雌二醇对乳腺癌假体植入术后表皮葡萄球菌生物膜形成的影响研究

目的探讨雌二醇对乳腺癌术后假体表面表皮葡萄球菌生长以及生物膜形成能力及其结构的影响。方法取表皮葡萄球菌标准株ATCC35984,调整浓度至1×107 CFU/m L或1×108 CFU/m L,与硅胶片和终浓度为125 pmol/L的雌二醇混合培养,制备硅胶材料表面细菌生物膜体外模型。于培养后4、6、12、24、48、72 h,采用结晶紫染色半定量检测硅胶材料表面细菌生物膜形成能力,XTT法检测硅胶材料表面细菌生长动力;根据以上检测结果,选择细菌悬液实验浓度。取实验浓度表皮葡萄球菌ATCC35984悬液以及终浓度为50、125、250、500 pmol/L的雌二醇悬液,分别与硅胶片混合培养制备生物膜体外模型,以未添加雌二醇悬液(0 pmol/L)作为对照;另取实验浓度表皮葡萄球菌ATCC12228悬液,同法制备模型,作为阴性对照。于培养后4、6、12、24、48、72 h同上法检测硅胶材料表面细菌生长动力及生物膜形成能力,扫描电镜观察硅胶材料表面细菌生物膜超微结构;培养6、12、24 h激光共聚焦显微镜观察硅胶材料表面细菌生物膜厚度。结果根据XTT法及结晶紫染色半定量检测结果,选择浓度为1×107 CFU/m L细菌悬液进行实验。XTT法检测示,ATCC12228和ATCC35984菌株分别在4、6、12、24、72 h和4、6、24、72 h时,其125、250、500 pmol/L组细菌生长速度快于0、50 pmol/L组(P0.05),4、6、72 h时500 pmol/L组快于125、250 pmol/L组(P0.05),72 h时250 pmol/L组快于125 pmol/L组(P0.05),其余组间比较差异无统计学意义(P0.05);同一时间点两种菌株相同雌二醇浓度组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结晶紫染色半定量检测:各时间点ATCC12228菌株各雌二醇浓度组生物膜形成均为阴性。而ATCC35984菌株培养4 h即有生物膜形成,随时间延长逐渐增厚,24 h时达峰值;培养4、6 h,0 pmol/L组生物膜厚度大于125、250、500 pmol/L组(P0.05);12 h开始125 pmol/L组生物膜最厚,与其他组比较差异均有统计学意义(P0.05)。激光共聚焦显微镜观察示,ATCC35984菌株在培养6 h时125、250、500 pmol/L组的生物膜厚度小于0、50 pmol/L组(P0.05),其余组间比较差异无统计学意义(P0.05);之后各组生物膜厚度逐渐增加,12、24 h时125 pmol/L组生物膜厚度明显大于其他浓度组(P0.05)。扫描电镜观察示,各时间点与其他浓度组相比,125 pmol/L组形成的生物膜结构范围最广,结构最致密、最丰富、层次最多。结论高浓度雌二醇可促进表皮葡萄球菌生长、生物膜形成和生物膜的成熟。     

溴代呋喃酮对胸心外科聚氯乙烯材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影响

目的探讨溴代呋喃酮对胸心外科聚氯乙烯(PVC)材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影响,为生物材料表面改性研究及临床生物材料植入感染的防治提供新思路。方法选用化学结构具有代表性的三种溴代呋喃酮分为3组,呋喃酮1组:3,4-二溴基-5-羟基-呋喃酮;呋喃酮2组:4-溴-5-(4-甲氧基苯基)-3-(甲氨基)-呋喃酮;呋喃酮3组:3,4-二溴基-5,5-二甲苯基-2(5H)-呋喃酮;对照组:PVC材料用酒精浸泡5min;分别对4组PVC材料进行表面涂层改性,将改性过的PVC材料与表皮葡萄球菌共同培育;分别于培养6h、12h、18h和24h时用激光共聚焦显微镜动态观察PVC材料表面细菌群落及细菌生物膜厚度的形成,扫描电子显微镜观察PVC材料表面细菌生物膜表面结构。结果激光共聚焦显微镜观测结果显示:呋喃酮2组各时间点PVC材料表面表皮葡萄球菌群落数量和细菌生物膜厚度明显小于对照组(P0.05),呋喃酮1组、呋喃酮3组表皮葡萄球菌群落数量和细菌生物膜厚度与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。扫描电子显微镜观察显示:与对照组比较,呋喃酮2组6h时PVC材料表面细菌群落附着数量较少;18h时对照组PVC材料表面细菌生物膜结构初步形成,而呋喃酮2组无明显细菌生物膜结构形成。结论不同溴代呋喃酮对PVC材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影响不同,呋喃酮2可以抑制PVC材料表面表皮葡萄球菌群落数量和细菌生物膜厚度的形成。     

