD1、p-Rb下调.结论 Notch2靶向干扰能够显著抑制U251细胞株的增殖、阻滞细胞周期、增加凋亡.     

RNA干扰PDGF-B基因对胶质瘤U251细胞凋亡和增殖的影响

目的利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板源生长因子-B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法利用脂质体将针对PDGF-B基因的siRNA转染进入U251细胞,利用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RTPCR)检测PDGF-B基因表达;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达,采用MTT法检测胶质瘤U251细胞的增殖,应用流式细胞计数观察抑制PDGF-B基因后胶质瘤U251细胞的凋亡情况。结果 RT-PCR检测PDGF-B基因表达明显下降;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%),MTT结果显示siRNA转染组U251细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达能抑制胶质瘤细胞的有丝分裂,促进细胞的凋亡。结论构建针对胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长抑制和促进凋亡作用。     

下调BAG3表达对胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨下调BAG3表达对胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响。方法 体外培养U87细胞，转染pEGFP-BAG3-shRNA质粒构建BAG3低表达胶质瘤U87细胞株（低表达组），转染pEGFP-shRNA对照质粒为对照组；利用RT-PCR和免疫印迹法鉴定；利用CCK8和EdU检测U87细胞增殖，利用流式细胞术检测U87细胞凋亡。结果 与对照组相比，RT-PCR和免疫印迹法检测结果显示低表达组BAG3 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.05），低表达组24、48、72 h细胞增殖水平均明显降低（P<0.05），低表达组细胞凋亡率明显增高（P<0.05）。结论 下调胶质瘤U87细胞BAG3表达显著抑制其增殖、促进其凋亡。     

miRNA-145在脑胶质瘤中的作用

目的探讨微小RNA(miRNA)-145在脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞系中表达变化及对胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量PCR检测检测10例胶质瘤组织和瘤周组织以及4种细胞系(人脑胶质细胞株HEB以及胶质瘤细胞系U251、T98和U87)miRNA-145的表达水平。将miRNA-145模拟物、阴性对照序列转染胶质瘤细胞系U251细胞,采用PCR检测U251细胞miRNA-145表达水平,采用MTT法检测U251细胞增殖能力,采用流式细胞仪检测U251细胞凋亡。结果与瘤周组织相比,胶质瘤组织miRNA-145表达水平明显降低(P0.05)。与正常胶质细胞HEB相比,胶质瘤细胞系U251、U87、T98细胞miRNA-145表达水平均明显降低(P0.05)。与阴性对照组相比,miRNA模拟物组U251细胞miRNA-145表达水平明显增高(P0.01),U251细胞增殖能力明显降低(P0.05),U251细胞凋亡水平明显增高(P0.05)。结论胶质瘤组织miRNA-145呈低表达,上调miRNA-145表达能够抑制胶质瘤细胞系U251细胞增殖能力并诱导U251细胞凋亡。这提示miRNA-145有可能成为胶质瘤治疗的靶点。     

RNAi对U251细胞c-Met基因表达水平的影响

目的 探讨RAN干扰作用对人脑胶质瘤U251细胞c-Met基因表达的影响。方法 设计3对以c-Met为靶基因短发夹RNA片段,pGenesil-1质粒为载体,构建pGenesil-1/c-Met-shRNA重组质粒,将其转染人脑胶质瘤U251细胞。采用PCR和免疫印迹法分别检测c-Met基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建pGenesil-1-c-Met shRNA重组质粒,并转染至U251细胞。转染重组质粒的U251细胞c-Met基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。结论 RNA干扰能明显降低U251细胞c-Met基因mRNA和蛋白的表达水平。     

胶质瘤治疗的靶分子CDC2 RNA干扰的体外实验研究

目的 探讨抑制细胞周期依赖性激酶CDC2基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响,并为其作为胶质瘤发生发展相关基因在胶质瘤治疗方面的应用价值提供实验依据.方法 利用本实验室基因重组构建的CDC2 shRNA逆转录病毒表达质粒对体外培养的人脑胶质瘤细胞进行转染.倒置显微镜观察细胞形态和数量变化;RT-PCR及荧光实时定量PCR检测CDC2 mRNA表达;Western blot检测CDC2蛋白表达;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化;透射电子显微镜观察细胞超微结构.结果 人脑胶质瘤细胞系U251在转染针对CDC2的shRNA逆转录病毒表达质粒48h后,贴壁生长的细胞逐渐漂浮,细胞生长受到抑制,CDC2 mRNA下调均达98%以上,蛋白表达下调达92%以上,同时出现了明显的细胞G2/M期阻滞,细胞凋亡由0.57%上升到13.01%,并且超微结构受损明显.结论 CDC2 shRNA逆转录病毒表达质粒介导的RNA干扰能有效的抑制U251细胞的增殖,CDC2可作为胶质瘤基因治疗靶分子作进一步研究.     

