shRNA干扰卷曲蛋白-7基因对HepG2肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨抑制卷曲蛋白-7(FZD-7)受体基因对肝癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法实验分3组:空白组(Blank)、阴性对照组(sh NC)、FZD-7干扰组(sh FZD-7)。用sh NC、sh FZD-7转染Hep G2细胞,应用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖能力,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法观察细胞凋亡率的变化,Western blotting检测FZD-7、β-连环蛋白(β-catenin)、Pro-caspase-3、cleaved caspase-3、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、c IAP-1、c IAP-2、Bcl-2、Bcl-x L、Bax、Bad、β-肌动蛋白(β-actin)的表达。结果转染后96 h,sh FZD-7组Hep G2细胞吸光度值(0.97±0.10)较Blank组(1.49±0.06)和sh NC组(1.42±0.05)明显下降(P0.01);流式细胞仪检测细胞凋亡率显示sh FZD-7组(43.90±2.61)%较Blank组(14.12±1.39)%和sh NC组(16.82±1.26)%明显升高(P0.01);灰度分析显示sh FZD-7组cleaved caspase-3蛋白表达量较Blank组和sh NC组明显升高(P0.01);sh FZD-7组β-catenin、XIAP、c IAP-1、c IAP-2、Bcl-2、Bcl-x L蛋白表达量较Blank组和sh NC组明显降低(P0.01);sh FZD-7组Bcl-2或Bcl-x L与Bax蛋白表达量比值(Bcl-2/Bax或Bcl-x L/Bax)与Blank组和sh NC组比较明显降低(P0.05)。结论抑制FZD-7受体基因,可抑制Hep G2肝癌细胞株增殖活性并促进细胞凋亡。这一过程可能与下调凋亡抑制蛋白(IAPs),导致caspase-3的活化增加有关;凋亡相关蛋白Bcl-2家族在此过程中也扮演了重要角色。     

YAP调控Wnt信号通路影响肝癌细胞凋亡的研究

目的探讨Yes相关蛋白(Yes associated protein,YAP)对肝癌细胞凋亡的影响。方法 Western blotting方法检测人肝癌细胞Hu H-7、Hep G2、SNU-449和人正常肝细胞7702中YAP的表达水平。在肝癌细胞中转染YAP小干扰RNA1(YAP siRNA1组)和YAP小干扰RNA2(YAP siRNA2组),同时转染对照siRNA(siRNA-NC组),未转染组只加入转染试剂,培养48 h后,Western blotting检测细胞中YAP水平,筛选出干扰效率较高的YAP siRNA2继续研究。MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,激光扫描共聚焦显微镜法检测活性氧(ROS)水平,Western blotting检测细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、Wnt信号通路下游靶基因(C-myc)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)蛋白水平。结果人肝癌细胞Hu H-7、Hep G2、SNU-449中YAP表达水平均高于人正常肝细胞7702,且在Hep G2细胞中YAP的表达水平最高。YAP siRNA1、YAP siRNA2能够成功干扰肝癌细胞中YAP的表达水平,且YAP siRNA2的干扰效率最高。YAP siRNA2组细胞存活率和细胞中β-catenin、C-myc水平均低于未转染组,凋亡率和细胞中Cleaved Caspase-3、ROS水平均高于未转染组(P0.01)。结论干扰YAP表达后能够促进肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞增殖,Wnt信号通路是其可能的作用机制之一。     

