荧光定量聚合酶链反应检测人类疱疹病毒7型方法的建立及应用

1990年，首次从健康人外周血单个核细胞中分离到人类疱疹病毒7型(human herpes virus type 7，HHV-7)。HHV-7为双链DNA病毒(145kh)，主要感染CD4^ 淋巴细胞、唾液腺。HHV-7感染可引发婴儿急疹、热性癫痫发作、慢性疲劳性综合征和单核细胞增殖异常等。HHV-7与HHV-6同属人类β-疱疹病毒，两者在细胞病变特点和分离培养条件方面相似，HHV基因诊断是目前较理想的诊断和鉴别诊断方法。传统定性聚合酶链反应(PCR)技术曾被广泛应用于临床诊断，但存在不能定量、特异性不够等缺陷。     

口腔鳞癌患者淋巴细胞对人疱疹病毒6型增殖应答受损

目的研究口腔鳞癌患者淋巴细胞对人疱疹病毒6型（HHV-6）特异性增殖应答,初步探讨HHV-6在口腔鳞癌发病机制中的作用。方法间接免疫荧光法（IIF）检测血浆中抗HHV-6IgG;免疫微磁珠分离CD4^＋T及CD8^＋T细胞;3H-TdR法检测CD4^＋T和CD8^＋T细胞及PBMCs的增殖水平;FACS分析CD4^＋C25^＋调节性T细胞（Treg）的比例。结果口腔鳞癌组血浆中抗HHV-6IgG阳性数为8/8,正常对照组为12例（12/20）;口腔鳞癌组PBMCs及CD4^＋T细胞对HHV-6的增殖水平显著低于HHV-6潜伏感染组与未感染组（P〈0.05）;HHV-6潜伏感染组PBMCs及CD4^＋T细胞对HHV-6的增殖水平显著低于未感染组（P〈0.05）;口腔鳞癌组外周血中CD4^＋C25^＋Treg比例明显高于HHV-6潜伏感染组与未感染组（P〈0.05）。结论口腔鳞癌患者的HHV-6特异性CD4＋T细胞增殖应答减弱,可能在口腔鳞癌的发生发展中起一定作用。     

感染了HHV-6树突状细胞在病毒转染CD4（＋）T细胞中的作用

人类疱疹病毒6型（HHV-6）是一种常见的B疱疹病毒,它主要感染CD4（＋）T淋巴细胞并大量复制。然而,HHV-6感染外周粘膜T细胞的机制还不清楚。现在发现树突状细胞（DCs）能将HHV-6转染到T细胞,导致有效感染。     

人类疱疹病毒6、7型体外感染淋巴细胞对CD抗原表达的影响

人类疱疹病毒6 、7型(HHV-6、HHV-7)是近年发现的人类疱疹病毒家族的新成员,它们对淋巴细胞具有高度的亲嗜性,同属于人类β-疱疹病毒.HHV-6根据体外生长特点,对单抗的反应性及限制性酶切图谱等方面特征又分为2种类型:A型和B型[1].本文研究了HHV-6A型株GS及我室分离的HHV-6 B型株 CN5、HHV-7YY5 3株病毒感染淋巴细胞对CD抗原表达的影响[2,3],并对其免疫机理作了初步探讨.     

人疱疹病毒6型感染和儿科临床疾病

人疱疹病毒6型(HHV-6)是在1986年由Salahuddin SZ从艾滋病人和淋巴细胞增生性疾患病人的末梢血单核细胞中分离到的。以后根据这种新发现病毒的病毒学特征，归类于疱疹病毒，称疱疹病毒6型。1988年日本科学家YarrlanishiK证实HHV-6是幼儿急疹的病原，并且HHV-6在原发感染后潜伏于人体，当人体免疫低下时可以再活化。本文简述了HHV-6的病毒学特征、感染的发病机理，概述了幼儿、儿童感染HHV-6的临床方面的研究进展。     