医源性表皮葡萄球菌胞间黏附素基因操纵子在聚氯乙烯材料表面细菌生物膜形成中的作用研究

目的表皮葡萄球菌胞间黏附素基因(intercellar adhesion,ica)是细菌聚集的关键因子,通过分析医源性表皮葡萄球菌生物膜基因型,探讨ica操纵子在聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)材料表面细菌生物膜形成中的作用。方法取56株医源性表皮葡萄球菌临床分离株,应用PCR法、基因测序技术检测细菌生物膜形成相关基因,包括16S rRNA、自溶素(autolysin,atlE)、纤维蛋白原结合蛋白(fi brinogen binding protein,fbe)以及ica。取医源性表皮葡萄球菌制备浓度为1×105cfu/mL的细菌悬液,并根据目的基因检测结果,分别以icaADB、atlE、fbe阳性基因型(ica操纵子阳性组)以及icaADB阴性而atlE、fbe阳性基因型(ica操纵子阴性组)与PVC材料培养。于6、12、18、24、30h各取2个PVC材料,进行激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察,测量单位视野细菌群落数量及形成的细菌生物膜厚度。结果目的基因检测示,医源性表皮葡萄球菌16S rRNA阳性率为100%(56/56);icaADB、atlE、fbe阳性基因型菌株占57.1%(32/56);icaADB阴性而atlE、fbe阳性基因型菌株占37.5%(21/56)。测序结果示,目的基因16S rRNA、atlE、fbe、icaADB扩增产物序列分别与GenBank中基因序列相符。随时间延长,ica操纵子阴性组的PVC材料表面无明显细菌生物膜形成;ica操纵子阳性组的PVC材料表面细菌群落数量逐渐增多,细菌生物膜体积逐渐增大,24h时可见成熟的细菌生物膜结构,30h时细菌生物膜体积趋于稳定。培养各时间点ica操纵子阳性组PVC材料表面单位视野细菌群落数量(F=435.987,P=0.000)及细菌生物膜厚度(F=6714.395,P=0.000)明显高于ica操纵子阴性组,差异均有统计学意义。结论医源性表皮葡萄球菌可以分为ica操纵子阴性和ica操纵子阳性两类细菌;ica操纵子可以增加PVC材料表面细菌生物膜的形成能力、细菌群落数量及细菌生物膜厚度,在PVC材料表面细菌生物膜形成中具有重要作用。     

聚氯乙烯材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜结构观察

目的建立聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜体外模型,观察混合生物膜的形成与微观结构。方法取表皮葡萄球菌(ATCC35984)与白色念珠菌(ATCC10231),分别制备浓度为1×106 CFU/m L的悬液并混合后,与直径0.5 cm PVC膜在胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth,TSB)培养基中共培养形成混合生物膜(实验组)。培养2、6、12、24、48、72 h时取PVC膜,激光共聚焦显微镜检测生物膜厚度、单位视野菌落数,并于48 h时测量生物膜内活菌百分比、三维重建PVC膜表面生物膜图像;扫描电镜观察各时间点混合生物膜结构。以单纯PVC膜置于TSB培养基中培养作为对照组。结果对照组各时间点PVC材料表面无病原菌黏附。实验组激光共聚焦显微镜观察示,培养6 h时可见菌落及生物膜形成,随时间延长均逐渐增加,24 h时菌落达高峰,48 h时生物膜厚度达峰值。实验组PVC膜表面菌落数比较,2、6、24 h间以及2、6 h与48、72 h间比较差异有统计学意义(P0.05),24、48、72 h间比较差异无统计学意义(P0.05);生物膜厚度除48、72 h间比较差异无统计学意义外(P0.05),其余各时间点间比较差异均有统计学意义(P0.05)。培养48 h时,混合生物膜外层活菌百分比明显高于内层及中间层(P0.05)。三维重建显示混合生物膜表面凹凸不平,突起部分活菌数量较多。扫描电镜观察示,实验组随培养时间增加,PVC膜表面白色念珠菌由孢子状逐渐伸长出现假丝状及菌丝状,表皮葡萄球菌黏附于白色念珠菌周围,逐渐形成复杂的多层次网状混合生物膜。结论白色念珠菌-葡萄球菌混合培养可在PVC材料表面形成结构复杂的混合生物膜,激光共聚焦显微镜、扫描电镜与三维图像重建技术的结合是研究混合生物膜的理想方法。     

