pcDNA3.1(+)-mIL-12在Lewis细胞中生物活性的探讨

目的:建立稳定表达小鼠IL-12(mIL-12)的小鼠Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)细胞系LLC/mIL-12,为进一步研究mIL-12的免疫调节机制及其抗肿瘤作用奠定基础。方法:构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-mIL-12,脂质体转染LLC细胞并测其表达,流式细胞仪(FCM)观察细胞周期和凋亡,G418筛选获得阳性克隆后大量培养并检测mIL-12活性。结果:pcDNA3.1(+)-mIL-12质粒构建正确并成功转导入LLC细胞,重组质粒在mRNA及蛋白质水平均高表达mIL-12,mIL-12使LLC细胞周期重新分布,并促进其凋亡。LLC/mIL-12细胞培养上清能明显引起刀豆蛋白A(ConA)激活的小鼠脾细胞增殖。结论:成功构建pcDNA3.1(+)-mIL-12真核表达质粒,建立具有mIL-12生物学活性的LLC细胞系。     

pcDNA3．1（＋）-mlL-12在Lewis细胞中生物活性的探讨

目的：建立稳定表达小鼠IL-12（mIL-12）的小鼠Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma，LLC）细胞系LLC／mIL-12．为进一步研究mIL-12的免疫调节机制及其抗肿瘤作用奠定基础。方法：构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-mIL-12，脂质体转染LLC细胞并测其表达。流式细胞仪（FCM）观察细胞周期和凋亡，G418筛选获得阳性克隆后大量培养并检测mIL-12活性。结果：pcDNA3．1（＋）-mIL-12质粒构建正确并成功转导入LLC细胞，重组质粒在mRNA及蛋白质水平均高表达mIL—12，mIL—12使LLC细胞周期重新分布，并促进其凋亡。LLC／mIL-12细胞培养上清能明显引起刀豆蛋白A（ConA）激活的小鼠脾细胞增殖。结论：成功构建pcDNA3．1（＋）-mIL-12真核表达质粒，建立具有mIL—12生物学活性的LLC细胞系。     

重组白介素-12治疗小鼠Lewis肺癌的实验研究

背景与目的:白介素-12(interleukin-12,IL-12)是具有抗瘤活性的细胞因子,本研究建立稳定表达小鼠IL-12(murineinterleukin-12,mIL-12)的小鼠Lewis肺癌(Lewislungcarcinoma,LLC)细胞系LLC/mIL-12,评估mIL-12重组质粒及LLC/mIL-12瘤苗治疗小鼠Lewis肺癌移植瘤的疗效。方法:脂质体转染LLC获得LLC/mIL-12瘤苗。于C57BL/6小鼠皮下接种LLC细胞2×106个,成瘤后将小鼠随机分成4组(n=10),第1、4、7天瘤内注射质粒或瘤苗,第14天处死小鼠,观察肿瘤生长曲线、脾细胞中CTL细胞和NK细胞活性以及肿瘤浸润淋巴细胞。结果:LLC/mIL-12瘤苗组和pcDNA3.1( )-mIL-12质粒组肿瘤体积显著缩小,mIL-12能增强NK细胞和CTL细胞活性,两者均以LLC/mIL-12治疗组更显著,LLC/mIL-12和pcDNA3.1( )-mIL-12治疗组有大量CD4 、CD8 淋巴细胞浸润。结论:mIL-12基因能增强NK细胞和CTL活性,LLC/mIL-12及pcDNA3.1( )-mIL-12均能产生抗瘤免疫反应,且前者作用更强。     

分泌型核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建分泌型核心蛋白聚糖(decorin)真核表达载体,并在肝癌细胞HepG2中表达,为研究核心蛋白聚糖的抗肿瘤作用奠定基础。方法利用特异性引物,应用PCR技术扩增核心蛋白聚糖全长基因cDNA片段,与pcDNA3.1载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染HepG2,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和westernblot检测其表达。结果获得了约1080bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型核心蛋白聚糖cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中。RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和westernblot方法可见转染组细胞decorin蛋白表达明显增高。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染decorin的HepG2细胞株。     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法:应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1(+)载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1(+)-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论:重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

VEGFR-3胞外区基因真核表达载体的构建-与鉴定

目的构建VEGFR-3胞外区基因真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,并在体外进行表达和鉴定。方法采用 RT-PCR技术,扩增C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA3.1-VR-3。经限制性酶切鉴定和DNA 序列测定结果证实后,将重组质粒经脂质体法转染COS-7细胞, Western blotting检测其蛋白表达。结果克隆了C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,Western blot 证实目的基因可在COS-7细胞中表达。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验奠定了基础。     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的：构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法：应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1（＋）-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果：重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1（＋）载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1（＋）-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1（＋）-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论：重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

C端带His标签重组MT1G真核表达载体构建及其在EC9706中的表达

目的:构建含MT1G cDNA的重组真核表达载体,并观察在人食管癌细胞EC9706中表达情况.方法:用PCR法从含MT1G基因cDNA质粒pACT2-MT1G中扩增获得目的基因片段,正向克隆入C端带Myc和6×His标签的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(-)中.经酶切及测序鉴定后,以脂质体法转染EC9706细胞,经G418加压筛选获得阳性单克隆细胞,用RT-PCR和蛋白质印迹法技术检测MT1G mRNA和蛋白的表达.结果:成功构建了真核表达载体pcDNA3 1/Myc-His(-)-MT1G,转染pcDNA3.1/Myc-His(-)-MT1G的EC9706细胞内有带His标签MT1G融合蛋白表达.结论:获得了人MT1G重组载体和稳定表达带His标签MT1G融合蛋白的EC9706细胞株,为进一步研究MT1G的功能奠定了基础.     

