新生隐球菌随机扩增DNA指纹分型研究

目的　用随机引物扩增新生隐球菌临床和环境分离株的DNA ,观察DNA指纹与血清型的关系 ,探索新生隐球菌基因分型标准。方法　采用 3种不同寡核苷酸重复序列 [CN1(GTG) 5、CN2(GACA) 4和CN3(GATA) 4]为引物 ,对从临床和鸽粪中分离到的 2 4株血清A型和 8株四种血清型的新生隐球菌标准株的DNA进行扩增 ,根据扩增产物的电泳带型来对比DNA指纹和血清型之间的关系。结果　 2 4株临床和鸽粪分离的血清A型株中 ,2 0株产生和标准株完全相似的DNA带型 ,1株与标准D型DNA带型相似。 3株的PCR指纹与血清A、B、C、D型均不相同。 2株B型和 2株C型产生几乎完全一致的DNA指纹带型。结论　①大多数血清A型新生隐球菌菌株具有相似DNA指纹带型。②血清B型和C型 (gattii变种 )的DNA带型不易区别。③相同血清型不同的株可能有不同的DNA指纹带型。④PCR法用于新生隐球菌菌株鉴定是一种快速、方便、可行的方法。     

不同氧浓度对新生隐球菌荚膜的影响

【摘要】 目的 探讨不同氧浓度对新生隐球菌荚膜的影响。方法 以厌氧、微需氧和CO2产气袋建立不同氧浓度（分别为0、8%、15%）培养条件,以大气氧浓度（21%）为正常氧浓度培养条件,以新生隐球菌标准株5株（BLS71、BLS63、ATCC32609、ATCC34874、YD53,分别为血清型A、B、C、D、AD）、临床株1株为研究对象,以常规沙氏液体培养基和含3-（N-吗啡啉）丙磺酸（MOPS）的10%沙氏液体培养基（pH 7.3）为非诱导和诱导培养基,在37 ℃下培养3 d,观察不同氧浓度培养条件下新生隐球菌的荚膜形成及大小。结果 除菌株YD53（血清型AD）外,其余受试菌株均可形成明显的荚膜。在非诱导培养条件下,菌株BLS71、BLS63、ATCC32609和临床株在4种氧浓度培养条件下荚膜大小差异有统计学意义（P ＜ 0.01）。在诱导培养条件下,菌株BLS71、BLS63和临床株在厌氧培养条件下的荚膜厚度比其余氧浓度条件下的荚膜明显变小（P ＜ 0.05）。结论 缺氧可能抑制新生隐球菌荚膜的形成。 【关键词】 隐球菌,新型; 氧; 荚膜     

新生隐球菌28S rDNA的基因型特征与序列分析

目的 探讨新生隐球菌各变种、血清型与基因型的关系。方法 新生隐球菌标准株10株、新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10以及临床分离株19株,采用变性梯度胶电泳(DGGE)结合DNA序列分析,对以上菌株的28S rDNA片段进行研究。结果 经过DGGE和DNA序列分析,所有新生隐球菌新生变种(A、D型)具有一致的基因带型和序列,格特变种(B、C型)具有不同于新生变种的独特一致的带型和序列;AD型的基因型和序列与格特变种完全相同,新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10(D型)的基因型类同于新生变种;19株临床分离菌在DGGE上可分为2型,17株与A、D型完全相同,2株与B、C型相同。结论 DGGE结合DNA序列分析,对于探讨新生隐球菌各变种、血清型的基因型特征、关系具有重要价值;我国非艾滋病隐球菌病感染以新生变种为主,AD型在系统发育上更类同于格特变种,而不是新生变种;本研究不支持A血清型为新生变种以外的新变种即grubii变种的观点。     

CAP64荚膜相关基因在新生隐球菌分型中的意义

新生隐球菌的多聚糖荚膜成分是新生隐球菌血清型分型的物质基础^[1],而CAP64荚膜相关基因是新生隐球菌荚膜合成的必需基因之一^[2],我们根据新生隐球菌血清型DCAP64荚膜基因的序列设计引物,将设计的引物扩增5个标准血清型新生隐球菌,已分型和未分型新生隐球菌临床分离株,以及其他的致病真菌,以寻找引物的型特异性。     

中国致病性新型隐球菌血清型的研究

本文应用标准血清型菌株,采用生化鉴别培养与血清学验证相结合的方法,首次对中国致病性新型隐球菌的血清型进行较为系统的研究。从全国共九个地区收集新型隐球菌菌株,经过系统的真菌学鉴定,其中的60株被确定为新型隐球菌株。分型结果表明,中国致病性新型隐球菌血清型的最大特点为缺乏C型,作者由此提出C型可能是中国以至整个亚洲地区的“缺乏型”,并得出以下结论:在中国(1)A型占大多数;(2)D型少见;(3)可见AD型及U型,(4)有一定比例的B型,但缺乏C型。     

