重组人粒细胞集落刺激因子生物学活性工作标准品的标定

目的用世界卫生组织 (WHO)粒细胞集落刺激因子 (G CSF)生物学活性国际标准品对所制备的重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)生物学活性工作标准品以及惠尔血 针剂 75进行标定。方法用NFS 6 0细胞采用MTT法进行rhG CSF生物学活性的测定 ,(4 ,4)法计算测定结果。结果制备rhG CSF生物学活性工作标准品 3批 ,两批为冻干剂 ,与G CSF生物学活性国际标准品配方一致 ,一批为水剂 ,与惠尔血 针剂 75配方一致 ;用G CSF生物学活性国际标准品对其标定 ,结果依次为 3.0 6 2× 10 6、4.2 76× 10 6IU/支及 1.6 35× 10 7IU/ml,样品为1.880× 10 7IU/ml。标定结果的FL %分别为 5 .5 2 9%、4.2 91%、4.2 44 %及 5 .175 %。结论所标定的rhG CSF生物学活性工作标准品可用于rhG CSF生物学活性测定。     

MTT法测定三种基因工程细胞生长因子生物学活性方法研究

目的 :对MTT法测定重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)、重组人粒细胞 /巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)、重组人肿瘤坏死因子 (rhTNF α)等基因工程细胞生长因子生物学活性进行方法学研究。方法 :分别培养NFS 6 0、L92 9、TF 1细胞 ,用MTT进行染色后 ,用 45 0型酶标读数仪在 5 70mm处测定OD值。结果 :确定了不同细胞株对MTT的最佳染色浓度、染色时间和回归关系及线性范围 ,找出了用MTT法测定rhG CSF、rhGM CSF、rhTNF α等基因工程细胞生长因子生物学活性的灵敏度范围及线性回归关系。结论 :为将 (k ,k)法用于MTT法测定基因工程细胞生长因子生物学活性奠定了基础     

重组人粒细胞集落刺激因子生物学活性标准品的免疫学活性测定

目的测定重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)生物学活性标准品的免疫学活性。方法用深圳晶美公司及美国R&D公司的G CSFELISA试剂盒分别对WHOrhG CSF生物学活性国际标准品、惠尔血针剂 75 (GRAN 75 )及用WHOrhG CSF生物学活性国际标准品标定过生物学活性的工作标准品T1、T2、T3进行免疫学活性测定。结果不同公司的rhG CSFELISA试剂盒对所测定样品的测定结果不同 ,且用不同稀释液稀释样品测定结果亦不同。结论用免疫学方法定量测定rhG CSF的含量是有条件的 ,且免疫反应能识别聚体但不能识别蛋白分子的降解。     

重组人粒细胞集落刺激因子注射液动员外周血干细胞10例

目的 :探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG CSF)注射液动员外周血造血干细胞 (PBSC)的效果。方法 :对 6例恶性血液病病人 ,1d内静脉注射长春新碱 1～ 2mg·m- 2 及环磷酰胺 4～ 7g·m- 2 (分 4次 ,间隔 4h) ,外周血白细胞降至 1×10 9·L- 1以下时 ,加rhG CSF 6～ 8μg·kg- 1,皮下注射 ,qd× 5～ 7d ;对 4例健康供者在采集PBSC前 5d予rhG CSF 6～ 8μg·kg- 1,皮下注射 ,qd× 5d。白细胞升至 10× 10 9·L- 1以上时采集PSBC ,并进行CD+ 34 及粒 巨噬细胞集落形成单位 (CFU GM )检测。结果 :一次收集单个核细胞计数 (3.9±s 1.7)×10 8·kg- 1;CD+ 34 (4 .8± 2 .3)× 10 8·kg- 1;粒 巨噬细胞集落形成单位 (5± 3)× 10 4 ·kg- 1。未出现严重不良反应。结论 :rhG CSF无论对病人自体还是对健康供者均能安全、高效地动员PBSC ,满足移植所需要。     

粒细胞集落刺激因子在白血病严重感染中的应用

目的　急性白血病大剂量化疗后 ,白细胞平均降至 0 .8× 1 0 9/L时 ,应用基因重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF) ,促使白细胞恢复。方法　每天 1 50U皮下注射 ,直至中性粒细胞绝对值 >0 .5× 1 0 9/L后停药 ,平均用药 6 .3d。结果　与未用rhG CSF治疗的对照组相比 ,粒细胞缺乏的恢复时间缩短 5 .8d ,发热时间缩短 4.5d。结论　rhG CSF可升高外周血中性粒细胞计数 ,减少感染 ,用于急性白血病的辅助治疗是安全有效的。     