人类疱疹病毒6型U94/rep基因的研究进展

人类疱疹病毒6型(human herpesvirus 6,HHV-6)是一类嗜人淋巴细胞的双链DNA病毒,1986年由美国癌症中心的Salahuddin首先从淋巴增殖性疾病及获得性免疫缺陷综合症(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)患者的外周血单个核细胞中分离得到,属于人类疱疹病毒β亚家族[1].HHV-6病毒株间的DNA同源性极高,但在细胞嗜性、致病性、病毒毒力等方面存在差异,根据基因序列及抗原性差异可分为A、B两个亚型,代表株分别为GS、U1102及Z29株[2-4].HHV-6原发感染一般发生在6个月～2岁的婴幼儿,尤其是6～9个月的婴儿[5].HHV-6潜伏感染主要存在于外周血单核细胞及巨噬细胞中,当机体的免疫力低下时,潜伏状态的HHV-6可以被激活[6-7],在免疫缺陷人群(如器官移植患者等)可引发严重的病毒血症[8].我国人群中超过80％的健康成年人可在外周血单个核细胞中检测到HHV-6病毒DNA,大约5％的健康成年人体内含有抗HHV-6的IgM抗体,提示病毒处于被激活状态.     

人疱疹病毒6型感染和儿科临床疾病

人疱疹病毒6型(HHV-6)是在1986年由Salahuddin SZ[1]从艾滋病人和淋巴细胞增生性疾患病人的末梢血单核细胞中分离到的.以后根据这种新发现病毒的病毒学特征,归类于疱疹病毒,称疱疹病毒6型.1988年日本科学家YamanishiK[2]证实HHV-6是幼儿急疹的病原,并且HHV-6在原发感染后潜伏于人体,当人体免疫低下时可以再活化.本文简述了HHV-6的病毒学特征、感染的发病机理,概述了幼儿、儿童感染HHV-6的临床方面的研究进展.     

人疱疹病毒6型感染与白血病关系的初步研究

白血病是来源于造血系统的一种恶性肿瘤，好发于儿童和青少年，其病因和发病机制尚不完全清楚，但病毒病因学较受重视。人疱疹病毒6型(HHV-6)是1986年发现的疱疹病毒科中的一个新成员。研究发现，HHV-6的感染与淋巴瘤的发生有一定关系，在白血病患者中具有较高的感染率。为了探讨HHV-6感染与白血病的关系，我们采用间接免疫荧光试验(IFA)和PCR，分别检测了白血病患者血清抗HHV-6 IgG和外周血单个核细胞(PBMC)中HHV-6 DNA的序列。     

CD4+CD25+调节性T细胞抑制小鼠自身免疫性甲状腺炎的发生

目的：研究CD4^ CD25^ Treg细胞对诱导小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)的影响。方法：磁性细胞分离器(MACS)分离CD4^ CD25^ T细胞，通过体外细胞增殖试验和IFN-γ的测定研究CD4^ CD25^ T细胞对CD4^ CD25^ T细胞的免疫抑制作用，同时通过过继转移试验研究CD4^ CD25^ T细胞抑制小鼠EAT的发生。结果：MACS分离的CD4^ CD25^ T细胞纯度可达到85％～94％，特异性表达FoxP3基因，体外能明显抑制效应性T细胞的增殖和IFN-γ的产生；将CD4^ CD25^ T细胞与病理性CD25^ T细胞共同注射正常小鼠，可抑制病理性T细胞诱导EAT的发生。结论：CD4^ CD25^ Treg细胞在体内外具有明显抑制效应性T细胞的功能。     

