从Cohn法组份Ⅳ中分离纯化人血浆蛋白C

目的探索建立1种串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化蛋白C的方法 ,降低纯化蛋白C的成本,并实现血浆的综合利用。方法 4℃条件下,将Cohn法组份Ⅳ用PBS缓冲液抽提5h,离心(6500g)40min,上清液依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤后,超滤透析;再通过串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析,对蛋白C进行纯化。通过SDS-PAGE鉴定蛋白C的纯度;用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;通过WHO指定的发色底物法和凝固法(一期法)测定蛋白C活性。结果纯化的蛋白C在SDS-PAGE图谱上呈现1条62kD左右的蛋白带;经过离子交换层析,蛋白C的活性回收率为(48.19±9.22)%,纯化倍数为(3.75±0.56)倍;固相化金属螯合亲和层析后,蛋白C活性回收率为(59.61±5.59)%,纯化倍数为(36.79±3.72)倍;蛋白C总活性回收率为(28.77±9.45)%,纯化倍数为(136.64±6.82)倍,比活性为(11.70±0.89)IU/mg。结论串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析可以从Cohn法组份Ⅳ中获得比活性较高的蛋白C浓缩物。     

人成釉蛋白抗体的制备及组织表达特异性

目的:制备抗人成釉蛋白抗体,观察成釉蛋白在各组织中的表达。方法:实验于2002-03在解放军第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室完成。以重组、纯化的成釉蛋白C端肽为抗原,混入完全/不完全弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔,经5次免疫后,颈动脉取血,分离血清并用饱和硫酸铵纯化,制备兔抗人成釉蛋白多克隆抗体,用双向免疫扩散试验和ELISA检测抗体的效价。用WesternBlot检测人成釉蛋白的组织表达特异性。结果:①ELISA检测结果:表明兔抗人成釉蛋白多克隆抗体效价达到1∶10000。②WesternBlot显示:成釉蛋白在人牙胚组织总蛋白中有特异性表达,相对分子质量约为65000,在脑、心、肝、脾、肺、肾、胰腺、胸腺、骨骼肌等组织中未见表达条带。结论:制备了抗人成釉蛋白抗体,为研究成釉蛋白在人牙胚中的组织表达以及利用抗体纯化蛋白提供了基础,从蛋白水平证实成釉蛋白为牙胚组织特异性蛋白,并证实人牙胚组织中的成釉蛋白相对分子质量约为65000。     

重组人干细胞因子-血小板生成素融合蛋白的表达及活性初步研究

目的研究重组人干细胞因子-血小板生成素(SCF-TPO)融合蛋白表达的最佳条件及其生物学活性。方法设计引物，利用RT—PCR从胎肝细胞中扩增到SCF和TPO氨基端功能区片段，采用基因融合新策略将其融合成SCF-TPO融合基因，克隆到pGEM—T载体中，构建pET32a／SCF-TPO融合基因原核表达载体，在宿主菌E.eoliBL21(DE3)plysS中经异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导其高表达SCF-TPO，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot检测。目的蛋白经包涵体变性，金属螯合层析纯化，透析复性，用细胞因子依赖细胞系MO7e进行细胞增殖实验。结果获得SCF-TPO融合基因的高表达，表达量占菌体总蛋白的30％以上。Western blot法鉴定表达正确，MTT法证明该融合蛋白具有细胞增殖活性，浓度为100ng／ml时刺激活性更强。结论表达并复性后的重组人SCF-TPO融合蛋白具有刺激MO7e细胞生长活性。     

人体肝脏核糖核酸酶的纯化、特征及放射免疫测定

多种疾病能导致血清核糖核酸酶(RNase)活性升高。目前血清核糖核酸酶浓度的测定采用酶学方法。但该法不能区分核糖核酸酶的来源。本文用肝素亲和层析等一系列技术来纯化人肝核糖核酸酶,并用此制剂首次建立了一种敏感、特异而且重复性好的人肝RNase放射免疫测定法。人肝RNase的纯化及其特征通过缓冲液抽提、酸分离、磷酸纤维素柱层析、Sephadex G-150和Sephadex G-100凝胶层析、聚鸟嘌岭核苷酸亲和层析和肝素亲和层析等步骤,从人肝脏组织中提取并纯化了核糖核酸酶。纯化后的人肝核糖核酸酶在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈单一的狭窄区带;在pH4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈单一的,但略为扩散的区带。酶活性和蛋白区带相吻合。该酶由SDS聚丙烯酰胺电泳测     