化疗联合G-CSF动员恶性血液病患者外周血造血干细胞

目的　探讨恶性血液病患者使用化疗联合造血生长因子进行自体外周血造血干细胞动员的效果及影响因素。方法　 19例恶性血液病患者采用化疗联合重组人粒细胞集落刺激因子(rhG CSF)进行外周血造血干细胞动员和采集 ,检测采集物中有核细胞及CD34+ 细胞数量。结果　 19例共采集 5 6次 ,化疗结束至采集开始平均 11 5 (6～ 19)天。获有核细胞数平均 4 0 0 (1 6 4～ 6 4 6 )×10 8/kg ;CD34+ 细胞数平均 6 78(0 0 5～ 2 3 33)× 10 6/kg。CD34+ 细胞≥ 2 5× 10 6/kg的比率为 78 9%(15 /19,95 %可信区间为 5 4 %～ 96 % ) ;CD34+ 细胞≥ 5 0× 10 6/kg的比率为 5 2 6 % (10 /19,95 %可信区间为 2 9%～ 76 % )。仅 3例 (15 79% ,95 %可信区间为 3%～ 4 0 % )CD34+ 细胞 <2 0× 10 6/kg。CD34+细胞产率与病程、动员前化疗次数、Drake化疗积分、动员前外周血白细胞计数相关 ,而与年龄、疾病状态等因素无明显相关性。动员效果也与化疗后外周血白细胞计数恢复时间相关。结论　化疗联合rhG CSF方案应用在大多数血液系恶性肿瘤患者中可获得足够的干祖细胞。对于动员病程长、化疗次数多、Drake化疗积分高、白细胞减少的患者动员效果不良。     

粒细胞集落刺激因子动员的外周血干细胞悬液诱导培养树突状细胞的研究

目的　研究粒细胞集落刺激因子 (G CSF)动员的外周血干细胞 (PBSC)悬液中单核细胞和造血干/祖细胞分别诱导培养的树突状细胞 (DC)的特性 ,探讨临床应用PBSC悬液诱导DC的前景。方法　健康供者经G CSF动员后采集PBSC ,分两种方法诱导培养树突状细胞 :①贴壁细胞 (单核细胞 )经粒—单核细胞集落刺激因子 (GM CSF) +白细胞介素 4 (IL 4 )培养 2周 ,培养结束前 4 8、2 4h分别加入肿瘤坏死因子 (TNF α)、布雷菲德菌素 (brefeldinA ,BFA ) ;②非贴壁细胞 (含CD34+细胞 ) ,加入Flt3Ligand(FL) +干细胞因子 (SCF) +GM CSF +IL 4培养 1周 ,再按前一种方法继续培养 2周。培养结束后 ,流式细胞仪分析细胞表型和胞质 (c)IL 10 +(PE标记 )、cIL 12 (P4 0 ) +(TC标记 )细胞。结果　新鲜标本含CD14 +细胞 ( 18 4± 8 6 ) % ,CD34+细胞 ( 0 9± 0 4 ) %。以PBSC悬液中的 2× 10 6单个核细胞为起始细胞 ,前一种培养方法获得 ( 1 6± 0 6 )× 10 5细胞 ,细胞表型 :CD11c+( 97 3± 5 2 ) % ,CD86 +( 88 2± 6 8) % ,CD83+( 5 9 6± 8 4 ) % ,HLA DR+( 96 5± 7 1) % ,CD1a+( 36 6±7 5 ) % ,cIL 12 (P4 0 ) +( 15 9± 5 1) % ,cIL 10 +( 1 2± 0 4 ) % ;后一种培养方法获得 ( 1 2± 0 4 )× 10 6细胞 ,细胞表型     

聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子预防恶性肿瘤化疗Ⅳ度骨髓抑制27例

目的评价聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子( PEG?rhG?CSF)预防恶性肿瘤化疗后发生 Ⅳ度骨髓抑制的有效性和安全性。方法选取 2017年 1月至 2018年 7月内蒙古自治区人民医院化疗发生 Ⅳ度骨髓抑制的恶性肿瘤病人 52例,其中观察组 27例在第 2个周期化疗后 48 h皮下注射 PEG?rhG?CSF,对照组 25例在第 2个周期化疗后 48 h给予重组人粒细胞集落刺激因子( rhG?CSF)治疗,比较两组骨髓抑制的发生情况。分析白细胞及中性粒细胞在 PEG?rhG?CSF升白治疗第 1、3、5、7、10、14天的变化情况,同时评价两药用药后的不良反应。结果观察组使用 PEG?rhG?CSF后第 1天白细胞数值为( 5.62±1.84)×109/L,第 3天( 14.78±9.57)×109/L,第 5天( 5.39±2.80)×109/L,第 7天( 5.44±3.57)×109/L,第 10天( 5.54±2.75)×109/L,第 14天( 7.09± 2.65)×109/L,中性粒细胞数第 1天( 3.59±1.31)×109/L,第 3天( 12.59±9.10)×109/L,第 5天( 4.11±2.82)×109/L,第 7天( 3.38±3.21)×109/L,第 10天( 3.31±2.33)×109/L,第 14天( 4.95±2.43)×109/L;两组均出现 Ⅳ度粒细胞骨髓抑制 1例,但差异无统计学意义,其他程度的骨髓抑制均差异无统计学意义( P＞0.05);观察组与对照组不良反应发生率骨痛( 4例比 44例)、注射部位疼痛(1例比 8例)差异有统计学意义,乏力、心悸、发热差异无统计学意义。结论 PEG?rhG?CSF能安全、有效地预防恶性肿瘤化疗所致的骨髓抑制,每个化疗周期只需用药 1次,可以减少病人反复注射的引起的骨痛及注射部位疼痛,减轻病人的不适症状,提高治疗的依从性,同时减少医护人员的工作负担和精神压力。     