在CGB培养基上生长的A型和D型新生隐球菌

新生隐球菌是临床上重要的致病真菌,在免疫缺陷的患者如艾滋病患者中引起播散性脑膜炎。新生隐球菌有两个变种,并分为5个血清型。文献报道新生隐球菌新生变种的血清型为A、D和AD型,在CGB培养基上不生长;格特变种的血清型为B和C型,能够在CGB培养基上生长。作者报告了3株来自鸽排泄物,能在CGB培养基上生长,血清型为A或D型的新生隐球菌。     

新生隐球菌AD血清型是新生变种?

新生隐球菌根据传统的分类方法和以往的观点,血清型AD型新生隐球菌一直被视为新生隐球菌新生变种\,但事实上,AD型新生隐球菌无论在地区分布、致病特征等方面,均与新生隐球菌新生变种中的A型和D型有明显不同^[2,3].本文采用变性梯度胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术和核酸序列分析,首次发现新生隐球菌AD型28S rDNA基因型与新生隐球菌新生变种的A、D型不同,而与新生隐球菌格特变种B、C型完全一致,现报道如下.     

80株中国大陆新生隐球菌环境株表型和分子特征的初步研究

目的了解中国大陆地区新生隐球菌环境株的分布情况,及其表型和基因型特征。方法采用CACA培养基培养1372份来自中国大部分地区私人和公共养鸽场所的鸽粪标本,分离出新生隐球菌,并对其表型和基因型特征进行分析。结果共分离出80株新生隐球菌,分离阳性率约为5．5％,所有菌株37℃生长良好,有完整荚膜,尿素酶试验阳性。ITS序列分析证实分离出的新生隐球菌均属于血清型A。M13-PCR显示,其基因型为我国及东南亚地区特征性的VNIC型,显示了与临床株的高度一致性。结论中国大陆地区的新生隐球菌临床株与环境株显示了高度的同源性,提示对于易感人群,阻断与相应环境的接触可有效预防新生隐球菌的感染。     

真菌病

20 0 2 2 190　 PCR对新生隐球菌的基因分型研究 /温海(二军大长征医院皮肤科 )…∥第二军医大学学报 .-2 0 0 1,2 2 (11) .- 10 0 5～ 10 0 8用 AP- PCR方法检测新生隐球菌的临床和环境分离株 ,观察 PCR指纹与血清型的关系 ,探索 PCR指纹对于新生隐球菌的分型标准。采用 3种寡     

A型新生隐球菌质粒克隆库的构建及其特征分析

新生隐球菌是一种条件致病菌，当机体免疫力减低时就可能侵犯人体，引起严重的隐球菌病，特别是隐球菌性脑膜炎的死亡率极高。隐球菌属包括１７个种７个变种，然而能够致病的只有新生隐球菌及其变种，且以血清型Ａ型最常见。我们以Ａ型新生隐球菌标准菌为实验菌株，构建了质粒克隆库，这是进一步进行分子生物学研究的基础，如在核酸水平探索致病机理，建立快速诊断方法等。一、材料和方法（一）菌株和质粒：①Ａ型新生隐球菌标准株Ｄ４８由世界卫生组织（ＷＨＯ）提供，本研究室保藏；②质粒ＰＵＣ１８及宿主菌ＪＭ１０３由复旦大学遗传学研…     

磷脂酶对新生隐球菌毒力的影响

目的 评价不同条件、不同来源和不同血清型的新生隐球菌分泌磷脂酶的情况;观察胞外磷脂酶对菌株毒力的影响。方法 分别在30℃和37℃下用蛋黄平板法培养不同来源的40株新生隐球菌,计算沉淀圈比值(PZ值),比较其磷脂酶活力的不同;建立小鼠感染模型,用小鼠的平均生存期及脑组织菌落形成单位(cfu)比较分泌磷脂酶和不分泌磷脂酶菌株毒力的变化。结果 39株菌的菌落周围产生明显白色沉淀圈,PZ值在30℃和37℃培养条件下分别为0.529±0.121和0.523±0.143;血清型A、B及AD和D型的PZ值分别为0.541±0.116、0.518±0.036和0.472±0.051;不同温度间和不同血清型组间差异均无显著性(P>0.05);临床株和环境株PZ值分别为0.501±0.049和0.565±0.131,差异有显著性(P<0.05)。感染分泌磷脂酶菌株和不分泌磷脂酶菌株两组小鼠脑组织的cfu分别为518.67±203.86和226.47±196.13,两组小鼠的平均生存期分别为18.90d和26.39d,差异有显著性(P<0.01)。结论 温度对新生隐球菌磷脂酶活力没有影响;其中临床分离株比环境分离株磷脂酶活力强;不同血清型菌株的磷脂酶活力无差别;分泌磷脂酶的菌株毒力比不分泌磷脂酶菌株的毒力强。     