宁泌泰胶囊对葡萄球菌和大肠杆菌及其生物膜体外形成抑制作用的研究

目的:评估宁泌泰胶囊对葡萄球菌和大肠杆菌增殖以及体外培养生物膜的抑制作用。方法:使用梯度稀释法检测表皮葡萄球菌(1457),金黄色葡萄球菌(NCTC8325-4、Newman、MU50),大肠埃希菌(ATCC25922、CFT073)对宁泌泰的最低抑菌浓度(MIC);使用扫描电镜,观察不同浓度的宁泌泰对表皮葡萄球菌1457、金黄色葡萄球菌NCTC8325-4,以及大肠埃希菌CFT073和ATCC25922生物膜形成的影响。结果:MIC检测结果显示,宁泌泰对表皮葡萄球菌1457、金黄色葡萄球菌NCTC8325-4、Newman、MU50以及大肠埃希菌ATCC25922和CFT073均具有抑制效果,MIC为20 mg/ml;扫描电镜结果显示,宁泌泰能够抑制表皮葡萄球菌1457、金黄色葡萄球菌NCTC8325-4,以及大肠埃希菌CFT073和ATCC25922体外生物膜的形成。结论:宁泌泰胶囊既能够抑制葡萄球菌和大肠杆菌的增殖,也能够抑制其生物膜的形成,具有较为全面的抗细菌效果。     

表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因在表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成中的作用研究

目的探讨表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因——胞间黏附素A(intercellular adhesion A,ica A)基因、纤维蛋白原结合蛋白(fibrinogen binding protein,fbe)基因、聚集相关蛋白(accumulation-associated protein,aap)基因在表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成中的作用。方法实验分为3组,用表皮葡萄球菌标准株ATCC35984(表葡组)及白假丝酵母菌标准株ATCC10231(白念组)分别培养及混合培养(混合组),建立表皮葡萄球菌、白假丝酵母菌及二者混合生长的体外生物膜模型。于培养2、4、6、8、12、24、48、72 h,采用结晶紫染色法半定量检测生物膜形成能力,二甲氧唑黄[(2,3 bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)5〔(phenylamino)Carbonyl〕2H-tetrazolium hydroxide assay,XTT]比色法评价生物膜体外生长动力学;24、72 h扫描电镜观察生物膜超微结构。荧光定量PCR分析培养72 h表葡组及混合组ica A、fbe、aap基因表达情况。结果结晶紫染色法生物膜半定量检测示,混合组和表葡组均在培养12 h生物膜明显增厚,72 h混合组超过表葡组,组间比较除72 h外,其余各时间点两组比较差异均有统计学意义(P0.05);白念组12 h出现生物膜的生长,在整个培养周期白念组生物膜厚度均低于混合组(P0.05)。XTT比色法生长动力学检测示,混合组整体生长速度快于白念组,且48 h后超过表葡组;混合组与表葡组除12 h差异有统计学意义(P0.05)外,其余各时间点比较差异均无统计学意义(P0.05);混合组培养2、4 h时A值低于白念组,但比较差异无统计学意义(P0.05);6 h后各时间点A值均显著高于白念组(P0.05)。扫描电镜观察示,随培养时间延长各组均形成结构复杂、成熟的生物膜。培养72 h荧光定量PCR检测示,与表葡组相比,混合组fbe、ica A、aap基因表达量分别增高1.93、1.52、1.46倍,差异均有统计学意义(P0.05)。结论表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生长能形成比单一微生物结构更复杂的混合生物膜;混合生物膜较单一微生物生物膜更厚,可能与表皮葡萄球菌ica A、aap、fbe基因表达增加有关。     