重组人粒细胞集落刺激因子成品蛋白质含量测定方法的研究

目的研究重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)成品蛋白质含量测定方法。方法用三氯醋酸 Lowry法和高效液相色谱外标法测定rhG CSF成品蛋白质含量。结果两种方法均能有效排除rhG CSF成品中甘露醇的干扰 ,与经典的Lowry法相比 ,蛋白质的回收率均大于 96 % ,RSD均 <5 %。结论三氯醋酸 Lowry法和高效液相色谱外标法均可用于测定rhG CSF成品的蛋白质含量 ,高效液相色谱法操作更简便 ,更准确。     

重组人干细胞因子与重组人粒细胞集落刺激因子联合用药的猴毒性研究

重组人干细胞因子 (rhSCF)和重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)是临床常用的造血生长因子 (HGF) ,实验提示rhSCF和rhG CSF与IL3、IL 6、粒 -巨噬细胞刺激因子、Epo等造血生长因子的各种联合应用有增效作用[1] 。rhSCF和重组人粒 /单集落刺激因子 (rhGM CSF)均能刺激CFU GM生成 ,两者联合应用的作用明显强于rhSCF或rhGM CSF单用[2 ] 。rhSCF与重组人粒 -单系集落刺激因子、重组人IL3和重组人粒 -单系集落刺激因子 /IL3的融合蛋白等造血生长因子伍用可增加集落产率增大集落体积[3 ] ,但两种造血生长因子联用对实验动物…     

基于STAT3转录调节的筛药模型的建立

目的　依据造血生长因子信号转导途径中重要转录因子STAT3的转录调节作用建立基于报告基因的靶向STAT3转录调节的筛药模型 ,用此模型筛选具有G CSF样活性的化合物。方法　构建诱导性表达载体 pTKS3 CAT并转染入表达G CSF受体的NFS 6 0不依赖细胞 ,筛选报告基因CAT表达受rhG CSF诱导的阳性克隆 ,采用ELISA法检测化合物对CAT表达活性的影响。同时 ,对模型的特异性和灵敏性进行检测。结果　在转染有重组质粒的NFS 6 0不依赖细胞中 ,CAT表达受rhG CSF诱导并呈剂量依赖关系 ,EC50 等于 0 0 44nmol·L-1,而rhEPO不能诱导CAT表达。结论　以上模型的CAT基因表达活性能够被其特异性配体强诱导表达 ,利用此模型在 96孔板上用ELISA法测定CAT基因的诱导表达水平可筛选具有G CSF样活性的化合物。     

正交设计研究丹皮酚与丹参酮ⅡA联合rhG-CSF对大鼠EPCs增殖的影响

目的：研究丹皮酚与丹参酮ⅡA联合重组人粒细胞刺激因子对大鼠内皮祖细胞（EPCs）增殖的影响。方法：采用密度梯度离心法及贴壁筛选法获得大鼠骨髓单个核细胞,以内皮细胞培养液培养,通过观察细胞形态、特异性细胞表面标志以及内皮祖细胞吞噬功能等进行鉴定;然后用MTT法检测药物对EPCs的半数抑制浓度（IC₅₀）,再用正交设计优选药物促进EPCs增殖的最佳剂量配伍。结果：细胞形态符合EPCs的生长特点,流式细胞术鉴定结果显示CD34和KDR双阳性率达到90%以上,细胞吞噬功能表明绝大多数的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1。丹皮酚、丹参酮ⅡA及rhG-CSF的IC₅₀值分别是0.223 9 mg·mL^-1,55.581 3 μg·mL^-1,56.701 2 μg·mL^-1;正交设计极差和方差分析,优化配伍组合剂量分别是6.996 9 μg·mL^-1,0.868 5 μg·mL^-1,14.175 0 ng·mL^-1。丹皮酚对EPCs的存活率有显著性影响（P<0.01）;其次是丹皮酚与丹参酮ⅡA交互作用和丹参酮ⅡA （P<0.05）;随着rhG-CSF剂量的增加,细胞存活率降低。结论：经鉴定培养的细胞绝大多数为EPCs。丹皮酚和丹参酮ⅡA可能协同rhG-CSF促进EPCs增殖,提高细胞存活率。丹皮酚是重要影响因素,减少了rhG-CSF的用量,发挥增效减毒的作用,可为其临床联合应用动员干细胞治疗脑缺血疾病提供实验依据。     

