聚乳酸/骨基质明胶多孔复合材料的生物相容性研究

目的探讨超临界CO2法制备的聚乳酸(poly lactic acid,PLA)/骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)多孔复合材料的生物相容性,为其下一步骨缺损修复奠定基础。方法取小鼠成骨前体细胞MCT3T-E1细胞,分别与PLA/BMG多孔复合材料和PLA材料的浸提液培养7 d,每天采用MTT法测定细胞增殖率并进行细胞毒性分级。将PLA/BMG多孔复合材料与MC3T3-E1细胞复合培养,1、3、5 d于倒置相差显微镜下观察细胞生长及与材料贴附情况,5 d时取材行扫描电镜观察细胞贴附情况。将PLA材料(PLA组)及PLA/BMG多孔复合材料(PLA/BMG组)分别植于15只Wistar大鼠背部两侧皮下,术后大体观察大鼠一般情况,2、4、8周取材行组织学观察,测量包膜厚度、炎性细胞数及血管面积。结果体外细胞毒性检测示,培养1~7 d PLA/BMG组细胞增殖率均达100%以上,细胞毒性均为0级;而PLA组除1、3、5、6 d细胞毒性为0级外,2、4、7 d细胞增殖率均低于100%,细胞毒性级为1级。PLA/BMG多孔复合材料与细胞复合培养,可见随时间延长细胞逐渐长入材料孔隙内,细胞形态良好。材料皮下植入后,大鼠均存活至实验完成,切口愈合良好;PLA组材料被纤维结缔组织所包裹,周围组织及材料内含有较多炎性细胞,结缔组织向材料内部生长缓慢;PLA/BMG组纤维组织包裹不明显,结缔组织易于向材料中心长入且其中炎性细胞少见。两组各时间点包膜厚度差异无统计学意义(P0.05)。PLA/BMG组2、4、8周炎性细胞数均显著低于PLA组(P0.05),8周血管面积高于PLA组(P0.05)。结论超临界CO2法制备的PLA/BMG多孔复合材料具有良好的细胞和组织相容性。     

二膦酸盐对骨巨细胞瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用

目的观察二膦酸盐对骨巨细胞瘤细胞生长的影响。方法取10例手术切除的骨巨细胞瘤新鲜组织进行原代培养，待瘤细胞贴壁生长后分别给予5、25、50、100、200μmol／L阿仑膦酸钠、帕米膦酸二钠。作用一定时间后，用倒置相差显微镜观察细胞形态，MTT法检测细胞活性，末端酶标记法凋亡染色观察细胞凋亡情况，流式细胞术检测凋亡率和caspase-3表达。结果（1）二膦酸盐作用后，细胞正常形态消失，甚至发生崩解。（2）药物作用24h后，阿仑膦酸钠可以抑制细胞活性的2．79％±0．92％-31．17％±8．05％，帕米膦酸二钠为5．87％±1．94％-39．68％±9．26％；48h后，阿仑膦酸钠可以抑制细胞活性的8．68％±2．87％—46．88％±11．24％，帕米膦酸二钠为10．49％±3．26％～60．43％±13．64％；72h后，阿仑膦酸钠可以抑制细胞活性的11．13％±3．60％-49．94％±11．67％，帕米膦酸二钠为15．57％±5．86％～63．97％±16．42％。（3）药物作用48h后，阿仑膦酸钠和帕米膦酸二钠5μmol／L组的细胞凋亡率分别为16．25％±5．62％、20．48％±6．02％；50μmol／L组分别为37．20％±12．01％、42．39％＋12．41％；200μmol／L组分别为47．53％＋13．92％、54．67％＋15．38％。（4）帕米膦酸二钠作用48h后，5、50、200μmol／L组瘤细胞的caspase-3活性分别为14．93％±5．04％、25．13％±7．60％、26．07％＋7．49％，引起的细胞凋亡表现为时间和浓度依赖性。结论二膦酸盐可能成为治疗和预防骨巨细胞瘤复发的一个治疗方法。     