烧伤患者深静脉导管细菌生物膜的形成及意义

目的 了解烧伤感染后金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌在深静脉导管中形成生物膜的过程.方法 选择2008年11月-2009年8月在笔者单位住院的20例烧伤患者深静脉导管分离的细菌,分别与各自的标准菌株对照.深静脉导管尖端行扫描电子显微镜(SEM)观察.将菌株体外培养12、24、48、72 h和5 d后,进行细菌生物膜半定量黏附试验测定,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)双荧光染色观察并测定生物膜厚度.对数据进行团体t检验.结果 深静脉导管分离的菌株为金黄色葡萄球菌6株、鲍氏不动杆菌8株、铜绿假单胞菌6株,均为耐药菌株.SEM下可见深静脉导管内层表面形态多样、程度不一的生物膜.细菌被大量胞外多糖复合物包埋、彼此粘连融合成片状,生物膜呈团状聚集,形成立体多样结构,结构内可见少量红细胞,少数细菌被不完全包埋,尚可见黏着的菌体.深静脉导管内分离的金黄色葡萄球菌体外培养24、48及72 h的吸光度值大于界定值;鲍氏不动杆菌培养12、24、48和72 h,吸光度值均大于界定值;铜绿假单胞菌培养48 h后,吸光度值开始大于界定值.CLSM观察可见,培养24 h时,除铜绿假单胞菌标准株外,其余菌株均有散在的绿色荧光,不密集,多数靠近培养皿基底部,红色荧光充满视野.48 h时绿色荧光明显增多,从基底部向上扩延,部分与红色荧光重叠,形成视野中黄色荧光,鲍氏不动杆菌最明显,其次是金黄色葡萄球菌.在绿色荧光的强度和分布上,临床菌株明显多于标准株.培养72 h时铜绿假单胞菌和其标准株的绿色荧光增多,其他菌株图像中黄色荧光布满视野.培养5 d时绿色荧光较分散,以靠近基底部较明显.金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌在培养后48 h形成成熟的生物膜,铜绿假单胞菌则在72h.培养后72 h鲍氏不动杆菌的生物膜厚度为(18.2±3.6)μm,大于标准菌的(9.4±2.6)μm(t=5.42,P<0.05),是3种菌中生物膜最厚者.结论 烧伤临床常见的金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌均能在深静脉导管内形成生物膜,其耐药菌株牛物膜形成能力和程度均大于普通菌株,以鲍氏不动杆菌尤为明显,成为烧伤后导管相关性感染的重要原因.     

宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用

目的:检测宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌体外培养生物膜的抑制作用,探讨其抗菌机制。方法:体外培养表皮葡萄球菌产膜菌株,使用半定量粘附实验结晶紫染色法及刚果红实验检测,评估宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用。宁泌泰胶囊处理后,检测表皮葡萄球菌对氧化胁迫耐受及抗生素敏感性(最小抑菌浓度)的变化,并通过实时荧光定量PCR检测氧化应激响应基因serp2195和gpx A-2转录水平变化。结果:结晶紫染色法显示,宁泌泰胶囊能够显著抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成(P0.001),刚果红实验结果与此一致。在宁泌泰胶囊20 mg/m L浓度条件下,表皮葡萄球菌对氧化胁迫耐受性减弱了8倍,对氯霉素及红霉素敏感性均增强了4倍;实时荧光定量PCR显示,与阴性对照组相比氧化应激响应基因serp2195和gpx A-2转录水平分别降低至22.9%和24.5%。结论:宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜具有显著抑制作用,减弱细菌对氧化胁迫耐受性,其机制可能通过下调表皮葡萄球菌氧化应激响应基因serp2195和gpx A-2表达水平实现;同时宁泌泰胶囊可以减弱表皮葡萄球菌对抗生素耐药性。     

溴代呋喃酮对聚氯乙烯材料表面大肠杆菌生物膜形成的影响

目的探讨不同溴代呋喃酮对聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)材料表面大肠杆菌生物膜形成的影响,为生物材料表面改性研究及临床生物材料植入感染的防治提供新思路。方法选用具有化学结构代表性的3种溴代呋喃酮,溴代呋喃酮1:3,4-二溴基-5-羟基-呋喃酮,溴代呋喃酮2:4-溴-5-(4-甲氧基苯基)-3-(甲氨基)-呋喃酮,溴代呋喃酮3:3,4-二溴基-5,5-二甲苯基-2(5H)-呋喃酮,分别对PVC材料片(1cm×1cm)进行表面涂层改性,将改性后的PVC材料片与大肠杆菌共同培养;将PVC材料片用75%乙醇浸泡5min后与大肠杆菌共同培养作为对照组。分别于培养6、12、18、24h,采用激光共聚焦显微镜动态观测PVC材料表面单位面积细菌群落数及细菌群落厚度,扫描电镜观察PVC材料表面细菌生物膜表面结构。结果激光共聚焦显微镜观测显示,各时间点溴代呋喃酮3组PVC材料表面单位面积细菌群落数以及细菌群落厚度均小于对照组,差异有统计学意义(P0.05);而溴代呋喃酮1组和溴代呋喃酮2组与对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。扫描电镜观察示,与对照组比较,溴代呋喃酮3组培养后6h PVC材料表面细菌群落附着数量较少;18h时对照组及溴代呋喃酮1组和溴代呋喃酮2组PVC材料表面细菌生物膜结构已初步形成,而溴代呋喃酮3组PVC材料表面无明显细菌生物膜结构形成。结论不同溴代呋喃酮对PVC材料表面大肠杆菌生物膜形成的影响不同,3,4-二溴基-5,5-二甲苯基-2(5H)-呋喃酮可抑制PVC材料表面单位面积大肠杆菌群落数和细菌群落厚度形成。     

