乙型肝炎病毒全基因在肝癌细胞中的转染与表达

目的 建立乙型肝炎病毒（HBV）复制状态模型。方法 体外连接HBV DNA获得6．4kb的双拷贝DNA片段,然后将其插入pcDNA3载体的EcoRV位点,通过聚合酶链反应（PCR）和酶切筛选获得头尾串联双拷贝HBV全基因重组真核表达质粒,再通过脂质体介导法转染肝癌细胞。结果 通过G418筛选,对阳性克隆细胞进行十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析,证明已将HBV全基因重组真核表达质粒转染至肝癌细胞并获得稳定表达。结论 通过脂质体介导法将HBV全基因转染至肝癌细胞,成功建立了HBV复制状态的细胞模型。     

乙型肝炎病毒全基因重组真核表达质粒的构建

目的 构建乙型肝炎病毒（HBV）全基因重组真核表达质粒,旨在转染肝细胞,建立HBV复制状态模型。方法 体外连接HBV（ayw亚型）DNA获得6.4kb的双拷贝DNA片段。然后将其插入pcDNA3载体的EcoRV位点。结果 通过聚合酶链反应（PCR）和酶切筛选和验证获得头尾串联双拷贝HBV全基因重组真核表达质粒。结论 成功构建了HBV全基因重组真核表达质粒。     

乙型肝炎病毒全基因重组真核表达质粒的构建

目的 构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）全基因重组真核表达质粒,旨在转染肝细胞,建立 ＨＢＶ复制状态模型。方法体 外连接 ＨＢＶ（ａｙｗ亚型） ＤＮＡ获得 ６．４ ｋｂ的双拷贝 ＤＮＡ片段,然后将其插入 ｐｃＤＮＡ３载体的 ＥｃｏＲＶ位点。结果通过 聚合酶链反应（ＰＣＲ）和酶切筛选和验证获得头尾串联双拷贝ＨＢＶ全基因重组真核表达质粒。结论成功构建了ＨＢＶ 全基因重组真核表达质粒。     

双拷贝和x基因缺失HBV DNA质粒的构建及其细胞转染

目的:构建双拷贝和x基因缺失的HBV真核细胞复制表达质粒,并研究其在Hep3B肝癌细胞株中对HBV的复制表达效果.方法:利用含HBV DNA(adrⅠ)的质粒,酶切出HBV DNA片段,克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3,构建双拷贝HBV DNA的真核表达质粒pcDNA3-ES-HBV2;将原始质粒通过插入人工合成DNA片段和基因重组破坏乙肝病毒x基因区,再克隆入pcDNA3,构建成pcDNA3-KN-F1F2真核表达质粒;用两质粒分别转染Hep3B肝癌细胞株,进行G418筛选的同时用荧光定量PCR法检测细胞培养上清液HBV DNA.结果:(1)成功构建了x基因缺失的HBV真核表达质粒pcDNA3-KN-F1F2及含双拷贝HBV DNA的真核表达质粒pcDNA3-ES-HBV2;(2)对两质粒成功进行细胞转染后,测得第3、6、14天细胞培养上清液中HBV DNA均高表达,两质粒之间差别不明显.结论:构建的质粒可在Hep3B细胞株中表达并引起HBV的复制及分泌;x基因的缺失不影响HBV在Hep3B细胞株中的表达复制.     

头尾串联双拷贝HBV DNA重组体的构建

为构建含筛选基因并能在转染细胞内建立HBV复制状态的真核表达载体,利用BamHI与BglH粘端互补的特点,将经BamHI线性化的HBVDNA（adr亚型）克隆于表达新霉素基因的载体pcDNA3的BamHI与BglII位点间,获得含头尾串联双拷贝HBV基因组的重组质粒。     

两个不同筛选特性的表达HBV X基因肝癌细胞模型的建立

目的：构建两个不同筛选特性的表达HBV X基因肝癌细胞模型。方法：应用脂质体介导转染克隆有HBV X全基因真核表达载体pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X入肝癌细胞HepG2,hygromycin和neomycin筛选单细胞克隆,传代培养一定时期后应用PCR,RT-PCR和Western blot方法鉴定HBV X基因的表达。结果：转染后成功筛选出耐hygromycin或neomycin的单细胞克隆,并能传代培养一定时期。PCR,RT-PCR和Western blot结果显示HBV X基因获得表达。结论:成功构建不同筛选特性的两个HBV X基因表达肝癌细胞模型。     

GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

针对HP450基因shRNA真核表达载体的质粒转染

目的 以pGPH1/GFP/Neo质粒为载体,构建特异性针对HP450基因shRNA真核表达载体,并通过脂质体介导转染正常的大鼠肝细胞株(BRL),以探讨靶向干扰HP450基因对BRL细胞生长的影响.方法 构建pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体.应用脂质体转染技术,将重组的pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体转染至大鼠肝细胞株(BRL),并于转染后6、12、24 h在荧光倒置显微镜下观察细胞状态.结果 成功构建针对HP450基因shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,通过脂质体介导转染大鼠肝细胞株BRL,在荧光倒置显微镜下可观察到细胞转染后的荧光现象.结论 成功构建的HP450 shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,可通过质粒转染方法转染至BRL细胞.     

Adr亚型HBV转染人胎盘滋养层细胞株的体外研究

目的通过转染adr亚型HBV-DNA,建立可复制HBV的人胎盘滋养层细胞(HPT-8)。方法采用脂质体介导的方法将重组真核表达质粒pcDNA3-3HBV转染人胎盘滋养层细胞,经G418筛选,通过ELISA、免疫组化、PCR等方法对转染细胞和培养上清分别进行检测。结果HPT-8细胞稳定转染质粒pcDNA3-3HBV后,第1、2代转染细胞的培养上清ELISA检测显示HBsAg、HBeAg阳性,免疫组化检测显示转染细胞胞浆中HBsAg、HBcAg呈阳性信号,PCR检测培养上清中HBV-DNA呈阳性,荧光定量PCR检测其滴度达9×106拷贝/L,并且转染滋养细胞中有HBV-rcDNA和HBV-cccDNA存在。结论重组质粒pcDNA3-3HBV能在人滋养层细胞中表达、转录、复制。     

CCR7基因载体的构建及其在肺腺癌H157细胞的稳定表达

目的 构建人CCR7基因真核表达质粒,获得稳定表达CCR7蛋白的H157细胞.方法 应用逆转录PCR法(RT-PCR)自人肺腺癌标本中扩增出CCR7编码区序列,定向克隆至载体pEGFP-N1中构建质粒pEGFP-CCR7,采用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒DNA导入肺腺癌H157细胞中,加入G418对细胞进行筛选,...