纳米羟基磷灰石和重组胶原及聚乳酸复合材料作为骨形态发生蛋白2活性多肽缓释载体的实验研究

目的探讨纳米羟基磷灰石／重组胶膨聚乳酸（nano-hydroxyapatite／recombinanthuman-like collagen／polylactic acid，nHA／RHLC／PLA）复合多孔支架材料作为骨形态发生蛋白2（Bonemorphogenetic protein2，BMP2）活性多肽载体的可行性。方法制备nHA／RHLC／PLA复合多孔支架材料，扫描电镜观察支架材料表面微观形貌；通过真空吸附法将BMP2活性多肽与支架材料复合，采用高效液相色谱仪检测不同时问点BMP2活性多肽的释放量，观察BMP2活性多肽的体外释放规律；将复合了BMP2活性多肽的支架材料作为实验组，未复合BMP2活性多肽的支架材料作为对照组，分别植入大鼠背部肌肉内，于4周和8周两个时间点将大鼠分批处死，进行CT扫描、三维重建和组织学观察。结果扫描电镜结果显示：支架材料表面呈多孔状；体外BMP2活性多肽释放规律为：第1d表现为爆发性释放释放量为35．5％，以后缓慢持续释放，至1个月左右释放量达89．6％；CT扫描、三维重建和组织学观察结果均表明复合了BMP2活性多肽的多孔支架材料有较多新生骨组织形成，对照组未见成骨现象。结论nHA／RHLC／PLA复合多孔支架材料可以作为BMP2活性多肽的缓释载体，负载BMP2活性多肽的nHA／RHLC／PLA是一种理想的骨组织工程支架材料。     

碱性成纤维细胞生长因子对犬隐静脉间质细胞体外培养抗钙化作用

目的观察作为组织工程瓣间质种子细胞的犬隐静脉间质细胞体外培养钙化机制,探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对犬隐静脉间质细胞体外培养钙化的抑制作用。方法分离培养犬隐静脉间质细胞,分为正常培养对照、促钙化培养和bFGF培养3组。2周后行von kossa染色,检测细胞层钙沉积、碱性磷酸酶(ALP)活性及上清液中骨钙素(OC)含量,细胞ALP、OC mR- NA表达。结果培养2周后,促钙化组及对照组均有细胞结节形成,bFGF组细胞呈极性密集生长,无结节形成。von kossa染色促钙化组呈强阳性,bFGF组及对照组呈弱阳性。促钙化组钙沉积及ALP活性比对照组均明显增高(5．384±0．443比2．198±0.173,P＜0.01),ALP高2．13倍(9．611±0．639比4.819±0．334,P＜0．01),bFGF使两者均显著降低(0．192±0．024比5．384±0.443,P＜0．01,3．069±0．178比9．611±0．639,P＜0．01)。促钙化组上清液OC含量于第6天始升高,至第12天到达高峰,然后有轻度下降。bFGF组及对照组均维持较低水平。结论体外培养的犬隐静脉间质细胞在促钙化条件下具有成骨细胞的表型,有明显的钙化现象发生,bFGF具有抑制其钙化的作用。     