医用钛板表面涂层2-MPC对细菌生物膜形成的影响

目的探讨医用钛板表面涂层2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine,2-MPC)对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响。方法利用化学接枝法制备钛板表面2-MPC涂层并用扫描电镜观察其表面形貌,以金黄色葡萄球菌(ATCC25923)标准菌株作为实验用菌,将已消毒的2-MPC涂层钛板(实验组)及普通钛板(对照组)置入5 mL细菌浓度为1.5×10~6cfu/mL的菌液中共同培养。分别于体外培养后24 h、48 h行膜内活菌计数和扫描电镜观察。结果扫描电镜观察显示通过化学接枝法制备的2-MPC涂层钛板表面形貌光滑,钛板原先的纹理消失。体外培养24 h、48 h实验组钛板表面活菌计数数量均显著少于对照组(P0.05);扫描电镜观察发现24 h、48 h实验组钛板表面细菌黏附量均明显少于对照组(P0.05),且在48 h时实验组钛板表面菌膜形成量明显少于对照组。结论化学接枝法能有效将2-MPC涂层于钛板表面,且2-MPC涂层可以有效抑制钛板表面细菌黏附,预防钛板表面细菌生物膜的形成。     

大蒜素对表皮葡萄球菌在人工关节材料表面粘附的影响

目的探讨大蒜素对表皮葡萄球菌在人工关节材料超高分子聚乙烯和钛合金表面粘附的影响。方法实验分为4组(其中按大蒜素干预的浓度不同具体细分):生理盐水干预组;1 mg/L大蒜素浓度干预组;2 mg/L大蒜素浓度干预组;4 mg/L大蒜素浓度干预组。利用细菌计数和生物膜定量实验观察不同浓度大蒜素干预后对表皮葡萄球菌在超高分子聚乙烯(UHMWPE)和钛合金表面粘附及生物膜形成的影响。细菌粘附数和生物膜量等计量资料使用单因素方差分析评估,组间两两比较使用LSD法。结果在大蒜素浓度分别为0 mg/L、1mg/L、2 mg/L、4 mg/L干预下,单位面积的超高分子聚乙烯材料表面粘附的细菌数分别为(36 312±6 522)CFU/mm2、(30 624±8 728)CFU/mm2、(13 425±6 026)CFU/mm2、(681±249)CFU/mm2,组间差异有统计学意义(F=61.52,P0.05)。钛合金螺钉表面细菌数分别为(76 113±6 504)CFU、(71 155±7 241)CFU、(18 611±6 549)CFU、(7 066±1 249)CFU,组间差异有统计学意义(F=325.42,P0.05)。超高分子聚乙烯表面生物膜吸光度值分别为(4.38±0.55)、(4.17±0.67)、(2.20±0.69)、(0.62±0.38),组间差异有统计学意义(F=81.84,P0.05)。钛合金螺钉表面的生物膜量分别为(3.43±0.51)、(3.29±0.53)、(2.74±0.58)、(0.59±0.25),组间差异有统计学意义(F=66.31,P0.05)。结论亚抑菌浓度的大蒜素能够抑制表皮葡萄球菌在UHMWPE和钛合金材料表面粘附,抑制生物膜在上述材料的形成。     

金属蛋白酶对涤纶材料表面金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响

目的观察不同浓度下金属蛋白酶(A ur)对金黄色葡萄球菌在涤纶材料表面细菌生物膜形成的影响。方法90片涤纶片按随机数字表法分成3组,每组30片。3组均将涤纶片放入有金黄色葡萄球菌液(105CFU/m l)的无菌瓶中,A组再加入含400ng/m l浓度的A ur,B组再加入含80ng/m l浓度的A ur。3组均置入电热恒温水浴箱(98.6°F)中培育,分别于培育后6h、16h、24h、30h和48h用扫描电子显微镜(SEM),激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察细菌生物膜的厚度和单位面积内细菌生物膜群落数量。结果对照组涤纶片细菌生物膜的厚度和群落数呈时间依赖性明显增加,A组涤纶片金黄色葡萄球菌生物膜的厚度和群落数在各时间点均明显低于B组和对照组(P<0.05),B组生物膜的厚度和群落数在各时间点亦明显低于对照组(P<0.05)。结论A ur对金黄色葡萄球菌在涤纶片上细菌生物膜的形成有抑制作用,其抑制作用的强度与A ur剂量呈正相关。     