RNA干扰Gal-3表达抑制胰腺癌细胞增殖并促进其凋亡

目的探讨RNA干扰半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)表达对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制.方法将培养的Panc-1细胞随机分为对照组(未处理)、NC组(转染control-si RNA)和Gal-3干扰组(转染Gal-3-si RNA),以小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)技术干扰Panc-1细胞中Gal-3表达后,RT-PCR和Western blot检测干扰效果,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中ki67、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)抗体和β-连环蛋白(β-catenin)蛋白表达.结果与对照组相比,NC组中Gal-3 m RNA(0.99±0.08vs 1.01±0.06)和蛋白(0.36±0.03 vs 0.34±0.05)的表达差异不显著(P0.05),而Gal-3干扰组中Gal-3m RNA(0.38±0.02 vs 1.01±0.06)和蛋白(0.10±0.01vs 0.34±0.05)的表达均显著降低(P0.05);Gal-3干扰组细胞增殖能力减弱(24 h:0.55±0.03 vs 0.71±0.05;48 h:0.76±0.05 vs 0.97±0.06;72 h:1.08±0.06 vs1.32±0.09),G0/G1期细胞百分比升高(79.48±1.32 vs71.52±1.15),S期(14.26±1.08 vs 18.24±1.06)和G2/M期(6.21±0.78 vs 10.19±1.52)降低,凋亡能力增强(13.26±2.28 vs 5.82±0.35),与对照组相比,差异均有统计学意义(P0.05);与对照组相比,Gal-3干扰组中ki67(0.24±0.02 vs 0.96±0.07)、CyclinD 1(0.26±0.03vs 0.88±0.09)和β-catenin(0.42±0.05 vs 0.87±0.05)蛋白的表达水平均明显降低,而Cleaved Caspase-3(0.70±0.06 vs 0.32±0.03)蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);NC组与对照组间各指标差异均无统计学意义(P0.05).结论 RNA干扰Panc-1细胞中Gal-3表达,可抑制细胞增殖并促进细胞凋亡,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关.     

siRNA沉默Ran基因对结肠癌细胞株凋亡和Caspase-3、PARP表达的影响

背景:结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一。本课题组前期研究发现结肠癌特异性抗原类硫氧还蛋白-2(Txl-2)的亚型之一Txl-2b可与Ras相关核蛋白(Ran)相互作用,但Ran在结肠癌发病过程中的作用和机制鲜有报道。目的:以RNA干扰技术靶向沉默结肠癌细胞株Ran基因,观察该方法对细胞凋亡和半胱天冬酶-3(caspase-3)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)表达的影响。方法:设置si-1、si-2、si-3以及阴性对照(NC)组,分别将终浓度为20、40、60 nmol/L的Ran小干扰RNA(siRNA)-1、siRNA-2、siRNA-3以及NC siRNA转染结肠癌细胞株HCT116、DLD-1。采用蛋白质印迹法检测siRNA干扰效率以及caspase-3、PARP表达的变化;采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:20 nmol/L siRNA-1、siRNA-2抑制Ran表达的效果最佳。si-1组HCT116、DLD-1细胞的早期凋亡率较NC组显著增加(19.37%±7.57%对4.83%±1.72%;16.53%±3.38%对6.27%±3.13%;P均0.05)。si-1组、si-2组HCT116、DLD-1细胞的晚期凋亡率较NC组显著增加(15.97%±3.31%、16.33%±5.40%对6.40%±1.05%;22.93%±1.57%、11.50%±0.70%对6.20%±0.98%;P均0.05)。si-1组、si-2组DLD-1细胞与NC组相比,被切割的caspase-3(活性形式)和被切割的PARP(非活性形式)表达水平显著升高。结论:沉默Ran基因能明显促进结肠癌细胞凋亡,其机制与调控caspase-3、PARP表达有关。     

丁酸钠诱导COLO205结肠癌细胞凋亡及其对caspase-3的调控

目的: 观察丁酸钠对COLO205结肠癌细胞株caspase-3的调控, 并探讨其诱导COLO205细胞株凋亡的机制.方法: 1、2、4 mmol/L丁酸钠与结肠癌细胞共同培养48 h;MTT法测定细胞活性;免疫组织化学法检测细胞中caspase-3的蛋白表达;流式细胞仪检测细胞的凋亡率.结果: 与阴性对照组比较, 1、2、4 mmol/L丁酸钠组细胞活性下降(0.47±0.09, 0.40±0.03,0.37±0.02 vs 0.55±0.09, P<0.05或0.01);丁酸能显著促进caspase-3蛋白的阳性表达(31.9±1.15, 40.6±1.04, 51.7±1.17 vs 29.4±1.02,P<0.05或0.01), 增加COLO205细胞的凋亡率(8.27%±0.42%, 15.1%±0.72%, 21.6%±0.95% vs 7.0%±0.33%, P<0.05或0.01).结论: 丁酸钠能通过上调caspase-3基因的表达并诱导COLO205细胞凋亡.     