黄芪多糖/壳聚糖/聚乳酸为支架的组织工程骨修复牙周组织缺损的实验研究

目的 探讨以黄芪多糖／壳聚糖／聚乳酸（astragalus polysaccharides／chitosan／polylacticacid，AP／C／PLA）为支架的组织工程技术修复水平型牙周组织缺损的可行性。方法成年健康雄性杂种犬10只，体重13±2kg，以犬骨髓基质细胞（marrow stromalcells，MSCs）为种子细胞，分别与AP／C／PLA及C／PLA支架构建组织工程复合物。10只实验犬于双侧下颌第3、4前磨牙颊侧制备水平型牙周缺损模型。将牙周缺损模型随机分为4组（n=10）：A组，缺损直接龈瓣冠向复位缝合，作为空白对照；B组，缺损处植人AP／C／PLA和条件培养基，龈瓣冠向复位缝合，作为培养基对照；C组，缺损处复合植入C／PLA和MSCs，龈瓣冠向复位缝合，作为材料对照；D组，缺损处复合植入AP／C／PLA和Mscs，龈瓣冠向复位缝合，作为实验组。术后8周，分别收集牙周标本行大体观察、X线片及组织学观测。结果 体外诱导培养的MSCs表达1型胶原及碱性磷酸酶，具有成骨细胞活性。各组动物对手术耐受性好，术后观察期内未见支架材料暴露，伤口愈合良好。X线片检查可见，A组牙槽骨密度及高度无明显增加；B组骨密度有一定程度增加，根分叉处增高的牙槽骨量少，邻间牙槽骨无明显增加；C组骨密度增加，根分又处牙槽骨基本恢复原有高度，邻间牙槽骨增加不明显；D组骨密度明显增加，根分叉处和邻间牙槽骨基本恢复原有高度。组织学观察显示，与A组相比，D组形成更多的新生牙槽骨、牙周膜和牙骨质，且新生牙槽骨矿化程度高，骨板排列趋向规则，出现整齐同心圆状的哈佛系统，基本具备骨组织的正常结构；牙槽骨与牙周膜的连接面呈锯齿状，沿根面还可见薄层的牙骨质沉积；新生牙周膜纤维呈束状，排列较密集且呈方向性，类似Sharpey’s纤维。A、B、C、D组新生牙槽骨高度分别为0．83±0．30、1．46±0．55、2．67±0．26及2．90±0.41mm；新生牙骨质高度分别为0．78±0．45、1．30±0．60、2．29±0．18及2．57±0．22mm；新生结缔组织附着高度分别为0．80±0．22、1．33±0．34、2．23±0．42及2．64±0．27mm；各指标D组与A、B、C组比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论 以AP／C／PLA为支架材料构建的组织工程骨修复水平型牙周骨缺损可以获得部分牙周组织再生。     

重组人骨形成蛋白2诱导的骨膜细胞构建组织工程骨的实验研究

目的通过组织工程技术方法，研究细胞-材料复合体体内骨再生的能力。方法采用材料学自组装技术的原理．以Ⅰ型胶原蛋白为分子模板．引导钙磷盐在液相中的矿化，制备具有天然骨基质层状结构的羟基磷灰石／胶原复合材料，并以热致分相法制备羟基磷灰石／胶原-聚乳酸[hydroxyapatite／collagen—poly-(L—lactic acid)，HAC—PLA]复合三维多孔框架，与重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein2，rhBMP-2)诱导分化后的兔骨膜细胞构建组织工程骨，进行体外电镜及组织学观察。将3月龄裸鼠18只，分为3组，每组6只。A组皮下注射经rhBMP-2处理后的骨膜细胞悬液，B组植入未复合细胞的HAC—PLA，C组植入rhBMP-2处理后的细胞-材料复合体。术后8周取材行组织学观察，C组与B组及A组进行比较。结果三维多孔HAC—PLA框架材料孔隙率大于90％，孔径为50～300μm。骨膜细胞经500ng／ml的rhBMP-2处理后，与改善亲水性后的HAC—PLA三维多孔框架复合，构建组织工程骨。电镜显示接种的细胞能在此组织工程骨内部生长增殖，术后8周C组有新骨形成，A组注射部位表面平整，无新生物，B组为纤维组织，无骨及软骨形成。结论所构建的组织工程骨有望成为骨创伤修复治疗一种新的技术。     

葛根素对乙醇性股骨头坏死的预防作用

目的 探讨葛根素对小鼠乙醇性ONFH的预防作用。方法 4周龄小鼠随机分为3组，A组给予白酒，B组给予白酒和葛根素，C组给水。4、6、8、10个月分批检测动物血清学、肝脏和股骨头组织学、基因表达等变化。结果 实验6个月时：（1）3组血清CHO、TG、ALP分别为：（6．39±0．49）、（3．19±0．11）、（2．98±0．36）mmol／L，（1．01±0．15）、（0．71±0．13）、（0．68±0．22）mmol／L，（161．6±32．44）、（196．5±31．52）、（203．4±22．83）IU。（2）A组出现脂肪肝，股骨头骨小梁变细稀疏，髓内造血组织减少，脂肪与空骨陷窝明显增多。B组股骨头内脂肪稍增加，空骨陷窝比正常C组少。3组最大脂肪细胞平均直径和空骨陷窝计数分别为（40．02±3．25）、（39．15±3．67）、（38．51±3．09）μm，（13．5±1．6）、（9．8±2．2）、（10．3±2．7）％。（3）A组中PPARγ,mRNA呈高表达，Osteoealcin mRNA呈低表达。B组和C组中PPAR＇,／mRNA呈低表达，Osteocalcin mRNA呈高表达。始自6个月，A组各数据和B、C组间差异均有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01），B、C组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 葛根素能够预防小鼠乙醇性ONFH的发生。     