快速诊断发热出疹婴幼儿疱疹病毒6型活动感染的研究

目的 探讨分别用共聚焦显微镜和荧光显微镜观测疱疹病毒6型(hman herpes virus type 6,HHV-6)早期抗原(IEA)的检测结果,快速诊断发热出疹婴幼儿HHV-6活动感染.方法 采集临床2岁以下发热出疹婴幼儿末梢静脉血55例,在采血当日,用间接免疫荧光法,以HHV-6 IEA/ex3兔单克降抗体,检测患儿单核细胞中的HHV-6 IEA,使用共聚焦显微镜观测结果.同时进行患儿单核细胞HHV-6病毒分离.其中44例患儿单核细胞与脐血细胞混合培养48 h再进行HHV-6 IEA检测,用普通荧光显微镜观测结果.结果 共聚焦显微镜观测采血当日HHV-6 IEA结果与病毒分离结果的符合率达92.73%,敏感度90.32%,特异度95.83%.细胞培养48 h普通荧光显微镜观测结果与病毒分离结果符合率为87.50%,敏感度77.27%,特异度100%.结论 用共聚焦显微镜在采血当日观测HHV-6 IEA,及患儿单核细胞与脐血细胞混合培养48 h用荧光显微镜观测HHV-6 IEA,可以协助临床快速诊断发热出疹婴幼儿HHV-6活动性感染.     

重组FoxP3腺相关病毒转染小鼠CD4+CD25 -T细胞的实验研究

目的：研究FoxP3（Forkhead Box P3）基因在小鼠T细胞的表达情况，以及重组FoxP3腺相关病毒（adeno-associatedvirus，AAV）对小鼠CD4^＋CD25^-T细胞功能的影响。方法：采用实时定量PCR检测CD4^＋CD25^-T细胞和CD4^＋CD25^-T细胞FoxP3 mRNA表达情况，利用基因重组技术构建FoxP3腺相关病毒载体，体外转染CD4^＋CD25^-T细胞，通过细胞增殖试验观察转染CD4^＋CD25^-T细胞功能变化。结果：CD4^＋CD25^-T细胞较CD4^＋CD25^-T相比高水平表达FoxP3基因mRNA，重组FoxP3腺相关病毒转染后的CD4^＋CD25^-T细胞对CD3单抗的刺激呈低反应性，并且能抑制新鲜分离CD4^＋CD25^-T细胞的增殖。结论：FoxP3基因转染的CD4^＋CD25^-T细胞在体外具有抑制T细胞活化增殖的功能。     

CD4~+CD25~+T细胞在ITP发病中的作用

CD4^ CD25^ T细胞是一群具有免疫抑制功能的T细胞，动物和人类实验均证实，该细胞能抑制自身反应性T、B细胞的活化增殖，以及免疫球蛋白的产生^[1]。最近的研究表明^[2-6]，CD4^ CD25^ T细胞在自身免疫性疾病中发挥着重要的作用。特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种自身免疫性血液病。为研究CD4^ CD25^ T细胞在ITP发病中的作用，现设计实验如下。     

卵巢癌细胞培养上清诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+调节性T细胞

目的研究卵巢癌细胞培养上清液是否能诱导外周血CD4^＋CD25^- T细胞转变为CD4^＋CD25^＋调节性T细胞。方法将外周血CD4^＋CD25^- T细胞分离后，对照组用CD3和CD28单抗活化，实验组在对照基础上加用卵巢癌细胞株SKOV3培养上清，72h后分离各组的CD25^＋和CD25^-T细胞，溴化脱氧尿嘧啶掺入标记法测定增殖能力及对静息的自体同源CD4^＋CD25^- T细胞的增殖抑制能力，流式细胞仪测定细胞糖皮质激素诱发型TNF受体（glucocorticoid-induced TNFR,GITR）与CTLA-4分子的表达，RT-PCR检测细胞卿mRNA的表达。结果与对照组相反，实验组的CD4^＋CD25^＋T细胞具有免疫抑制功能，自身增殖能力下降，GITR和CTLA-4分子的表达和CD4^＋CD25^＋调节性T细胞相似，并被诱导表达转录因子Foxp3 mRNA。结论卵巢癌细胞分泌的可溶性物质能诱导外周血CD4^＋CD25^-T细胞转化为CD4^＋CD25^＋调节性T细胞。     

