深低温保存的角膜缘组织CD40的表达以及体外培养增生活性的研究

目的探讨深低温保存的角膜缘组织CD40的表达情况以及培养后增生活性的变化。方法取角膜移植术后角膜缘组织20例（20眼）,其中10例新鲜组织直接进行体外培养,另10例经深低温冷冻保存后再进行体外培养,对比观察两组细胞生长情况,并用免疫组化方法检测CD40在二者的表达。结果新鲜角膜缘组织块接种后3d可见细胞贴壁生长,培养至6d时细胞基本形成单层;深低温保存角膜缘组织块接种后在7d可见细胞贴壁生长,培养至10d时细胞基本形成单层。CD40在两组角膜缘上皮基底细胞层均有着色,为棕褐色,在深低温保存角膜缘组织表达明显减弱。结论深低温保存的角膜缘组织具有良好的增生活性,利用深低温保存的角膜缘组织进行角膜缘干细胞移植可以降低移植排斥率。     

角膜缘组织定位培养和冷冻后培养的实验研究

目的验证角膜缘干细胞的组织学定位,探讨低温冷冻保存对其增殖活性的影响。方法取新鲜角膜缘上皮组织和相应部位浅层巩膜组织各10块进行体外细胞培养,对比观察细胞生长情况。取冷冻保存的角膜缘上皮组织14例,观察体外培养后细胞生长情况。通过免疫组化方法检测冷冻保存的角膜缘上皮细胞的增殖活性和培养后单层细胞K3角蛋白的表达。结果10例新鲜角膜缘上皮组织培养后,7例有上皮细胞生长,1周形成细胞单层;10例浅层巩膜组织培养后未见细胞生长。14例冷冻角膜缘上皮组织培养后,4例有上皮细胞生长,9d形成细胞单层。5例冷冻角巩膜环组织冰冻切片中,3例可见角膜缘上皮基底细胞PCNA表达阳性。培养细胞对K3角蛋白特异性的AE-5单克隆抗体免疫反应阳性。结论角膜缘干细胞定位于角膜缘上皮基底部,低温冷冻保存的角膜缘干细胞组织可以保持增殖活性,体外培养后生长分化成为角膜上皮。     

培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究

目的探讨深低温保存角膜缘上皮细胞的可行性和效果。方法将兔角膜缘组织培养出的细胞,分别用两组冷冻保护液冻存,0.5、1、2个月后分批取出。将未冷冻的细胞和不同冻存时间、不同冻存保护液的冷冻复苏后细胞传代培养,采用免疫组化、电镜鉴定培养后细胞的性质。通过倒置显微镜、电镜、MTT比色法来比较传代培养的角膜缘上皮细胞深低温保存前后的形态结构和生物学活性。结果AE1和传代细胞鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体染色呈阳性反应,AE5单克隆抗体染色偶见阳性反应;冻存后的传代细胞贴壁、生长均滞后,而且电镜检查均有不同程度细胞水肿,再培养7d后形态结构均恢复正常;MTT法检测复苏当天冻存后的细胞比未冻存的细胞增殖活性低,差异显著(P<0.05,但培养5d后无显著差异(P>0.05),甘油组和DMSO组间有显著性差异(P<0.05),不同冻存时间的各冻存组测得值无显著差异(P>0.05)。结论冻存的角膜缘上皮细胞传代培养仍保持上皮细胞特性并含有干细胞;DMSO保护液比甘油液低温保存效果好;角膜缘上皮细胞经阶段降温后深低温保存简单可行,选择适当的冷冻保护剂冻存后的细胞再培养,其细胞活性和结构与原代相似。     

深低温保存角膜缘干细胞自体移植实验研究

目的:评价深低温冷冻保存兔眼角膜缘干细胞活性及自体移植治疗角膜干细胞缺乏眼表疾病的疗效。方法:12只新西兰白兔用刀片制备带2mm周边角膜和2mm球结膜的环行浅层角膜缘植片,去除余下的角膜上皮,制成角膜干细胞缺乏眼表疾病模型。角膜缘植片通过程序降温仪程序降温后-196℃深低温保存。30天和60天后作自体移植行兔眼眼表重建术。结果:角膜干细胞缺乏导致角膜上皮愈合延迟,7眼在术后22～26天愈合,平均24±1天,4眼复发性上皮糜烂;基质混浊水肿;角膜血管化,平均5±1天出现新生血管。深低温保存角膜缘干细胞自体移植能促进角膜上皮愈合,平均10±2天愈合,基质混浊逐渐吸收,新生血管消退、变细,2眼消失。结论:深低温保存法能保存角膜缘干细胞活性;能随时按需为临床提供活性角膜缘材料;为临床深低温保存角膜缘干细胞移植治疗眼表疾病提供了实验依据。眼科学报1998;14:224～226。     