烧伤临床鲍氏不动杆菌分离株生物膜内菌aba Ⅰ基因表达的变化

目的 了解烧伤临床鲍氏不动杆菌分离株生物膜形成过程中,密度感应基因aba Ⅰ表达变化及其对生物膜ECM和细菌耐药性的影响. 方法 2011年1-10月,收集上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤住院患者创面、血液和静脉导管来源的鲍氏不动杆菌耐药菌6株、敏感菌5株.以鲍氏不动杆菌标准菌株ATCC 19606为参照.(1)临床分离株和标准菌株体外常规培养10、24、48 h后,经碘化丙啶染色,用激光扫描共聚焦显微镜观察生物膜厚度.(2)采用试管培养法,将临床分离株和标准菌株振摇培养10、24、48 h,培养液内漂浮细菌为游离菌,黏附于试管壁的生物膜内细菌为膜内菌.采用实时荧光定量PCR技术检测各菌株中aba Ⅰ基因及pgaB基因的相对表达量(标准菌株基因表达丰度设为1).对实验数据进行方差分析. 结果 (1)鲍氏不动杆菌临床分离株体外培养10、24、48 h,生物膜厚度均超过标准菌株,其中耐药菌株生物膜厚度分别为(28.8±0.6)、(31.7±1.1)、(38.1±3.1)μm,明显高于敏感菌株[(17.1±0.4)、(20.1±1.6)、(25.8±1.7)μm,F值分别为1274.38、206.60、61.73,P值均小于0.05].(2)膜内菌:体外培养10、24、48 h,耐药菌株aba Ⅰ表达量分别为6.6±1.7、25.7±3.5、9.8±3.6,均高于敏感菌株(2.7±1.0、15.0±3.5、4.7±3.2,F值分别为21.82、25.24、6.22,P值均小于0.05);耐药菌株pgaB的表达量分别为37.4±1.1、44.5±3.6、33.1±11.5,明显高于敏感菌株(14.6±0.8、20.0±6.9、18.7±6.8,F值分别为1488.44、57.26、6.01,P值均小于0.05).(3)游离菌:体外培养10、24、48 h,耐药菌株aba Ⅰ表达量均与敏感菌株接近(F值分别为0.24、2.33、0.11,P值均大于0.05);耐药菌株pgaB表达量分别为13.8±3.8、12.5±2.9、23.7±2.1,明显高于敏感菌株(7.0±5.9、5.0±1.3、15.6±6.7,F值分别为5.44、28.42、7.76,P值均小于0.05).(4)膜内菌与游离菌的耐药菌株比较:膜内菌各时相点aba Ⅰ表达量均多于游离菌(F值分别为43.69、286.61、9.98,P值均小于0.05),膜内菌pgaB表达量在10、24 h多于游离菌(F值分别为214.26、283.20,P值均小于0.05).(5)膜内菌与游离菌的敏感菌株比较:膜内菌abaⅠ表达量在培养24 h多于游离菌(F=70.28,P＜0.05),pgaB表达量在10、24 h多于游离菌(F值分别为8.03、22.62,P值均小于0.05). 结论 烧伤临床鲍氏不动杆菌分离株生物膜形成过程中,耐药菌株的密度感应基因aba Ⅰ表达明显增多,可能引起pgaB基因表达上调,导致细菌ECM及生物膜形成增加、耐药性增强.     

烧伤患者鲍氏不动杆菌pgaABC基因簇表达及生物膜表型变化

目的 观察并探讨烧伤患者鲍氏不动杆菌pgaABC基因簇转录表达水平及生物膜形成过程中表型变化.方法收集2009年1月-2010年10月笔者单位住院烧伤患者创面、血液和静脉导管分离的鲍氏不动杆菌24株,以其标准菌株ATCC 19606为对照.采用实时荧光定量RT-PCR技术检测各菌株pgaABC基因簇表达;分别采用改良微孔法及试管法在静置(静态)和摇菌(动态)状态下体外培养各菌株16 h,进行细菌生物膜半定量检测;各菌株体外培养48 h后荧光染色,激光扫描共聚焦显微镜观察并测定生物膜厚度.对数据行t检验.结果 (1)鲍氏不动杆菌临床菌株pgaB基因转录相对表达量为27.91±7.93,明显高于设定基准为1.00的标准菌株(t=5.77,P＜0.05);pgaA和pgaC的表达量分别为1.01±0.28、1.15±0.38,与标准菌株比较差异无统计学意义(t值分别为0.04、0.64,P值均大于0.05).(2)静态培养16 h,鲍氏不动杆菌临床菌株与标准菌株的生物膜半定量结晶紫染色吸光度值相近;而临床菌株动态培养16 h,生物膜半定量结晶紫染色形成明显的紫色环,吸光度值为1.25±0.31,显著高于标准菌株(0.76±0.03,t=2.67,P＜0.05).(3)体外培养48 h,临床菌株ECM中绿色荧光强度及分布均多于标准菌株,临床菌株生物膜厚度为(27.3±9.4)μm,明显大于标准菌株的(15.6±1.7)μm,t=2.09,P＜0.05.结论烧伤患者鲍氏不动杆菌pgaABC基因簇中pgaB转录水平增高,从而导致细菌ECM增多,这可能与鲍氏不动杆菌临床菌株生物膜形成能力和厚度增加有关.