RNAi沉默Gli1基因对人胶质瘤细胞U251增殖与凋亡的影响

目的 研究RNA干扰技术(RNAi)沉默Hedgehog(Hh)信号转导途径中核心转录因子Gli1基因表达后对U251细胞增殖与凋亡以及下游因子Bcl-2、Bax、cycin D1表达的影响。 方法 合成、转染4对针对Gli1 mRNA不同位点序列的siRNA (58、59、60、61)至人胶质瘤U251细胞,RT-PCR检测细胞Gli1 mRNA的表达,筛选最有效抑制Gli1 mRNA表达的siRNA干扰片段(siRNA-Gli1);RT-PCR、Western blotting分别检测转染SiRNA-Gli后不同时间U251细胞Gli1mRNA和蛋白的表达,确定转染干扰的时间规律;实验分为3组：siRNA-Gli1组（转染筛选后siRNA-Gli1片断）、siRNA-NC组（转染阴性对照siRNA片断）、siRNA-N组（空白对照）。RT-PCR、Western blotting分别检测各组转染48 h后U251细胞cyclin D1、Bcl-2及Bax mRN和蛋白的表达,MTT、流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡及细胞周期的变化。 结果 干扰片断58、59、60、61、NC的转染效率均达69.2％;RT-PCR检测显示转染后48 h U251-60细胞无明显Gli1 mRNA表达,选择60作为最佳干扰片段siRNA-Gli1转染U251细胞,48h时无明显Gli1 mRNA和蛋白表达,确定48 h为转染干扰的最佳时间;转染48 h后与siRNA-N和siRNA-NC组相比,siRNA-Gli1组U251细胞Bcl-2、cyclin D1 mRNA和蛋白表达下调、Bax mRNA和蛋白上调,差异均有统计学意义(P＜0.05)。MTT检测显示24、48和72 h时siRNA-Gli1组细胞增殖抑制率均明显高于siRNA-NC和siRNA-N组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。流式细胞术结果显示siRNA-Gli1组细胞凋亡率高于siRNA-NC和siRNA-N组,差异有统计学意义(P＜0.05),且siRNA-Gli1组G1/G0期细胞比例增加,S期细胞明显减少。 结论 针对Gli1基因设计合成的siRNA-Gli1能明显抑制人胶质瘤U251细胞生长并能诱导其凋亡,其机制可能与下调cyclin D1、Bcl-2的表达,上调Bax的表达有关。     

质粒介导外源性微小RNA干扰PTTG1表达抑制恶性人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭

目的 观察垂体瘤转化基因1(PTTG1)在恶性人脑胶质瘤U251细胞增殖和侵袭中的作用.方法 设计并合成2对靶向PTTG1 mRNA的寡核苷酸片段,将其连接pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体构建表达微小RNA真核载体MIR-1、MIR-2;将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定;脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,同时设转染阴性对照序列的阴性对照组(转染Neg组)和空白组;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)分析PTTG1 mRNA抑制效牢:Western印迹测定PTTG1蛋白的表达量改变:MTT法检测U251细胞增殖的改变:Matrigel侵袭实验检测U251细胞侵袭力的改变.结果 转染后,转染MIR-2组PTTG1 mRNA较空白组和转染Neg组下降为87.6%,PTTG1蛋白表达明显少于其他组:转染MIR-2组U251细胞不同时间点生长抑制率为10.7%～34.7%;Matrigel侵袭实验结果 示MIR-2组穿过人工基底膜U251细胞数减少.相对百分率为12.3%±1.0%,明显低于空白组(24.7%±1.4%)和转染Neg组(24.0%±2.0%),差异有统计学意义(P＜0.05).结论人脑胶质瘤U251细胞的PTTG1表达可被质粒导入的外源性微小RNA有效抑制,进而抑制细胞增殖,逆转恶性胶质瘤U251细胞侵袭、浸润.     