培养角膜缘上皮细胞深低温保存后异体移植实验研究

目的深低温保存培养的角膜缘上皮细胞,复苏后进行异体移植实验,为临床应用提供实验依据。方法将浅层角膜基质载体上培养的角膜缘上皮细胞深低温保存,同时制作兔角膜缘干细胞损伤模型,分别用新鲜培养的角膜缘上皮细胞和冷冻复苏后培养的细胞及角膜基质进行异体移植实验。结果角膜缘上皮细胞能成功地培养于载体上,将培养细胞保存于-196℃的液氮罐中二月,可见深低温保存前后细胞的形态结构及生物学特性无显著差异。异体移植实验显示：新鲜培养的细胞及深低温保存后的细胞异体移植后,模型兔角膜表面逐渐正常上皮化,而角膜基质组异体移植后,角膜表面仍结膜化并可见大量新生血管生长,各项检测结果与培养细胞组相比差异显著（P〈0．05）。结论以浅层角膜基质为载体培养的角膜缘上皮细胞深低温保存后仍具有上皮细胞特性并具有高增殖能力,可用以进行异体移植治疗角膜缘干细胞缺陷的角膜病。     

超低温(-196 ℃)保存角膜缘上皮细胞的生物活性研究

目的探讨不同的低温冷冻条件对角膜缘上皮细胞生物活性的影响。方法采用不同浓度梯度的二甲基亚砜和不同的降温速率保存兔角膜缘上皮组织;以台盼蓝染色方法计数角膜缘表层上皮细胞的存活率;通过体外细胞培养方法观察低温保存的角膜缘上皮细胞生长情况,并采用若丹明B染色法对原代细胞的增殖能力进行定量测定;将低温保存带有角膜缘的角膜进行器官培养,采用SABC免疫组织化学染色法检测角膜缘上皮细胞的PCNA表达。结果二甲基亚砜浓度梯度对低温保存的角膜缘表层上皮细胞存活率有显著影响,程序降温的效果明显优于非程序降温。体外细胞培养显示,二甲基亚砜浓度梯度和降温方法对角膜缘上皮细胞增殖能力无显著性影响(P>0.05);血清培养组优于无血清培养组(P<0.05,P<0.01)。器官培养1周时,低温保存的角膜缘上皮细胞核中均可见PCNA表达,染色阳性细胞主要在基底细胞层。结论角膜缘干细胞具有较强血清依赖性和低温耐受性,提示超低温保存角膜缘上皮具有可行性。     

深低温保存同种异体角膜缘组织片羊膜移植治疗重度眼表疾病

目的应用以羊膜为载体的深低温保存的角膜缘组织片同种异体移植术治疗重度眼表疾病.方法 19例19眼重度眼表疾病患者采用羊膜移植联合深低温保存的角膜缘组织片同种异体移植,2例术后半年行穿透性角膜移植术,随访观察术后疗效.结果 14例平均随访超过一年,眼表结构恢复正常,整个角膜上皮未见结膜杯状细胞,保存了眼球,视力均有不同程度的提高,其中1例植片脱落,4例发生角膜自溶的免疫排斥反应.结论羊膜移植联合深低温保存的角膜缘组织片同种异体移植术对于重度眼表疾病患者能快速、稳定地促进角膜表面重新上皮化,是一项可采纳的技术.     