针对caspase-3基因的RNA抑制对缺血再灌注神经细胞的保护作用

目的探讨针对caspase-3基因的RNA抑制对缺血再灌注(I/R)神经细胞凋亡的影响,为I/R神经细胞基因治疗的可行性提供依据。方法 NGF诱导PC12细胞为类神经细胞。细胞随机分为对照组、模型组、GFPsiRNA组;caspase-3siRNA组。于制作模型前24h进行转染。于造模后对caspase-3及细胞凋亡率等指标进行检测。结果 (1)凋亡率:模型组细胞(48.30±12.15)明显高于对照组(5.00±1.08),差异有显著性(P0.01);caspase-3siRNA组(7.04±2.00)明显低于模型组(P0.01)。(2)Caspase-3阳性率:模型组模型组的caspase-3阳性率〔(36.55±8.72)%〕明显高于对照组〔(10.25±2.50)%〕,差异有统计学意义(P0.01);caspase-3siRNA组caspase-3阳性率〔(12.25±3.25)%〕明显低于模型组,差异有统计学意义(P0.01)。结论针对caspase-3的siRNA能有效地抑制细胞凋亡。对缺血再灌注神经细胞损伤有一定的保护作用。     

PDECGF-siRNA诱导膀胱癌细胞凋亡机制的探讨

目的 探讨RNA干扰技术沉默血小板源性内皮生长因子基因(platelet-derived endothelial cell growth factor, PDECGF)表达诱导人膀胱癌细胞凋亡的机制.方法 针对人PDECGF mRNA序列设计合成编码干扰RNA (siRNA) 的DNA模板, siRNA;构建含RNA聚合酶启动子Ⅲ转录载体pRNAT-U6/Neo并能形成发夹结构小干扰RNA(siRNA)的psiPDECGF质粒;用其转染人膀胱癌T24细胞株,采用RT-PCR、Western 印迹法观察转染前后PDECGF基因及相关基因表达变化,采用凋亡DNA琼脂糖凝胶电泳及吖啶橙/溴化乙啶染色法观察细胞凋亡.结果 显示PDECGF siRNA对膀胱癌T24细胞中PDECGF基因表达产生明显抑制作用;转染psiPDECGF-2细胞组PDECGF mRNA水平明显降低,上述重组质粒可诱导T24细胞凋亡,同时caspase-3、p53蛋白水平明显增高.结论 证实psiPDECGF-2可抑制PDECGF在T24细胞的表达,诱导肿瘤细胞凋亡.其机制与caspase-3、p53蛋白水平表达增高有关.     

VEGF基因表达抑制对胃腺癌细胞SGC-7901增殖的影响

目的:研究siRNA(small interfering RNA)对人胃腺癌细胞SGC-7901的VEGF基因表达的影响．方法:选择血管内皮生长因子(VEGF)基因为靶基因,设计两组针对VEGF mRNA的小干扰RNA,合成DNA寡核苷酸链,体外转录合成siRNA．以人胃腺癌细胞系SGC-7901为靶细胞,应用脂质体转染的方法,将siRNA导入细胞．采用Hoechst33258染色观察siRNA作用于SGC-7901细胞中出现凋亡小体的情况．流式细胞仪检测细胞周期的改变,RT-PCR法比较转染前后VEGF mRNA表达水平的变化, ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化．结果:两组siRNA转染后均能有效地抑制 SGC-7901细胞的生长,诱导细胞凋亡产生凋亡小体．siRNA作用于SGC-7901细胞．其细胞周期均发生了明显的变化,主要表现为G0／G1 期细胞增多,S期细胞减少,并使细胞周期阻滞于G0／G1期(siRNA1组,siRNA2组G0／G1期VS 对照组G0／G1期:75．04％,76．52％ vs 58．37％, P<0．01;siRNA1组,siRNA2组S期vs对照组S 期:17．82％,16．73％ vs 39．52％,P<0．01),而其他组则无明显变化．VEGF mRNA的表达量大幅度减少(siRNA1组,siRNA2组vs对照组: 0．638±0．078,0．656±0．085 vs 0．941±0．046, P<0．01),相对应的VEGF蛋白水平也显著降低(164．7±22．7,166．3±26．6 vs 414．0±61．5, P<0．01),而其他组siRNA转染后则无上述作用．结论:应用靶向VEGF基因RNA干扰技术可以有效抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖．     