新生隐球菌不同变种所致小鼠原发性皮肤感染的比较

目的：探讨新生隐球菌不同变种在原发性小鼠新生隐球菌皮肤感染中的作用。方法：按照我们建立的原发性皮肤隐球菌感染模型的方法，将新生隐球菌新生变种标准野生株B3501与格特变种标准株ATCC32609分别皮内接种于免疫抑制与非抑制的BALB／c小鼠，皮损真菌培养与组织病理检查确证感染。观察2种隐球菌感染的病程，比较皮损形成与消退的平均时间。结果：2种变种的新生隐球菌皮下接种于BALB／c小鼠后，可以在免疫抑制与非抑制的BALB／c小鼠皮肤上产生丘疹、结节、溃疡、传染性软疣样皮损，皮损可以自愈，真菌培养与病理确证为隐球菌感染。2种菌株只在免疫正常小鼠的皮损形成时间上存在差异。结论：新生变种与格特变种的新生隐球菌均可以造成BALB／c小鼠相似的皮肤感染。推测2种变种对原发性皮肤感染的致病力可能无差异，新生变种发病较多可能与其分布有关。     

新生隐球菌生态学研究

目的:研究中国环境中新生隐球菌变种的生态学特点.方法:采集10个城市(3组)鸽粪标本620份和江西贵溪地区澳洲赤桉标本819份;采用咖啡酯玉米山梨醇琼脂(cAcA)培养基分离新生隐球菌,并对菌株进行CGB培养,酚氧化酶、尿素酶、血清型、交配型试验和形态学观察.结果:①不同纬度地区鸽群的新生隐球菌标本阳性率为G1[40°～50°北纬(N)]13%,G2(30°～40°N)50%,G3(20°～30°N)29%,G2显著高于G1(P＜0.01);3组鸽群阳性率基本相同(P＞0.05),平均为81%.②环境分离358株全部37℃生长、酚氧化酶阳性、CGB培养阴性;1株尿素酶阴性;其中101株均为α交配型和A血清型,提示全部为grubii变种;发现环境分离菌株荚膜变异并与其他真菌的自然黏附现象.③从江西贵溪生长的澳洲赤桉未分离到新生隐球菌格特变种.结论:中国环境中以grubii变种为主的新生隐球菌的生态学特点与其所在的地区纬度明显相关:由澳洲赤桉分离新生隐球菌格特变种的研究仍然需要继续进行.     

新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定

目的 建立一种基于核糖体基因内间隔区（IGS）的多重聚合酶链反应（PCR）,用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌。方法 选取新生隐球菌和格特隐球菌IGS中变异度最高的Ⅰ区（IGS1）为靶点,经ClustalW2多重比对,并结合Oligo6软件在不同序列位点设计针对新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌的引物用于多重PCR分析。通过51株新生隐球菌（VNⅠ-VNⅣ和VNB基因型）和41株格特隐球菌（VGⅠ-VGⅣ基因型）对该方法进行验证,并将该方法与已报道的CGB显色培养和采用特异性引物GPA1A、CLA4D和SOD1gattii扩增格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的单一引物PCR方法进行比较。结果 基于IGS的多重PCR分析成功鉴定所有92株新生隐球菌和格特隐球菌,对其他常见致病酵母的扩增均阴性,显示所设计引物较高的特异性;已报道的基于GPA1A和CLA4D引物PCR分别在鉴定2株和1株格特隐球菌时出现假阳性结果;CGB培养基在鉴定1株格鲁比变种和1株新生变种时出现假阳性结果。上述方法在鉴定时均未出现假阴性结果。结论 建立的多重PCR可快速准确地鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种、AD杂合子和格特隐球菌,且优于已报道的单一引物PCR 或CGB显色培养法。     

一步法提取隐球菌DNA

我们在对隐球菌临床和环境分离株进行基因分型的过程中，将隐球菌ＤＮＡ提取方法进行了改革，建立了一个简便、快速、高产的方法，现介绍如下。一、材料和方法（一）菌株：选择４株新生隐球菌（血清Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ型），其中９４５７５２（Ａ型）由意大利米兰大学卫生与预...     