Abstract：

Objective To observe expressions of pgaABC gene clusters and changes in biofilm (BF) phenotype in Acinetobacter baumannii (AB) isolated from burn patients. Methods From January 2009 to October 2010, 24 strains of AB isolated from burn patients hospitalized in our burn wards were collected for the study, while the standard strain ATCC 19606 was used as control. Expressions of pgaABC gene clusters were detected by real time fluorescence quantitative RT-PCR. All strains were cultured for 16 hours in vitro, BF with semi-quantitative detection was respectively evaluated by modified microtiter-plate test under stable condition and tube test under shaking condition for expression of absorbance value. All strains were cultured for 48 hours in vitro, then stained with fluorescent agent and collected for measurement of BF thickness with confocal laser scanning microscopy ( CLSM ). Data were processed with t test. Results ( 1 ) The expression of pgaB gene (27.91 ± 7.93 ) in clinical AB strains was much higher than that of standard strain ATCC 19606 (1.00, t = 5.77, P ＜ 0.05 ). There was no statistical difference in expression of pgaA and pagC genes between standard strain ATCC 19606 (1.00) and clinical AB strains (1.01 ± 0.28,1.15 ±0.38, with t value respectively 0.04, 0.64, P values all above 0.05). (2) After being cultured for 16 hours, BF of clinical AB strains cultured under shaking condition formed distinct "purple circle" , and its absorbance value ( 1.25 ±0.31 ) was higher than that in standard strain ATCC 19606 (0.76 ± 0.03, t =2.67, P ＜ 0.05 ). There was no obvious difference in absorbance value between clinical AB strains and standard strain ATCC19606 cultured under stable condition. (3) After being culture for 48 hours, green fluorescence intensity and distribution in extracellular matrix of clinical AB strains were stronger as compared with those of standard strain ATCC 19606, and BF thickness in clinical AB strains [(27.3 ± 9.4) μm] was thicker than that in standard strain ATCC 19606 [( 15.6 ± 1.7) μm, t = 2.09, P ＜ 0. 05]. Conclusions The high expression of pgaB gene in AB strains isolated from burn patients can induce production of extracellular matrix, which may be related to increase in the ability and thickness of BF formation.     

万古霉素阳离子脂质体复合纳米羟基磷灰石/壳聚糖/魔芋葡苷聚糖支架对金黄色葡萄球菌生物膜体外抑制作用

目的：研究万古霉素阳离子脂质体（ CLVs）复合纳米羟基磷灰石/壳聚糖/魔芋葡苷聚糖支架对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用。方法采用微量肉汤稀释法测定药物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度,采用再生实验方法研究支架释放的CLVs对金黄色葡萄球菌生物膜的敏感性。结果万古霉素和CLVs对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为1．0 mg/L和0．6 mg/L;相同浓度的万古霉素脂质体复合支架对细菌生物膜的作用在低浓度和短时间的接触较游离万古霉素支架更有效。结论 CLVs复合纳米羟基磷灰石/壳聚糖/魔芋葡苷聚糖支架可以作为新的载药系统,在临床治疗生物膜感染方面可起到重要作用。     

碘伏对钛合金表面金葡菌细菌生物膜抗菌活性的试验研究

[目的]观察碘伏对钛合金表面金黄色葡萄球菌细菌生物膜的体外抗菌活性。为临床上内置物相关感染的治疗方法提供参考。[方法]在钛合金表面建立金黄色葡萄球菌生物膜模型,通过激光共聚焦显微镜观察其结构。采用活菌计数法,了解碘伏对细菌生物膜的抗菌活性。[结果](1)有效碘浓度为0.1%的碘伏即可对生物膜内活细菌起到杀灭作用;(2)有效碘浓度为0.3%及更高浓度的碘伏可大幅度杀灭生物膜内活菌;(3)使用有效碘浓度为0.5%的碘伏浸泡5 min无法完全杀灭生物膜内细菌。[结论]碘伏对于24 h细菌生物膜内的活菌具有抗菌活性。有效碘浓度为0.3%以上的碘伏可以显著杀灭生物膜的细菌。将浓度提高至0.5%虽可杀灭生物膜内绝大部分细菌,但仍无法完全根除。     