新鲜羊膜移植对碱烧伤大鼠角膜缘干细胞增殖效应的影响

目的：观察新鲜羊膜移植对碱烧伤大鼠模型角膜缘干细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达的影响。

方法：SD大鼠40只40眼制作眼碱烧伤模型; 随机选取20只20眼行新鲜羊膜移植为实验组,对照组为不处理的烧伤模型眼。于术后1,2,3,4wk取角膜缘组织,采用免疫组化技术观察PCNA在角膜缘干细胞的表达情况。

结果：PCNA在实验组和对照组的角膜缘干细胞中均有表达,位于角膜缘上皮细胞基底层的细胞核内,但羊膜移植组显著高于对照组,两者比较有统计学意义(P<0.05); 羊膜移植术后1,2,3,4wk时PCNA蛋白在角膜缘干细胞的表达不一致,呈线性趋势,1wk达到高峰,以后逐渐降低。

结论：眼碱烧伤后行羊膜移植术可促进角膜缘干细胞的增殖表达,利于角膜上皮的修复。     

角膜缘库的建立及在眼表重建术中的应用

目的研究改良后的甘油长期冷冻保存法保存的角膜缘组织的超微结构及临床应用效果。方法取角膜移植术后的新鲜角膜缘组织及严重眼球裂伤后健康的角膜缘组织18例（18眼）以改良甘油长期冷冻保存法进行保存,保存时间3～24个月,其中12例应用于临床板层角膜缘移植术,6例保存时间大于半年的角膜缘组织进行光镜及电镜检查。结果11例（12眼）手术均顺利,术后随访6～24个月,无植片融解脱落,10眼植片透明,1眼植片呈半透明状,1眼植片部分血管化。光镜及电镜检查显示角膜组织的显微结构及超微结构得到良好保存。结论改良甘油长期冷冻保存的角膜缘组织具有一定活性,应用于角膜缘移植成功率高,能够满足临床应急需要。     

深低温保存角膜缘干细胞羊膜片的异体移植

目的 :探讨深低温冷冻保存角膜缘干细胞羊膜片的活性及异体移植疗效。方法 :将兔角膜缘干细胞移植到羊膜上 ,经简化程序降温后置 - 196℃深低温保存 ,并将兔对侧眼制成碱烧伤模型。第 30天～第 4 5天后抽样取出冷冻保存的植片分别行电镜检查及兔角膜缘干细胞异体移植 ,并收稿日期 :2 0 0 2 -0 3 -18;修回日期 :2 0 0 2 -0 7-15基金项目 :浙江省教委课题基金 (sjy0 0 0 0 6)。作者简介 :韩真真 ( 195 0 -) ,女 ,浙江温州人 ,主任医师。研究方向 :眼表疾病和角膜病。通信作者 :韩真真 (E -mail:zuixianmei@sina .com)。于术后第 1个月时进行印迹细胞学检查。结果 :电镜检查显示冷冻保存的角膜缘干细胞超微结构形态正常 ,线粒体轻微水肿。移植术后第 1个月时 ,角膜上皮稳固愈合 ,混浊角膜渐转透明 ,新生血管减少 ,角膜印迹细胞学检查显示角膜上皮细胞正常 ,未见杯状细胞。结论 :深低温保存的角膜缘干细胞羊膜片能有效用于眼表的重建 ,但通过简化程序降温的冷冻植片的活性及异体移植的远期疗效有待进一步观察     

人角膜缘干细胞体外培养后生物学特性的变化

目的 探讨人角膜缘干细胞体外培养后细胞形态学，抗原性和增殖能力的变化。方法 消化培养法体外培养人角膜缘干细胞。获得细胞单层并观察细胞形态学变化。利用间接免疫荧光组化检测人角膜缘组织HLA-DR抗原在培养前，后的变化，检测培养后细胞增殖核抗原和角膜上皮64KD角蛋白的表达。结果 原代细胞在培养1周形成单层细胞形态以圆柱状细胞为主，培养前角膜缘上皮下少星HLA-DR抗原分布，培养后单层细胞DR抗原表达阴性；单层细胞中多量，散在分布的增殖细胞核抗原阳性细胞，并且部分细胞表达64KD角蛋白，结论 角膜缘干细胞体外培养后分化为角膜上皮，不表达HLA-DR抗原，介仍保持较强的分裂增殖能力，可能是临床移植治疗干细胞缺乏眼表疾病患者的一种有效手段。     