HPLC法测定咳特灵胶囊中马来酸氯苯那敏的含量及含量均匀度

目的建立用HPLC法测定咳特灵胶囊中马来酸氯苯那敏的含量及含量均匀度。方法采用Gemini C18（250mm×4．6mm,5μm）色谱柱,检测波长226,1m,甲醇-庚烷磺酸钠醋酸溶液（取庚烷磺酸钠2．0g,加冰醋酸10ml,用水稀释至400ml）（60：40）为流动相,流速为1．0ml·min^-1。外标法测定含量。结果精密度及回收率结果良好,平均回收率为98．6％（n=5）,RSD：2．0％。结论方法准确可靠,可用于咳特灵胶囊中马来酸氯苯那敏的含量及含量均匀度的测定.     

检测白喉毒素特异性细胞毒性的Vero细胞/MTT法的建立

目的 建立检测白喉毒素（diphtheria toxin,DT）特异性细胞毒性的Vero细胞/MTT法.方法 用MEM培养液对DT进行不同倍数的预稀释,用目测法确定DT的最适预稀释倍数.用建立的方法检测以最适预稀释倍数稀释的DT,以确定该法的灵敏度和细胞病变半数抑制浓度（IC50）,同时绘制剂量-反应曲线以验证该法的重复性.用建立的方法于不同pH、盐浓度或蔗糖浓度条件下检测DT,计算DT回收率以验证该法的耐用性.结果 目测法确定的DT最适预稀释倍数为106倍.建立的方法的平均检测灵敏度为（6.01±1.44）×10^-5 lf/ml DT,细胞病变半数抑制率对数值（log IC50）范围为5.02 ～ 5.82,变异系数为5.82％,该法具有较好的重复性.用建立的方法检测不同条件下的DT显示,DT的平均回收率为93.7％ ～ 110.4％,该法具有较好的耐用性.结论 Vero细胞/MTr法可用于检测DT特异性细胞毒性.     

RP-HPLC法测定格列齐特片（Ⅱ）的有关物质及含量

目的建立RP-HPLC法测定格列齐特片（Ⅱ）的有关物质及含量。方法采用反相高效液相色谱法,固定相为辛烷基硅烷键合硅胶（150×4．6mm,5μm）,流动相为水-乙腈-三乙胺-三氟乙酸（60：40：0．1：0．1）,流速1．0ml／min,检测波长为235nm。结果格列齐特在0．01-1．00mg／ml浓度范围内与峰面积呈良好线性关系（r=0．9999）,检测限为0．1μg/ml。平均回收率分别为101．2％（n=9）。结论该方法专属性好、准确、灵敏,用于格列齐特片（Ⅱ）的含量及有关物质测定结果可靠。     

HPLC法测定白花蛇舌草中槲皮素-3-O-β-d-吡喃葡萄糖苷的含量

目的:建立测定白花蛇舌草中槲皮素-3-O-β-d-吡喃葡萄糖苷含量的方法。方法:采用高效液相色谱法。色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-1%冰醋酸(60∶40,V/V),检测波长为254 nm,流速为1.0 ml/min,柱温为35℃。结果:槲皮素-3-O-β-d-吡喃葡萄糖苷的质量浓度在5.24⁵2.40μg/ml范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系(r=0.999 9);精密度、稳定性、重复性试验的RSD均<1.97%;平均加样回收率为99.57%,RSD=1.28%(n=6)。结论:该方法操作简便,结果准确、可靠,可用于白花蛇舌草药材中黄酮类活性成分的含量测定。     

HPLC法测定凉血消风汤中绿原酸的含量

目的：建立高效液相色谱（HPLC）法测定凉血消风汤中绿原酸含量.方法：采用外标法.Hypersil ODS2（250mm ×4.6 mm,5μm）色谱柱为固定相,乙腈-0.4％磷酸溶液（13∶ 87）为流动相,检测波长为327 nm,流速为1.0 ml/min.结果：线性范围为4.0～40.0 μg/ml（r =0.999 1）,平均加样回收率为101.0％,RSD为1.9％（n=6）.结论：本方法专属性强,精密度和稳定性良好,结果准确,可用于凉血消风汤的质量控制方法.