利用多种表面标志鉴别正常人外周血初始和记忆T细胞亚群

目的探索能够准确鉴别初始和记忆T细胞亚群的表面标志及其关联性。方法自正常人静脉血中分离PBMCs，同时加入9种不同标记的抗体，进行染色，利用流式细胞仪检测，并分析结果。结果CD45RA^＋CD4^＋T细胞均表达CD27、CCR7、CD28和CD62L，而在CD45BA^-CD4^＋T细胞中，约有75％的细胞表达CD27，30％为CCR5^＋，90％为CCR7^＋，99％为CD28^＋，70％为CD62L^＋。与其相一致的是在CD62L^＋CD4^＋T细胞中，大约60％的细胞为CD45RA^＋，但CD62L^-CD4^＋T细胞中，大约95％的细胞为CD45RA^-。在CD8^＋T细胞中，大约有78％的细胞为CD45RA^＋，其余为CD45RA^-。CD45BA^＋CD8^＋T细胞的表型与CD45BA^＋CD4^＋T细胞基本相似。结论同时检测多种T细胞表面标志，深入了解T细胞各亚群的表型特征，对疾病的诊断、治疗、预后判断以及疫苗的设计和效果评价具有重要的指导意义。     

脐血CD34+细胞体外定向诱导分化为T淋巴细胞的实验研究

目的：建立利用人造血干／祖细胞体外定向诱导分化为T淋巴细胞的方法，为研究T细胞生物学特性及细胞免疫提供技术平台。方法：MACS方法分离人脐带CD34^ 细胞接种到人胎儿胸腺基质单层细胞上，IMDM液体培养基含20％人AB血清并加入FL、IL-12、IL-7和IL-2细胞因子组合，于培养7、14、21、28、35、42天取非贴壁细胞利用流式细胞仪对细胞表型进行检测，并进行细胞形态学分析。结果：2周后，CD4^ CD8^ 非成熟T淋巴细胞占细胞总数的0．3％-13．3％，4-5周CD4^ CD8^ T淋巴细胞达到高峰占16．6％-26．5％，且CD3^ CD4^ CD8^ 和CD3^ CD4^-CD8^ T淋巴细胞逐渐增多，6周后达26．5％～64．9％和11．6％-38．9％。培养成熟的T淋巴细胞经PHA IL-2刺激后瑞氏染色鉴定可见大原始淋巴细胞存在。结论：利用人脐血CD34^ 在体外人胎儿胸腺基质单层细胞上加FL、IL-12、IL-7和IL-2细胞因子组合条件下，可诱导分化出T淋巴细胞，并且培养的T细胞对有丝分裂素刺激有增殖反应。     

CD4^＋CD25^＋T细胞：一类新被认识的免疫调节细胞

CD4^ CD25^ T细胞是最近才被认识的一类免疫调节细胞，在胸腺产生，主要发挥抑制性免疫调节功能，表达IL-10mRNA，细胞表面表达IL-2受体α链(CD25)，本身不产生IL-2，但在体内、外增殖需要外源性IL-2，在体外为无能细胞(anergy cell)，CD4^ CD25^ T细胞发挥免疫抑制作用是通过细胞-细胞接触依赖方式而非细胞因子依赖方式，CD4^ CD25^ T细胞在调控自身免疫性疾病的发生、炎症反应和T细胞稳态中发挥重要作用。本文拟对CD4^ CD25^ T细胞的生物学特性及其应用研究的最新进展作一综述。     

感染HIV的T细胞触发自身免疫反应

CD4^＋T细胞的死亡是HIV—1感染的特征之一。早期的研究认为：CD4分子是一种受体，当HIV—1病毒包膜与之结合后就可以使HIV—1病毒进入T细胞，导致CD4^＋T细胞的死亡。随后却发现，HIV感染程度并不能解释CD4^＋T细胞的大量减少，例如：逆转录病毒HIV-2和HTLV—1感染CD4^＋T细胞的过程与HIV—1极为相似，但大多数感染并没有表现出明显的免疫功能减退。     