深低温保存对穿透性角膜移植术后植片厚度和内皮细胞的影响

目的 :探讨深低温保存对穿透性角膜移植术后植片厚度和内皮细胞的影响。方法 :采用SP -2 0 0 0非接触式角膜内皮显微镜 (Topcon ,日本 )和角膜内皮分析仪 ,对 2 6眼冷冻植片的术后植片厚度和内皮细胞变化进行了临床动态观察 ,并以 3 2眼新鲜植片做对照。结果 :术后 1个月 ,冷冻植片组的植片厚度显著大于新鲜植片组 (P <0 0 1) ;术后 3、 6和 12个月 ,两组差异无显著性 (P >0 0 5 )。术后 1、 3、 6和 12个月 ,冷冻植片组内皮细胞密度均显著低于新鲜植片组 (P <0 0 5 )。术后 1和 3个月 ,冷冻植片组内皮细胞丢失率、细胞面积变异系数和六角形细胞比率均与新鲜植片组有显著差异 (P <0 0 1,P <0 0 5 ) ;术后 6和 12个月 ,两组差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论 :深低温冷冻保存的角膜存在一定潜在损伤 ,移植术后内皮细胞丢失率和形态学改变比新鲜植片显著 ;植片水肿恢复速度较慢。但术后 1年仍然具有维持角膜透明的内皮细胞密度、正常的细胞形态和正常的角膜厚度。     

深低温冻存及新鲜角膜用于穿透性角膜移植的对比研究

目的进一步探讨深低温保存角膜用于穿透性角膜移植术的价值及比较它与新鲜角膜各自的特点.方法选择36例属优良组的角膜白斑,随机分2组,分别采用新鲜及深低温保存角膜为供体,行穿透性角膜移植术,观察术后植片愈合及泪膜恢复情况,检测角膜厚度、内皮细胞密度及视力恢复情况等.结果采用新鲜及深低温保存角膜为供体,术后泪膜破裂时间(Break-up time,BUT)恢复正常的时间平均为(4.7±0.3)月(2～6月)及平均为(5.6±0.4)月(2～8月);泪液分泌试验(SchirmirTest)恢复正常的时间平均为(2.1±0.3)月(1～4月)及平均为(1.7±0.5)月(1～3.5月);移植片厚度平均为0.62 mm(0.56～0.68 mm)及平均为0.59 mm(0.54～0.62 mm);趋于稳定后的视力分别为0.46±0.03及0.44±0.05;排斥反应发生率分别为20%及19%;二组间均无显著性差异(P＞0.05).但前组术后植片上皮完整,植片始终透明,而后组术后植片上皮缺损,约3～5天才修复,植片出现2～3周暂时性水肿;前组植片内皮细胞密度平均为2 135个/mm2(2 043～2210),后组平均为1 672个/mm2(1 240～1 860个/mm2),二组间有显著性差异(P＜0.01).结论深低温保存角膜用于穿透性角膜移植术后在植片透明率、角膜厚度、视力恢复及排斥反应发生率等方面与应用新鲜角膜无差异,但上皮愈合相对延迟,内皮细胞密度相对较低.眼科学报2001;1768～71.     

Corneal transplant tolerance of cryopreservation

PURPOSE: To study the outcome of corneal transplants performed with cryopreserved tissue. METHODS: Maisonneuve-Rosemont Hospital medical records of all corneal transplantations performed with cryopreserved tissue by one surgeon (M.L.F.) between March 1978 and April 1991 were reviewed. The Kaufman--Capella cryopreservation technique was used. Corneas were cryopreserved for periods of 3 days to 16.8 years (mean, 4.6 years) before transplantation. RESULTS: We report a mean follow-up of 54 months (range, 2.8--151.3 months). Survival analysis showed the probability of a clear graft to be 76% at 1 year and 73.2% at 2 years. At the time of the last visit, visual acuity was 20/40 or better in 61 eyes (49.2%). The mean postoperative pachometry was 0.58 mm (range, 0.50--0.75 mm). Specular microscopy performed in 57 eyes showed a mean endothelial cell count of 938 cells/mm(2) 55.1 months (range, 2.9--151.3 months) after surgery. For comparison purposes, the outcome of a subgroup of cryopreserved (n = 33) and noncryopreserved (n = 26) corneas transplanted by the same surgeon between April 1986 and April 1990 was studied. CONCLUSION: Despite an increase in the primary failure rate and higher initial endothelial cell loss, cryopreserved transplants are viable. Although we do not recommend cryopreservation of corneas for elective surgery, we consider that cryopreserved corneas can be very useful in emergency situations when tissue availability is a problem.     