siRNA沉默Livin基因对胃癌细胞生长、凋亡的影响

目的:观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默Livin基因在胃癌BGC-823细胞中的表达, 并探讨Livin基因对胃癌细胞生长、凋亡的影响.方法:自行设计两条针对Livin基因的siRNA:Livin-sh-1和Livin-sh-2, 以此构建相应的表达载体并分别转染至对数生长期胃癌BGC-823细胞, 经G418筛选后分别采用半定量RTPCR检测不同siRNA实验分组细胞BGC-823mRNA水平变化, 四氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖、流式细胞仪检测胃癌细胞的凋亡.结果:siRNA对照组与空siRNA载体组Livinα/β mRNA表达差别无显著性; 但转染siRNA组Livin α/β mRNA表达显著低于空白对照组和空siRNA载体组(Livin α:0.11±0.07 vs 0.37±0.10, 0.34±0.08; Livin β:0.13±0.04 vs 0.43±0.09, 0.45±0.11, 均P<0.05). 空白对照组与空siRNA载体组相比, 24、48、96 h和1 wk时细胞生长未受影响; 而siRNA组在转染后24 h和48 h细胞生长未受影响, 但在96 h和1 wk时则被明显抑制( P<0.01). 转染siRNA组的细胞的凋亡率与空白对照组和转染空siRNA载体组相比显著增加(14.85%±1.35% vs 4.51%±0.36%, 6.13%±0.71%, 均P<0.05).结论:siRNA沉默Livin基因能抑制胃癌细胞的生长, 促进胃癌细胞的凋亡, Livin基因有可能成为胃癌治疗的新靶点.     

SiRNA沉默livin基因表达促进胃癌细胞凋亡

目的:研究livin特异性小分子干扰RNA (siRNA)沉默胃癌SGC-7901细livin基因及对促胃癌细胞凋亡的影响。方法:设计针对人源livin基因的两条SiRNA:si-livin1和si-livin2,分别转染至对数生长期的胃癌SGC-7901细胞:逆转录酶链式反应(RT- PCR)检测转染前后胃癌SGC-7901细胞livin基因表达的变化,MTT法检测转染前后该细胞对5-FU、顺铂的半数抑制浓度(IC50)的变化以及检测转染前后细胞增殖能力的变化,PI染色后流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡的变化。结果:livin特异性siRNA转染胃癌SGC-7901细胞48h后,si-livin1组livinαmRNA(灰度值表示)表达较空白对照组和阴性对照组显著减少(livinα:0.167±0.013 vs 0.403±0.036,0.389±0.053;livinβ:0.181±0.028 vs 0.413±0.041,0.404±0.029,均尸<0.01),而si-livin2组livin mRNA表达相比于空白对照组和阴性对照无显著差异;转染siRNA后,si-livin1组胃癌细胞生长缓慢,生长曲线较对照组平缓;si-livin1组细胞对5-FU和顺铂半数抑制浓度IC50较空白对照组和阴性对照组显著降低(5-FU:34.07±2.98 vs 74.39±4.91,69.85±4.57;顺铂:4.56±0.35 vs 9.07±0.44,7.96±0.64,均P<0.01);转染siRNA后,si-livin1组胃癌细胞自发凋亡率较空白对照组和阴性对照组增加(11.07±1.36 vs 3.54±2.89,6.72±1.77,P<0.01,P<0.05).5-FU和顺铂作用后,si-livin1组胃癌细胞凋亡率较空白对照组和阴性对照组显著增加(5-FU:34.90±1.76 vs 11.54±O.83,13.54±2.55;顺铂:48.14±2.70 vs 14.51±0.35,15.71±0_34,均P<0.01).结论:RNA干扰可有效沉,livin基因表达从而抑制胃癌SGC-7901细胞生长及增加该细胞凋亡敏感性,livin可能成为胃癌凋亡治疗途径的一个分子靶点。     