脐血体外同时扩增造血干祖细胞、T细胞及树突状细胞

目的：探索体外同时扩增脐血中造血干祖细胞、T细胞及树突状细胞的可能性和最佳细胞因子组合方案。方法：采集健康正常足月产新生儿脐血，分离出单个核细胞，在不同的细胞因子组合作用下培养14天。培养于0、3、7和14天时收集细胞，用FCM分析扩增前后脐血CD34^＋、CD3^＋T及DCs细胞含量。结果：3组不同细胞因子组合实验组A：SCF＋IL-3，6；B：SCF＋IL-3，6，4；c：SCF＋IL-3，6，4（5X）均能显著扩增脐血中的单个核细胞和CD34’细胞，各组的CD34^＋细胞最高值出现在第7天，CD34^＋细胞平均增加倍数10—20倍不等。在扩增初期，各组CD3^＋T有所下降，7天时CD3^＋T细胞有不同程度的增加，14天时扩增最高的组别中CD3^＋T细胞是新鲜脐血的2倍。DCs标志CD1a、CDS0、CD83和CD86。在所有组别中培养3天时有所下降，第7天时在含IL4的组别中有显著上升，且CD1a和CD80表达高于CD83和CD86；14天时则有所回落。IL4对CD34^＋和CD3^＋T细胞扩增有一定促进作用。结论：脐血中T细胞、DC细胞在一定细胞因子组合下。可与CD34^＋细胞同时在体外被扩增和诱导分化。     

SEB诱导的CD4+ T细胞无能、凋亡及MHC-I类分子表达下调

目的：探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素（SEB）体外诱导外周T细胞免疫耐受的作用机制。方法：采用SEB体外刺激C57BL/6J（B6）小鼠的脾细胞后，以MTT比色法检测脾细胞的增殖，并用PI染色后以流式细胞术（FCM）分析不同时间段处于S期，G0-G1期的细胞及无能T细胞的凋亡，测定T细胞亚群及MHC-I（H-2K^b)表达的变化。用琼脂糖凝胶电泳，观察不同时间段凋亡T细胞的DNA特征。结果：部分去除CD8^ T细胞后。SEB可刺激B6小鼠脾细胞中CD4^ T细胞大量增殖，在SEB刺激后第3天，CD4^ T细胞中处于S期的比率最大，此后开始下降；而处于G0-G1期的CD4^ T细胞变化则相反，在初次刺激后第3天，增殖的CD4^ T细胞出现无能，FCM检测及用琼脂糖凝胶电泳检查DNAladder证实，在第7天，无能CD4^ T细胞出现凋亡，且凋亡细胞的比率逐渐增多，不因加入抗CD3抗体或CoN A而逆转，在SEB刺激后，CD4^ T细胞表面MHC-I类分子（H-2K^b)的表达，随细胞无能的出现而明显下调。结论：SEB诱导的T细胞免疫耐受，可能与CD4^ T细胞的无能，凋亡及细胞表面分子MHC-I的表达下调有关。     

肺癌与多瘤病毒和疱疹病毒感染关系的初步研究

目的探讨常见多瘤病毒和疱疹病毒感染与肺癌的关系。方法巢式PCR检测26例肺癌样本和10例非瘤肺部样本中的BK多瘤病毒、JC多瘤病毒、疱疹病毒HHV-6、HHV-7、HHV-8和EB病毒的存在情况。结果肺癌组织中HHV-6、HHV-7和EB病毒DNA阳性率分别为17.4%、13.0%和60.9%,非瘤肺部样本中HHV-6、HHV-7和EB病毒DNA阳性率分别为0、12.5%和12.5%。在肺癌组织的EB病毒感染与非瘤组织EB病毒感染存在显著性差异(P0.05)。所有样本中均未检出BK多瘤病毒、JC多瘤病毒和HHV-8 DNA。结论 EB病毒在肺癌和非瘤肺组织的表达存在显著性差异,肺癌组织的EB病毒的感染在肺癌患者中普遍存在,可能对肺癌患者的治疗和预后有一定影响。