RNAi下调PIK3 CB表达抑制U251胶质瘤细胞生长的体内外研究

目的 探讨应用RNAi技术靶向磷酸肌醇酯-3-激酶β催化亚单位(PIK3CB)抑制恶性胶质瘤细胞系U251的PIK3CB表达后在体内外对U251细胞生长抑制作用.方法 将短发夹RNA(shRNA)表达载体psiRNA-PIK3CB进行脂质体介导的U251人脑恶性胶质瘤细胞系表达,检测细胞转染前后的细胞增殖能力和凋亡的变化.应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导shRNA基因治疗对U251细胞生长抑制作用,对肿瘤组织应用免疫荧光双染色和免疫组化的方法分析结果.结果 靶向PIK3CB的shRNA转染后U251细胞生长受到抑制,细胞周期出现G2/M阻滞,细胞明显凋亡.裸鼠皮下荷瘤模型实验显示psiRNA-PIK3CB显著抑制皮下肿瘤生长(P＜0.01).结论 靶向PIK3CB的shRNA基因治疗可以成为胶质瘤治疗的新策略.     

下调磷酸甘油酸激酶1增强胶质瘤U251细胞的放射敏感性

目的研究磷酸甘油酸激酶1(PGK1)对胶质瘤U251细胞放射敏感性的影响。方法建立放射抵抗的U251(RR-U251)细胞;LipofectamineTM2000方法将抑制PGK1表达的shRNA-PGK1质粒或对照shRNANC转染至U251细胞;荧光定量PCR及Western Blot检测PGK1的表达;MTT检测细胞相对存活率,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。结果与正常U251细胞相比,RR-U251细胞中PGK1的表达明显增高;放射处理后,RR-U251细胞的相对存活率升高,迁移能力及侵袭能力增强。转染shRNA-PGK1的细胞接受放射处理后,与对照组相比,细胞的相对存活率降低,迁移能力以及侵袭能力减弱。结论下调U251细胞中PGK1的表达可增加其放射敏感性,提示PGK1可能成为增强放射敏感性的调控靶点。     

靶向AKT1和COX-2的RNAi抑制U251胶质瘤细胞侵袭的体外实验

目的应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术敲低恶性胶质瘤细胞系U251中AKT1和COX-2表达后,在体外对细胞侵袭转移的抑制作用,初步探讨其可能的作用机制。方法构建重组腺病毒载体rAd5-A-C同时搭载靶向AKT1和COX-2的shRNA干扰序列,将其转染至恶性胶质瘤细胞系U251细胞。Realtime PCR检测RNAi后目的基因mRNA的表达水平,Western Blot检测目的基因及MMP-2、MMP-9、TIMP-2的表达情况。酶联免疫吸附试验检测转染前后分泌到细胞外的MMP-2和MMP-9的浓度变化。划痕实验和Transwell实验评价肿瘤细胞转染前后的细胞侵袭能力的变化。结果rAd5-A-C转染组AKT1和COX-2的mRNA和蛋白表达均明显抑制;MMP-2、MMP-9表达下调,TIMP-2表达则上调。ELISA检测胞外MMP-2、MMP-9浓度明显减低;划痕实验显示细胞转移运动能力明显减弱,Transwell体外侵袭实验结果显示穿过细胞数明显减低(P0.001)。结论重组腺病毒介导的RNAi技术可以序列特异性地抑制U251细胞AKT1和COX-2的表达,在体外对U251细胞侵袭转移产生明显抑制作用,可能成为恶性胶质瘤治疗的新策略。     

靶向表皮生长因子受体的shRNA抑制U251胶质瘤生长的实验研究

目的探讨靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的RNA干涉(RNAi)技术抑制恶性胶质瘤体外细胞系U251的EGFR表达后,在体内外对U251细胞生长抑制作用。方法在人EGFR开放阅读框的细胞内区酪氨酸激酶结构域选择1个siRNA靶序列、进行短发夹RNA(shRNA)表达载体psiRNA-2400的构建,并以含有随机序列的psiRNA-scr表达质粒为对照进行了脂质体介导的U251人脑恶性胶质瘤细胞系表达。应用RT-PCR检测EGFR表达水平,应用MTT法、流式细胞术和Matrigel基质生长实验评价肿瘤细胞转染前后的生物学行为。进一步应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导shRNA基因治疗对U251细胞生长抑制作用。对肿瘤组织应用免疫组化的方法进行EGFR、PCNA和GFAP表达比较。结果脂质体介导、靶向EGFR的shRNA可显著抑制U251细胞ECFR表达,MTT法分析显示psiRNA-2400转染组细胞生长抑制率为68%;与对照组和psiRNA-scr转染组比较,细胞周期分析结果表明psiRNA-2400转染组G_0～G_1期细胞数没有明显变化,进入S期的细胞数较对照组减少了12.7%～13%,而进入G_2期细胞则增加了10.5%～11.7%。Matrigel基质生长实验显示对照组和psiRNA-scr转染组细胞呈正常形态贴壁生长,而psiRNA-2400转染组细胞不能贴壁生长,呈团块状簇集生长。裸鼠皮下荷瘤模型实验显示psiRNA-2400显著抑制皮下肿瘤生长,组织病理学分析显示治疗组EGFR表达下降、PCNA标记指数降低而GFAP表达上调。结论靶向EGFR的RNAi技术可以显著抑制U251细胞的EGFR表达,在体内外对U251细胞生长均产生明显抑制作用。因此,shRNA表达质粒介导的基因治疗可以成为胶质瘤靶向性EGFR治疗的新策略。     