针对caspase-3基因的RNA抑制对帕金森病细胞的抗凋亡作用

目的 探讨针对caspase-3基因的 RNA抑制对帕金森病细胞的抗凋亡作用.方法 NGF诱导PC12细胞为类神经细胞.细胞随机分为对照组、模型组、GFP siRNA组、caspase-3 siRNA组.对照组用完全培养液培养,其他3组细胞用6-羟基多巴胺制作帕金森病细胞模型.于制作模型前24 h进行转染.造模后对caspase-3及细胞凋亡率等指标进行检测.结果 (1)凋亡率:模型组细胞凋亡率[(65.36±10.10)%]明显高于对照组[(5.00±1.00)%],有显著性差异(P<0.01);caspase-3 siRNA组[(19.00±4.08)%]明显低于模型组(P<0.01).(2)caspase-3阳性率:模型组的caspase-3阳性率[(30.15±7.02)%]明显高于对照组[(8.20±2.45)%],差异有统计学意义(P<0.01);caspase-3 siRNA 组caspase-3阳性率[(12.00±2.90)%]明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01).结论 针对caspase-3的 siRNA能有效地抑制帕金森病细胞凋亡,对6-羟基多巴胺毒性作用下的神经细胞损伤有一定的保护作用.     

RNA干扰阻断cyclin D1表达抑制结肠癌细胞增殖

目的:使用RNA干扰技术阻断人结肠癌细胞cyclin D1的表达,检测其对细胞生长增殖的影响和机制.方法:将人结肠癌细胞株HT-29分成3组,antisense组(转染反义链组)、sense组(转染正义链组)和对照组.免疫沉淀和蛋白质印迹法观察cyclin D1 siRNA对细胞cyclin D1蛋白质表达的影响,并对蛋白质电泳图像进行分析,MTT比色法绘制细胞生长曲线,~3H-TdR技术和流式细胞技术观测细胞周期变化结果:反义siRNA有效抑制了cyclin D1蛋白质表达,MTT实验显示,转染反义siRNA的细胞,生长代谢减慢,与对照组细胞差异显著(P<0.01).而antisense组细胞24 h的~3H-TdR渗入量,G_0/G_1期和S期细胞较对照组和sense组明显减少(~3H-TdR:1181.8±117.97 vs 1798.4±55.36,1851.4±83.46:P<0.01;G_0/G_1期:79.31% vs 60.87%.59.14%:S期:13.67% vs 26.42%,27.93%:P<0.01).结论:RNA干扰技术能有效减弱cyclin D1蛋白质表达,使细胞周期受阻,并抑制结肠癌细胞的生长增殖.     

Stathmin对肝癌细胞HCCLM3增殖及其肿瘤相关基因表达的影响

目的 探讨人stathmin基因在肝癌发生、发展过程中的作用及其机制.方法 化学合成stathmin序列特异性小干扰RNA,用脂质体LipofectamineTM2000转染人肝癌细胞株HCCLM3细胞.采用RT-PCR和Western blot技术检测stathmin的RNA干扰效率;用细胞计数试剂检测干扰细胞的生长增殖情况;用膜联蛋白V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测细胞凋亡;并用荧光定量PCR检测肿瘤增殖凋亡的相关基因.均数两两比较用配对t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析.结果 RNA干扰HCCLM3细胞后,stathmin的表达被显著抑制(P＜0.05),抑制率达90%;在RNA干扰24、48 h和72 h时,HCCLM3细胞的增殖抑制率分别为13.04%±0.10%、28.10%±0.41%和37.36%±2.1 5%(F=4.21,P＜0.05); RNA干扰后,细胞凋亡比例从9.20%±0.64%上升至25.11%±1.62%(F=44.67,P＜0.01);且RNA干扰组细胞癌基因c-myc、c-fos和增殖相关基因ki-67的mRNA表达水平明显下降,促凋亡基因caspase-3、bax和p53的mRNA表达水平升高(P值均＜0.05).结论 stathmin可能通过调节肿瘤增殖相关基因的表达水平来促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,参与肝癌的发生和发展进程.     