pcDNA3.1/DLC-1 重组质粒的构建及其在HT-29细胞中的表达

 目的 构建和表达DLC-1(deleted in liver cancer)基因重组质粒。 方法 用PCR法得到DLC-1基因片段,此基因片段带有Xba Ⅰ和BamH Ⅰ两个酶切位点,然后将此片段 和真核表达载体pcDNA3.1连接,转化大肠杆菌DH5a,利用脂质体介导将pcDNA3.1/DLC-1重组质 粒转染到结肠癌HT-29细胞中,再用RT-PCR法检测重组质粒的表达。 结果 重组质粒经Xba Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切和测序与DLC-1基因序列一致;利用脂质体介导将 pcDNA3.1/DLC-1重组质粒导入HT-29细胞,获得了DLC-1基因的表达。 结论 成功构建pcDNA3.1/DLC-1重组质粒并在HT-29细胞内表达。     

PEA-15真核表达载体的构建及表达

目的构建PEA-15真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15,并在人类食管癌细胞（EC-109）中表达。探讨PEA-15对EC．109细胞的影响。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测EC-109细胞中的PEA-15基因表达。构建重组真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至EC-109细胞中。采用RT—PCR、Westernblot法检测基因及蛋白表达。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长抑制率。结果RT—PCR显示PEA-15在EC-109细胞中表达。PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果表明真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15构建成功。转染后的细胞中PEA-15表达均增加（t值分别为4．078、5．269,均P〈0．05）。转染质粒72h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组降低[（7．12±0．86）％、（12．55±1．78）％,t=6．163,P〈0．05]。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．I-PEA-15,并在EC-109细胞中进行了表达;转染后对食管癌细胞生长有促进作用,其表达可能促进食管癌的发生。     

MRI of transgene expression: correlation to therapeutic gene expression

Magnetic resonance imaging (MRI) can provide high-resolution 3D maps of structural and functional information, yet its use of mapping in vivo gene expression has only recently been explored. A potential application for this technology is to noninvasively image transgene expression. The current study explores the latter using a nonregulatable internalizing engineered transferrin receptor (ETR) whose expression can be probed for with a superparamagnetic Tf-CLIO probe. Using an HSV-based amplicon vector system for transgene delivery, we demonstrate that: 1) ETR is a sensitive MR marker gene; 2) several transgenes can be efficiently expressed from a single amplicon; 3) expression of each transgene results in functional gene product; and 4) ETR gene expression correlates with expression of therapeutic genes when the latter are contained within the same amplicon. These data, taken together, suggest that MRI of ETR expression can serve as a surrogate for measuring therapeutic transgene expression.     

血液肿瘤基因表达和基因表达模式研究进展

基因表达失调与血液肿瘤的生物学特性、治疗反应和预后密切相关。近年迅速发展的转录组测序、单细胞转录组测序等技术为发现疾病诊疗相关的标志性基因和研究基因表达模式提供了强有力的工具。文章结合第62届美国血液学会(ASH)年会中的报道介绍相关研究进展。     

抑制CDC25A表达的siRNA真核表达载体的构建

目的 在哺乳动物细胞中构建并鉴定抑制CDC25A表达的siRNA真核表达载体.方法 根据CDC25A的基因序列,设计特异性的siRNA,将合成的siRNA 核酸片段退火形成双链后连接到经Bam HI和HindⅢ双酶切后的psilencer4.1真核表达载体,命名为psilencer4.1-CDC25A以及psilencer4.1-Control,并进行酶切及测序鉴定.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功地构建出抑制CDC25A表达的siRNA载体及其阴性对照载体.结论 成功构建和验证了siRNA真核表达载体,为下一步研究奠定了良好的基础.     

哺乳动物细胞CDK2系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）在哺乳动物细胞的表达载体,为研究CDK2的功能和修饰提供实验材料。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增CDK2编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK2片段分别亚克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;最后,将获得的表达载体PEGFP/CDK2转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK2表达分析。结果：RT-PCR扩增获得约900 bp的目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析,显示重组片段是人CDK2基因序列;CDK2片段分别亚克隆入上述4种载体后获得相应表达载体;运用构建的PEGFP/CDK2表达载体,在NIH3T3细胞中表达出CDK2蛋白。结论：成功构建了CDK2的哺乳动物细胞系列表达载体,并在NIH3T3细胞中成功表达目的蛋白。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

Nucleostemin基因荧光真核表达载体构建及表达特性

目的:构建Nucleostemin(NS)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法: 设计引物在肺癌细胞株(LTEP-a-2)中扩增NS全长cDNA片段,插入pMD-18T 质粒中得pMD-18T-NS载体,并测序;再将pMD-18T-NS质粒经酶切后导入真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP质粒中,构建pcDNA3.1(+)-GFP-NS载体,并检测其真核表达情况.结果: 经RT-PCR扩增得到1 650 bp的全长NS cDNA片段,酶切及测序后鉴定证明pMD-18T-NS构建成功.pcDNA3.1(+)-G-FP-NS载体转染COS-7细胞经蛋白印迹及激光共聚焦显微镜检测显示,该GFP-N-S融合基因在COS-7细胞中获得较好表达.转染后见该基因定位于核仁,细胞逐渐失去黏附贴壁的特性,细胞的增殖受阻;稳定表达(4～20周)后,细胞形态发生改变,体积增大,核增多,细胞成瘤细胞样改变.结论: 成功构建pcDNA3.1(+)-GF-P-NS真核表达载体,并在COS-7细胞中有效表达;NS基因在COS-7发生瘤样改变过程中发挥着重要作用,可能与肿瘤发生密切相关.