miR-127-3p通过下调靶基因MAPK4抑制神经胶质瘤增殖的机制研究

目的 探讨miR-127-3p在神经胶质瘤中的表达水平差异及生物学作用。方法 用RT-PCR法检测神经胶质瘤患者及健康人群脑脊液中miR-127-3p相对表达水平; 用RT-PCR法检测人神经胶质瘤细胞株和人正常神经胶质细胞中的miR-127-3p相对表达水平; 用瞬时转染法上调神经胶质瘤细胞U251中的miR-127-3p相对表达水平,用MTT法检测细胞增殖,用流式细胞术检测细胞凋亡,用Western blot检测凋亡相关蛋白bcl-2、Mcl-1和bax表达水平; Targetscan等在线靶基因预测软件预测miR-127-3p的靶基因,并采用双荧光素酶报告试验和Western blot验证miR-127-3p与靶基因之间的直接作用关系。结果 神经胶质瘤患者(1.33±0.12)脑脊液中的miR-127-3p相对表达水平低于健康人群(3.62±0.26)(t=5.867,P=0.004); U251(0.59±0.05)、U373(0.96±0.08)、U87(0.77±0.03)、SHG44(1.28±0.05)中miR-127-3p相对表达水平均低于人脑正常胶质细胞株HEB(3.64±0.26)(P<0.01); 转染后24、48、72 h 150组、100组和50组细胞吸光度值均低于对照组(P<0.05),并且随着miR-127-3p mimics转染水平增高,U251细胞吸光度值越低; miR-127-3p mimics转染组(39.3±4.6%)细胞早期凋亡率高于对照组(7.2±0.6%)(P<0.05); miR-127-3p mimics转染组(9.3±2.3%)细胞晚期凋亡率高于对照组(2.4±0.5%)(P<0.05); mimic转染组(0.119±0.008)U251细胞bcl-2蛋白表达水平低于对照组(0.556±0.039),mimic转染组(0.168±0.015)U251细胞bax蛋白表达水平高于对照组(0.086±0.006),mimic转染组(0.144±0.009)U251细胞Mcl-1蛋白表达水平低于对照组(0.426±0.028)(P均<0.05); 双荧光素酶报告基因实验显示,只有当MAPK4-WT-3' UTR与miR-127-3p mimic共同转染时荧光素酶活性被抑制,这提示miR-127-3p能与MAPK4直接结合,miR-127-3p mimic转染组(0.121±0.003)U251细胞MAPK4蛋白表达水平低于对照组(0.467±0.028)(P<0.05)。结论 miR-127-3p在神经胶质瘤患者脑脊液中呈低表达,上调miR-127-3p能抑制神经胶质瘤U251细胞增殖,促进其凋亡,其机制可能与调控Bcl凋亡相关基因及抑制靶基因MAPK4有关。     

RNAi沉默c-Met基因对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响

目的 探讨RNA干扰技术沉默c-Met基因表达对人脑胶质瘤U251细胞生长活力及体外侵袭能力的影响。方法 将设计好的c-Met基因干扰载体转染至U251细胞中,根据转染质粒不同分为空白对照组（不转染任何质粒）、空载体组（转染空载体）和干扰组（转染重组质粒）。采用四唑盐比色法（MTT）检测细胞的生长活力的变化;采用Transwell小室法检测细胞侵袭能力的变化。结果 MTT检测结果显示干扰组光密度值（0.156±0.164）显著低于空白对照组（0.21±0.146;P<0.05）和空质粒组（0.191±0.138;P<0.05）,而空质粒组和空白对照组无显著差异（P>0.05）。细胞体外侵袭能力检测结果显示,干扰组穿膜细胞数[（13.60±3.34）个]显著低于空白对照组[（32.90±6.49）个;P<0.05]和空质粒组[（23.10±2.77）个;P<0.05],而空质粒组和空白对照组无统计学差异（P>0.05）。结论 沉默c-Met基因表达能明显抑制U251细胞的生长活力及其侵袭能力。     

lncRNA MLK7-AS1通过抑制miR-375的表达促进胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭

目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）MLK7-AS1在人脑胶质瘤组织中表达及其对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭的影响。方法 选择2016~2017年手术切除的脑胶质瘤组织标本45例，2007版WHO分级Ⅰ级8例，Ⅱ级15例，Ⅲ级10例，Ⅳ级12例。另选择其中10例瘤旁正常脑组织作对照。体外培养U251细胞和人正常星形胶质细胞（NHA）。U251细胞根据转染质粒分成四组:转染miR-375 mimic组、转染si-MLK7-AS1组、同时转染miR-375 inhibitor和si-MLK7-AS1组以及只转染miR-375 inhibitor组。RT-qPCR检测MLK7-AS1和miR-375的表达水平；荧光素酶报告基因实验验证MLK7-AS1与miR-375之间的关系；CCK-8法检测U251细胞增殖活性，Transwell实验检测U251细胞侵袭能力。结果 高级别胶质瘤组织MLK7-AS1表达水平明显高于低级别胶质瘤组织（P<0.05），而后者明显高于瘤旁正常脑组织（P<0.05）；高级别胶质瘤组织miR-375表达水平明显低于低级别胶质瘤组织（P<0.05），而后者明显低于瘤旁正常脑组织（P<0.05）。U251细胞MLK7-AS1表达水平明显高于NHA（P<0.05），miR-375表达水平明显低于NHA（P<0.05）。序列分析显示MLK7-AS1和miR-375 存在特异性结合序列，荧光素酶报告基因实验表明U251细胞MLK7-AS1负调控miR-375表达。沉默MLK7-AS1表达通过上调miR-375表达明显抑制U251细胞增殖和侵袭（P<0.05）。结论 lncRN AMLK7-AS1可能通过调节miR-375的表达水平在人脑胶质瘤中发挥着促癌的作用     

人脑胶质瘤干细胞增殖和分化过程中NOTCH-1信号通路的调控

背景：研究发现NOTCH-1信号通路在神经干细胞或神经前体细胞的自我更新、增殖及分化中起重要作用。 目的：探讨NOTCH-1信号通路在人脑胶质瘤干细胞增殖和分化过程中的调控作用。 设计、时间及地点：开放性实验,于2005-01/2007-03在解放军第三军医大学新桥医院完成。 材料：人脑胶质瘤组织、正常成人脑组织由解放军第三军医大学新桥医院神经外科提供。U251胶质瘤细胞株由解放军第三军医大学新桥医院神经外科吕胜青副教授惠赠;CHG-5胶质瘤细胞株由解放军第三军医大学西南医院病理研究所卞修武教授、姚晓红博士惠赠。 方法：取人脑胶质瘤组织、正常成人脑组织、U251及CHG-5胶质瘤细胞株,采用免疫磁珠法分选获得CD133+脑胶质瘤干细胞,加入DMEM/F12无血清培养基进行增殖培养,形成细胞克隆后,加入含体积分数为10%胎牛血清的培养液,2 h后行抗CD133和抗巢蛋白免疫荧光双标染色。 主要观察指标：人脑胶质瘤干细胞的生长和鉴定,采用WST-8法、免疫组化实验、流式细胞仪、免疫荧光双标实验检测NOTCH-1信号通路蛋白的表达。 结果：在无血清培养基中,细胞呈悬浮生长,培养24~48 h可见单个细胞开始分裂生长,形成肿瘤球,将肿瘤球转入含胎牛血清的培养基后,4 h周边细胞伸出突起并逐渐分化,24 h后肿瘤球迁移出的细胞增多,形成单细胞层。肿瘤球能同时表达干细胞标志物CD133和巢蛋白,CD133+脑胶质瘤干细胞核浆比例达2/3~3/4,突起少,胞浆中线粒体等细胞器较少,核糖体丰富,未见胶质丝等分化结构,符合干细胞超微结构特点。NOTCH-1蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达明显强于正常成人脑组织（P < 0.01）,在CD133+ U251及CHG-5胶质瘤细胞中有很强的表达,在GFAP+和MAP2+ U251及CHG-5胶质瘤细胞中的表达强弱不等,在MBP+ U251及CHG-5胶质瘤细胞中呈弱表达或不表达。在脑胶质瘤干细胞增殖过程中能检测到较强的NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1,CBF-1,HES-1 mRNA及NOTCH-1,HES-1蛋白表达;而在细胞分化时NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1,CBF-1,HES-1 mRNA和HES-1蛋白表达逐渐减弱。 结论：NOTCH-1信号通路的关键蛋白分子NOTCH-1在人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中均有表达,而在正常成人脑组织中仅微弱表达。NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1和HES-1的表达强弱可能参与了胶质瘤干细胞增殖和分化的调控。