siRNA对脂多糖诱导下HepG2细胞caspase-8基因的干扰及对凋亡的影响

目的:研究针对人caspase-8基因mRNA的siRNA(small interfering RNA)表达载体,观察其转染人肝癌细胞HepG2后,细胞caspase-8基因表达的变化,及其对细胞凋亡的影响。方法:采用针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达质粒,由脂质体介导瞬时转染HepG2细胞株,并采用脂多糖(LPS)诱导HepG2细胞凋亡,RT-PCR、Westernblot测定caspase-8表达。结果:针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达质粒能抑制caspase-8mRNA和蛋白表达;转染后HepG2细胞体外生长明显受到抑制。结论:siRNA表达质粒能有效地抑制HepG2细胞中caspase-8的表达,抑制细胞凋亡并促进生长。为进一步探究肝衰竭基因治疗提供了实验依据。     

siRNA干扰galectin-3表达对人胃癌细胞株SGC-7901增殖、凋亡和化疗敏感性的影响

Galectin-3属于半乳凝素家族成员,参与细胞生长和凋亡、细胞黏附、新生血管形成、肿瘤浸润和转移等多种生理和病理过程,在多种恶性肿瘤细胞中呈高表达。目的:研究siRNA干扰galectin-3表达对人胃癌细胞株SGC-7901增殖、凋亡和化疗敏感性的影响。方法:合成靶向galectin-3的siRNA并转染SGC-7901细胞,以real time PCR和蛋白质印迹法检测干扰效果。CCK-8实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:Galectin-3siRNA转染24 h后转染效率为83.8%,转染后SGC-7901细胞的galectin-3表达显著受抑,mRNA和蛋白表达量分别较空白对照组降低87.8%和90.4%(P0.01)。转染后24 h、48 h和72 h,galectin-3 siRNA组SGC-7901细胞增殖抑制率分别为15.57%±1.45%、32.90%±0.76%和57.35%±1.05%,转染后72 h该组细胞凋亡率为46.17%±2.39%,均显著高于同时间点空白对照组、空脂质体组和阴性对照siRNA组(P0.01)。Galectin-3 siRNA组SGC-7901细胞由化疗药物奥沙利铂诱导的增殖抑制亦较其余三组显著增加(P0.01)。结论:以siRNA干扰galectin-3表达后,SGC-7901细胞增殖减少、凋亡增加,对化疗药物的敏感性增强,表明galectin-3有望成为胃癌基因治疗的有效靶点。     

RNA干扰DNA甲基转移酶1对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察以DNA甲基转移酶1(DNA methy transferas 1,DNMT1)基因为靶基因的RNA干扰对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计、合成针对DNMT1基因的siRNA和阴性对照siRNA(N-siRNA).实验分为空白对照组、脂质体组(仅予脂质体)、N-siRNA组(转染30 nmol N-siRNA)、siRNA组(转染30 nmol siRNA).siRNA转染48 h后,实时PCR法检测DNMT1 mRNA水平;WST-8法检测细胞增殖;流式细胞技术检测细胞凋亡.结果 siRNA组DNMT1 mRNA的抑制率为(86.0±4.3)%,明显高于N-siRNA组的(40.1±2.2)%和空白对照组的0(P＜0.01);细胞存活率为(47.6±5.6)%,明显低于N-siRNA组的(68.1±4.1)%和空白对照组的100%(P＜0.01);细胞凋亡率为(14.94±2.89)%,明显高于空白对照组的(7.51±1.12)%、脂质体组的(7.06±0.39)%、N-siRNA组的(8.84±1.44)%(均P＜0.01).结论 siRNA能特异、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988细胞DNMT1mRNA的表达,同时抑制细胞增殖、促进细胞凋亡.     