PCR-RFLP和PCR指纹法在新生隐球菌基因分型中的应用与比较

目的 探讨针对结构基因g6341的PCR－RFLP方法在新生隐球菌基因分型中的应用价值, 并与PCR指纹分型法进行比较。方法 以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物，对受试的新生隐球菌进行PCR指纹分型。选择结构基因g6341进行PCR－RFLP分析，在序列保守区设计通用引物，筛选合适的限制性内切酶进行RFLP分析，并与PCR指纹法进行比较。g6341基因扩增片段测序，进行系统发育分析，研究各主要基因型间的亲缘关系。结果 多位点基因序列分析表明，结构基因g6341可作为RFLP分析的合适靶点。对76株新生隐球菌的基因分型结果显示，针对g6341的PCR-RFLP方法与PCR指纹法结果一致。分析g6341基因部分序列得出，8种主要基因型菌株相互间的同源性在84％ ～ 97％之间，同一主要基因型菌株的同源性在99％ ～ 100％之间。分子发育树中，VNⅠ－VNⅣ基因型、VGⅠ－VGⅣ基因型分别聚在一类。结论 针对结构基因g6341的PCR-RFLP方法可作为新生隐球菌分子分型的有效工具，对g6341基因的序列分析可揭示不同菌株间的遗传进化关系。     

新生隐球菌变种问ITS序列差异的研究

目的 利用真菌核糖体基L大1内转录间隔区(ITS)序列分析和系统进化学分析来研究新生隐球菌上海变种的地位及变种问ITS序列的差异.方法 采用真菌通用引物ITS1、ITS4对12株新生隐球菌不同变种标准株的ITS片段进行PCR扩增和测序,结合基因库等数据库中11株新生隐球菌标准株的ITS序列,用CLUSTAL W1.83软件多重比对分析序列的差别,MEGA3.1软件处理数据绘制系统进化树.结果 新生隐球菌变种之间ITS序列存在明显差异,存在6种亚型;gattii变种ITS序列存在4种亚型.中国发现的新生隐球菌上海变种S8012与gattii变种在表型及分子生物学研究均存在显著的差异,但仍属于变种内差异.结论 我国发现的上海变种S8012归入gattii变种的ITSC型,原gattii变种RV20186归人gattii变种的ITSF型.     

荚膜在小鼠原发性皮肤新生隐球菌感染中的作用

目的探讨新生隐球菌多糖荚膜在小鼠原发性皮肤新生隐球菌感染中的作用。方法按照笔者建立的原发性皮肤隐球菌感染模型构建方法,将新生隐球菌标准野生株B3501与荚膜缺陷株cap64分别皮内接种于免疫抑制与非抑制的BALB/c小鼠,皮损真菌培养与组织病理检查确证感染。观察2种隐球菌感染的病程,比较皮损形成与消退的时间。结果野生株与荚膜缺陷株新生隐球菌皮下接种于BALB/c小鼠后,均可以在免疫抑制与非抑制的BALB/c小鼠皮肤上产生结节、丘疹、溃疡、传染性软疣样皮损,皮损可以自愈,真菌培养与病理确证为隐球菌感染。2种菌株感染的病程差异无显著性意义。结论野生株与荚膜缺陷株新生隐球菌均可以造成BALB/c小鼠相似的皮肤感染。荚膜可能不是小鼠皮肤隐球菌感染的主要毒力因子。     

伊曲康唑与氟胞嘧啶体外联合抗新生隐球菌临床分离株的实验研究

目的：评价新生隐球菌临床分离株对伊曲康唑与氟胞嘧啶联合用药的敏感性及两种药物之间相互作用的方式。方法：采用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的棋盘微量稀释法，检测了20株新生隐球菌临床分离株对伊曲康唑、氟胞嘧啶及两药联合用药的体外药物敏感性，同时对两种药物的作用方式进行了判定：结果：联合用药时显著减少了每一药物MIC值的几何均数，25％受试菌株表现为协同作用方式，60％的受试菌株表现为相加作用方式，15％受试菌株表现为无关作用方式，未观察到拮抗作用。测定不同浓度下单一药物和联合用药的一株菌的菌落形成单位，联合用药较氟胞嘧啶单独用药菌落形成单位有减少现象。结论：伊曲康唑与氟胞嘧啶联合应用较两种药物单独应用的体外抗新生隐球菌的活性高。     

聚合酶链反应快速诊断隐球菌性脑膜炎

在国内首次采用聚合酶链反应扩增新生隐球菌ｒＤＮＡ部分特异性序列的方法诊断隐球菌性脑膜炎。所试１１株新生隐球菌均扩增产生预期长度１３６ｂｐ的特异性片断，２１株非新生隐球菌未见此片断。