新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的分离纯化

为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线，比较了不同组合的纯化策略和条件，包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等，并采用MTT法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性。结果表明，在反相层析分离中疏水相分别采用了常规的甲醇和乙腈．结果为所分离的该重组融合蛋白均发生了变性，从色谱柱中分离出来就生成了絮状沉淀。在蓝染料亲和层析一步分离中，由于全菌体蛋白中与亲和树脂发生非特异结合的成分较多，极难区分目的蛋白和杂蛋白。但是，PRSETA—B7-2-PE40KDEL表达载体上带有翻译增强序列T7-g10，可在表达目的蛋白N端融合6个组氨酸，这十分有利于通过Ni—NTA金属鏊和层析法快速高纯度地纯化表达产物。根据这一特性，经反复筛选实验设计最终确定了金属螯合层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步法的纯化路线，用于纯化分离B7—2-PE40KDEL融合蛋白。所得的目的蛋白的纯度可达95％以上，总回收率为8％。Western—blot实验显示，所得蛋白可与B7-2及PEA抗体特异性结合；MTT生物活性测定表明，该融合蛋白对表达CD28受体的人T细胞系Jurkat产生特异性杀伤作用，而对不表达CD28的淋巴细胞系Raji无任何杀伤作用。结论：建立了高效快速纯化大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技术路线，所纯化的重组B7—2-PE40KDEL融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T细胞。     

亲和层析法分离纯化人心肌肌钙蛋白Ⅰ

目的从人心肌组织提取纯化心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）。方法采用离子交换层析和疏水层析从兔骨骼肌中提纯肌钙蛋白C（TnC）,制备连接有TnC的亲和层析介质,通过亲和层析法从人心肌组织中直接提纯cTnI。纯化的cTnI采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹法进行鉴定。结果从10 g人心肌组织中共提纯2.44 mg cTnI,SDS-PAGE图上显示为单一条带,表观相对分子质量约为29000。免疫印迹法结果表明cTnI单克隆抗体能够特异性识别提纯的cTnI,纯化的cTnI SDS-PAGE和免疫印迹法结果均与商品化cTnI结果一致。结论具有免疫活性的天然cTnI的获取有助于急性心肌梗死诊断试剂盒的研制。     

亲和层析法分离纯化人心肌肌钙蛋白Ⅰ

目的从人心肌组织提取纯化心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)。方法采用离子交换层析和疏水层析从兔骨骼肌中提纯肌钙蛋白C(TnC),制备连接有TnC的亲和层析介质,通过亲和层析法从人心肌组织中直接提纯cTnI。纯化的cTnI采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法进行鉴定。结果从10 g人心肌组织中共提纯2.44 mg cTnI,SDS-PAGE图上显示为单一条带,表观相对分子质量约为29000。免疫印迹法结果表明cTnI单克隆抗体能够特异性识别提纯的cTnI,纯化的cTnI SDS-PAGE和免疫印迹法结果均与商品化cTnI结果一致。结论具有免疫活性的天然cTnI的获取有助于急性心肌梗死诊断试剂盒的研制。     

人胰腺α-淀粉酶的cDNA克隆和原核表达的初步研究

目的 获得人胰腺α-淀粉酶(AMY2A)基因并进行原核表达。方法 采用基因工程技术,根据人AMY2A基因序列设计并合成特异性引物;从人胰腺组织中提取总RNA,反转录成CDNA第一链;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人胰腺AMY2A基因,经BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切、连接并插入原核表达载体pGEX-5T,构建pGEX-5T-AMY2A重组表达载体,在大肠杆菌BL21中异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达AMY2A蛋白。包涵体经尿素变性、复性及谷胱苷肽琼脂糖柱亲和层析纯化、AMY2A酶活性测定和免疫印迹分析。结果 重组质粒测序和酶切结果显示AMY2A基因已正确插入pGEX-5T,重组蛋白、复性及纯化产物SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在84 000处有一条明显的蛋白表达条带,AMY2A检测具有酶活性,免疫印迹分析表明重组蛋白具有人胰腺淀粉酶抗原性。结论 作者已克隆并在大肠杆菌中初步表达并获得纯化的谷胱苷肽转移酶(GST)-AMY2A融合蛋白。     

人血浆蛋白S成熟肽基因在大肠杆菌中的融合表达

目的 构建人血浆蛋白S的原核表达载体并诱导其表达。方法 自行设计引物，采用PCR法，以现有人血浆蛋白S真核表达载体为模板，扩增人血浆蛋白S成熟肽的编码序列。PCR产物经EcoRI和BamHI双酶切后，克隆至GST融合表达载体pGEX-2T中，在E．coli BL21中诱导GST-人血浆蛋白S融合蛋白的表达。结果 对重组质粒的序列分析表明，插入片段的序列与Gen Bank登录的人血浆蛋白S基因编码序列完全一致。10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达分子量约为96kD的产物．并可通过GST亲和层析柱纯化。结论 人血浆蛋白S编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-2T，并在E．coli BL21中获得表达。     