转录因子c-Jun对人血管平滑肌细胞中线粒体融合基因2表达调控作用的实验研究

目的:探讨转录因子c-Jun对培养的人血管平滑肌细胞(hVSMCs)中线粒体融合基因2(Mfn2)表达的调控作用。方法:①siRNA干扰实验:设正常对照组、阴性siRNA对照组和siRNA干扰组,用c-Jun siRNA转染hVSMCs,培养26 h后提取细胞mRNA和总蛋白。通过RT-PCR和Western blot检测Mfn2基因和蛋白质的表达。②过表达实验:设正常对照组、阴性病毒对照组和慢病毒过表达组。用慢病毒载体感染细胞,培养96 h后提取细胞mRNA和总蛋白。通过RT-PCR和Western blot检测Mfn2基因和蛋白质的表达。结果:siRNA敲减c-Jun后,与阴性siRNA对照和正常对照组相比,siRNA干扰组Mfn2 mRNA明显降低[(0.671±0.061)vs.(1.110±0.080),P0.01;(0.671±0.061)vs.(1.000±0),P0.01],蛋白质的表达也显著降低[(0.571±0.049)vs.(1.042±0.039),P0.01;(0.571±0.049)vs.(1.000±0),P0.01],hVSMCs的数量明显增加。相反,用慢病毒表达载体过表达c-Jun后,与阴性病毒对照和正常对照组相比,慢病毒过表达组Mfn2 mRNA明显增加[(1.414±0.063)vs.(1.056±0.020),P0.01;(1.414±0.063)vs.(1.000±0),P0.01],蛋白质的表达也显著增加[(1.449±0.044)vs.(1.089±0.026),P0.01;(1.449±0.044)vs.(1.000±0),P0.01],hVSMCs的数量则明显下降。结论:c-Jun能显著正调控Mfn2的表达,并影响hVSMCs的增殖。因此,它可能是Mfn2表达的转录调控因子。     

HO-1活性改变对肝癌细胞周期调控因子CKS1和Cyclin D的影响

目的探讨血红素加氧酶(HO)-1活性改变对肝癌细胞株Hep G2细胞周期蛋白(Cyclin)依赖性激酶调节亚基(CKS)1和Cyclin D的影响。方法采用靶向抑制HO-1的小分子RNA(siRNA)沉默细胞癌Hep G2细胞HO-1基因的表达,应用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定Hep G2细胞的增殖情况,应用RT-PCR法测定HO-1、CKS1和Cyclin D mRNA,应用Western印迹检测HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白表达水平。结果 MTT实验结果显示,HO-1 siRNA转染组细胞转染后24 h和48 h的吸光度较空白对照组显著降低(P0.01),HO-1 siRNA转染组细胞转染后48 h的HO-1、CKS1和Cyclin D mRNA水平较空白对照组显著降低(P0.01),HO-1 siRNA转染组细胞转染后48 h的HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白水平较空白对照组显著降低(P0.01)。结论 HO-1的活性降低可抑制肝癌Hep G2细胞的增殖,其调控作用可能通过降低Hep G2细胞CKS1和Cyclin D表达而实现。     

Polo样激酶1小片段干扰RNA对肝癌细胞株HepG2的影响

目的: 联合RNA干扰技术探讨Polo样激酶1(PLK1)在肝癌的发生发展中的作用及对临床治疗的指导作用.方法: 化学合成针对P L K1的小片段干扰RNA(PLK1-s iRNA), 转染至肝癌细胞株HepG2中, 利用实时定量PCR、台盼蓝活性细胞计数和流式细胞术对PLK1的基因表达、细胞增殖、细胞周期和凋亡的检测.结果: 转染PLK1-siRNA后, 肝癌细胞中PLK1mRNA表达明显下降(P<0.01), 表达量相当于空白组的49.7%±3.6%;细胞增殖活性从转染24 h后明显下降;细胞分裂周期发生变化, S期比例下降, 阻滞在G2/M期的细胞比例上升, 于48、72 h阻滞在G2/M期的细胞比例和细胞凋亡率与空白组相比均有显著增加(均P<0.05).结论: PLK1在肝癌的发生发展中起着重要作用, 其siRNA能特异性抑制肝癌细胞中PLK1基因的表达, 抑制细胞增殖, 促进细胞凋亡, 针对PLK1基因的RNA干扰有望用于肿瘤的基因治疗.