肛周脓肿的病原菌分布与防护措施

正1资料与方法1.1一般资料收集河北省容城县人民医院2017年9月—2018年8月收治的肛周脓肿患者其中男70例,女23例;年龄3～70岁,平均(38.2±12.3)岁。无菌操作抽取肛周脓液进行细菌培养,培养阳性的菌株进行细菌菌种鉴定及抗菌药物敏感试验。采用质控标准菌株大肠埃希菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)进行细菌鉴定和药敏质量控制。     

几丁聚糖和透明质酸钠抑菌作用的研究

目的　比较几丁聚糖和透明质酸钠的抑菌作用及抑菌范围。方法　对奇异变形杆菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌进行培养。每种细菌培养 33管 ,其中 30管分为 A、B及 C组 ,按倍比稀释法在 A组加入高相对分子量 (Mr)几丁聚糖 ,B组加入低 Mr几丁聚糖 ,C组加入透明质酸钠 ;另 3管为对照组 (D组 )。37℃恒温下培养 18小时 ,观察细菌的生长情况。结果　 A组最小抑菌浓度 (MIC)为 :奇异变形杆菌 0 .0 31% ,大肠埃希氏菌 0 .0 6 3% ,白色念珠菌 0 .0 6 3% ,铜绿假单胞菌 0 .0 6 3% ,金黄色葡萄球菌 0 .0 6 3% ;B组 MIC为 :奇异变形杆菌0 .12 5 % ,大肠埃希氏菌 0 .2 5 % ,白色念珠菌 0 .2 5 % ,铜绿假单胞菌 0 .2 5 % ,金黄色葡萄球菌 0 .12 5 %。 C组和 D组各管都有细菌生长。结论　透明质酸钠无抑菌作用 ;几丁聚糖有广谱抑菌作用 ,而高相对分子量几丁聚糖抑菌能力较强。     

环丙沙星对培养的铜绿假单孢菌释放DNA的影响

目的 观察不同浓度的环丙沙星对培养的铜绿假单孢菌释放DNA的影响。方法 选择体外对铜绿假单孢菌1244株(ATCC 27317)敏感的环丙沙星为实验所用的抗生素,检测其最小最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);将不同稀释度(32～0．03mg／L)的环丙沙星与该菌株菌液在37℃培养,分别取其培养4h和24h的上清液经DNA电泳法检测其细菌DNA释放的情况。结果 无论有无环丙沙星,DNA电泳法均未见到培养4h的样本存在细菌释放的游离DNA。体外培养24h,铜绿假单孢菌可自发释放一定量的游离DNA分子,呈两个明显的区带,其分子量分别大于2000bp和小于100bp;远低于MIC的环丙沙星可诱导铜绿假单孢菌释放更多的游离。DNA,分布在3个明显的区带,其中两个区带大于2000bp,另1个区带小于100bp;大于或等于MIC的环丙沙星对铜绿假单孢菌无诱导DNA释放的作用。结论 自然生长情况下铜绿假单孢菌就可自发释放一定量的游离DNA分子;低于：MIC的环丙沙星存在使这一现象更加明显,而且铜绿假单孢菌释放游离DNA分子的多少和分子量大小均有明显的差别。     

急性期骨科钛合金板表面金黄色葡萄球菌细菌生物膜的结构演变

目的 采用激光共聚焦显微镜及扫描电子显微镜技术动态观察急性期(4周)内不同时相点钛合金板表面金黄色葡萄球菌的生物膜结构。方法 使用骨科钛合金板培养体外金黄色葡萄球菌形成不同时相点的生物膜，在培养1周、2周、3周、4周后取出钛合金板，用异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白和碘化丙啶染料将不同时相点的生物膜染色，染色后使用激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜观察细菌生物膜的形态结构。结果 得到不同时相点的生物膜的激光共聚焦图像及显微电镜图像，1周时细菌胞外少量多糖聚合物形成，内部空间结构杂乱无序，表明形成了早期生物膜。随着培养时间的延长细菌胞外多糖聚合物逐渐增多，内部间隙及孔道相互交通，空间结构逐渐复杂。到4周时大量胞外多糖聚合物形成，膜内结构进一步完善，表明形成成熟的生物膜。各时相点内活菌数目，差异无统计学意义(P>0.05);各时相点间生物膜厚度，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 金黄色葡萄球菌细菌生物膜有早期和晚期区别，从早期生物膜到晚期成熟生物膜是一个动态演变过程，表现为细菌生物膜胞外多糖聚合物及内部空间结构的成熟稳定。