人角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨人自体角膜缘干细胞（LSCs）体外培养及鉴定的方法。方法将供体新鲜人角膜缘组织在制备的含20％胎牛血清DMEM／F12培养基的羊膜载体上应用组织块培养法进行体外培养,对培养获得的LSCs用苏木精-伊红染色在倒置显微镜下进行形态学观察,用免疫荧光技术鉴定培养的LSCs细胞。结果组织块静置2h后贴壁良好,3～4d细胞从组织块边缘荫出,7～10d细胞出现生长高峰,12～14d形成良好的细胞单层。细胞形态呈多边彤、圆形、卵圆形和梭形。第14天时行间接免疫荧光染色,可见大量细胞表达p63,呈细胞质的绿色荧光;少量细胞表达AE5,呈细胞质的绿色荧光和细胞核的红色荧光。结论组织块培养法体外培养的人LSCs具有与正常人LSCs相一致的生物学特性。     

硫酸软骨素联合甘油长期冷冻保存角膜植片的实验研究

背景 硫酸软骨素(CS)是从动物软组织中提取的一种具有高黏滞性和高弹性的酸性黏多糖类物质,因具有广泛的生物活性而用于眼科临床.中期保存液中含有CS时,对角膜内皮细胞(CECs)具有显著的保护作用.然而,CS对长期甘油冷冻保存的CECs是否起到保护作用尚待研究. 目的 研究CS在甘油冷冻保存角膜中对CECs的保护作用,并与透明质酸钠(SH)比较,探索长期保存CECs活性的新方法.方法 获取52只Wistar雌性大鼠角膜片104只,采用随机数字表法随机分为4个组,正常对照组为新鲜角膜直接进行实验,质量分数3％ CS处理组、质量分数1％ SH处理组的角膜分别在内皮面黏附3％ CS、1％SH后放入甘油中冷冻保存,单纯甘油保存组角膜直接装入甘油中-25℃冷冻保存,每组26只角膜片.96只雌性SD大鼠作为受体,角膜植片保存2个月后各组取24只植片行同种异体穿透角膜移植术(PKP),CECs锥虫蓝-茜素红染色分别评价保存的角膜片和移植术后14d的角膜植片上CECs的存活率;透射电子显微镜下观察不同方法保存的角膜植片的超微结构.角膜移植术后1d通过裂隙灯显微镜检查各组角膜排斥反应指数(RI)和植片存活时间,分别于术后7、14、30 d制备角膜标本行常规组织病理学检查,免疫组织化学法检测各时间点植片中转化生长因子β1(TGF-β1)和细胞间黏附因子1(ICAM-1)的表达水平.结果 正常对照组大鼠角膜植片CECs细胞结构正常,未见锥虫蓝-茜素红蓝染细胞,3％ CS处理组偶见细胞蓝染,1％ SH处理组和单纯甘油保存组蓝染CECs数增加.与3％ CS处理组比较,1％ SH处理组和单纯甘油保存组的细胞密度均明显下降,差异均有统计学意义(t=2.214、4.068,P＜0.05),细胞活性率表现出同细胞密度同样的趋势.CECs超微结构检查表明,3％ CS处理组仪表现为内质网的轻度肿胀,而1％SH处理组和单纯甘油保存组细胞内质网肿胀程度较重.3％ CS处理组术后14d时植片淋巴细胞浸润及新生血管明显少于1％ SH处理组和单纯甘油保存组.临床评分表明,与1％ SH处理组和单纯甘油保存组比较,3％ CS处理组的R1明显降低而CECs生存时间明显延长,差异均有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学检测显示,在各时间点,3％ CS处理组植片中TGF-β1的表达量(A值)明显高于1％ SH处理组和单纯甘油保存组(P＜0.01);而ICAM-1的表达量低于1％ SH处理组和单纯甘油保存组(P＜0.05),3％ CS处理组植片中TGF-β1和ICAM-1的表达量接近于正常对照组表达水平.结论 3％ CS处理后的甘油保存方法能长期维持CECs的活性,同种异体PKP结果显示3％ CS处理后的甘油保存方法效果优于1％ SH处理后的甘油保存法.