人D-二聚体分离纯化及鉴定

目的 分离纯度较高和人D-二聚体(D-dimer),为制备抗人D-二聚体单克隆抗体提供可靠抗原.方法 以凝血酶、凝血因子Ⅻ等处理人纤维蛋白原,得到交联纤维蛋白,经纤溶酶消化,得到交联纤维蛋白降解产物(FDP);对FDP作Sephacryl S-300凝胶过滤层析和聚焦层析,分离纯化得到D-dimer.采用免疫比浊法测定D-dimer 含量、染料结合法测定纯化蛋白含量,以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察D-dimer的纯化情况,Weston Blot法确认D-dimer的存在.结果 制备得到的FDP SDS-PAGE图谱显示有多条蛋白条带,1条分子量为180 ～250kD蛋白条带在Western Blot图谱中显示可以被D-dimer单克隆抗体特异性地识别.FDP经Sephacry S-300凝胶层析和聚焦层析后得到纯度较高的D-dimer(n=3):总蛋白含量比为(77.82±7.98)％,蛋白回收率(25.27±6.35)％;SDS-PAGE图谱显示:经过两步层析得到的终产物为分子量180～250 kD的蛋白;Westem Blot证实:经过Sephacryl S-300凝胶层析和聚焦层析处理,最终得到分子量为180～250 kD的终产物可被D-dimer单克隆抗体特异性识别.结论 采用Sephacryl S-300凝胶层析和聚焦层析能够分离纯化获得较高纯度的D-dimer,可作为制备D-dimer单克隆抗体的抗原.     

The characteristics of interpretation of results of analysis of protein amount in urine of pregnant women

The adequacy of implementation of present proteinuria diagnostic thresholds under examination of pregnant women was examined. The analysis was applied to all urine samples of pregnant women from December 2009 to March 20010. The amount of protein in urine was concurrently evaluated by turbidimetric analysis with sulfosalicylic acid, colorimetric analysis with pyrogallol red, "dry chemistry" technology (the diagnostic strips). It is established that the mentioned techniques of analysis of protein in urine provide independent results. The results of colorimetric analysis are characterized by better precision and adequacy. However, in case of pregnant women the diagnostic threshold of protein concentration should be shifted from 0.120 to 0.150 g/l.     

超声评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响

目的 探讨超声在评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响的价值。方法 回顾性收集经病理学证实为头颈部肿瘤、放疗前后的颈动脉超声资料以及其他基线资料完整的患者93例,比较放疗前后放疗侧颈动脉和非放疗侧颈动脉粥样硬化斑块和溃疡斑块的总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积。结果 放疗前后颈动脉超声检查的平均间隔时间为（6.1±1.9）年;放疗前放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积与非放疗侧比较差异均无统计学意义（P均>0.05）;放疗后放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积均较非放疗侧加重,差异有统计学意义（P均<0.05）。结论 放疗可导致头颈部肿瘤患者颈动脉粥样硬化斑块的形成和进展,且斑块具有易损性特点。     

《中国内镜杂志》主编雷光华教授简介

雷光华男,1970年12月生,骨科学博士,一级主任医师,二级教授,博士生/后导师。国家"万人计划"领军人才,教育部"长江学者"特聘教授,科技部"中青年科技创新领军人才",国家卫生计生突出贡献中青年专家,享受国务院政府特殊津贴专家,国家临床重点专科骨科和运动医学学科带头人,全国青年岗位能手,湖南省"芙蓉学者"特聘教授,湖南省科技领军人才和骨科学科领军人才,湖南省普通高校学科带头人,湖南省首届"优秀科技工作者",中南大学"湘雅名医"。     

超声诊断主动脉窦瘤

本文报告31例主动脉窦瘤患者,全部用二维超声(2DE)和多普勒超声检查。其中手术治疗24例,超声符合22例,符合率为92％。误诊2例,误诊率为8％。故超声实际诊断主动脉窦瘤29例中右冠窦瘤18例(62％),无冠窦瘤7例(24％),二叶瓣型主动脉窦瘤4例(14％)。窦瘤破入/膨入右室和右房内的例数分别为16例和13例。本病主要的合并症为主动脉瓣关闭不全和室缺。通过分析我们认为二维加多普勒超声是诊断主动脉窦瘤最有价值的无创技术。