BMP—2基因转染的人骨髓基质干细胞复合PLA／PCL支架体外构建组织工程骨

目的 用人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体(Ad—BMP—2)转染的人骨髓基质干细胞(hBMSC)，复合PLA／PCL(聚乳酸／聚己内酯)生物降解支架体外构建组织工程骨。方法 用Ad—BMP—2转染体外培养的成人BMSC，免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹方法检测细胞BMP—2的表达，并通过流式细胞仪和ALP活性检测分析其对细胞增殖、分化的影响。然后将转染后细胞接种到PLA／PCL支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 转染后，hBMP—2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达；S期细胞比例和ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论 Ad—BMP—2可高效转染hBMSC，且促进细胞增殖及成骨转化。转染后细胞在PLA／PCL上生长良好，BMP—2基因治疗的组织工程骨构建成功。     

三种钙磷陶瓷材料复合重组人骨形成蛋白-2体内成骨的研究

目的 探讨和比较3种钙磷陶瓷材料HA、TCP、HA／TCP复合重组入骨形成蛋白。2(rhBMP—2)体内异位成骨效果，为临床应用提供依据。方法 取35只3月龄Wistar大鼠，将复合rhBMP—2的3种钙磷陶瓷材料(1：1)植于鼠背部肌袋内，未复合rhBMP-2的上述3种单纯陶瓷材料为对照组。术后2、4和8周取材，测定植入物碱性磷酸酶(ALP)活性，通过HE染色和计算机图像分析进行组织学和组织计量学观察，比较新生骨组织的形成。结果 术后2、4周复合植入物ALP活性测定从高到低依次为HA、HA／TCP、TCP，但在相同rhBMP—2剂量下，其差异无统计学意义(P＞0．05)，与相对应单纯支架材料比较有统计学意义(P＜0．05)；组织学和组织计量学检测结果显示各复合材料组均有新骨形成，成骨量随时间推移而增加，2周时以HA/rhBMP—2成骨量较多，但3组间差异无统计学意义(P＞0．05)；8周时新骨形成以双相陶瓷HA／TCP最佳，相关参数和图像分析有统计学意义(P＜0．05)，成骨量8周较2、4周多，有统计学意义(P＜0．01)；3种单纯支架材料各观察期均无骨样组织形成。结论 双相陶瓷材料HA／TCP是携带rhBMP—2的钙磷陶瓷良好支架材料。     

镧对内毒素/脂多糖诱导的巨噬细胞核因子κB活化的抑制作用

目的 了解稀土元素镧对内毒素／脂多糖（LPS）诱导的小鼠腹腔巨噬细胞（Mφ）核因子KB（NF-κB）活化的影响，并探讨其机制。方法分离培养小鼠腹腔Mφ，分为：空白对照组，无刺激因素：LPS组，用1μg／mlLPS刺激30min；镧离子（La^3＋）组，用2，5μmol／L La^3＋刺激30min；La^3＋＋LPS组，先后用2，5-μmol／L La^3＋、1μg／ml LPS各刺激30min；La^3＋／L PS组，2．5μmol／L La^3＋刺激30min后，洗涤细胞，再加入1μg／ml LPS刺激30min。采用细胞免疫荧光染色法观察NF-κB在各组细胞中的分布与表达；酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测胞核中NF-κB／p65蛋白活性；蛋白质印迹法检测细胞核内NF-κB／p65蛋白及胞质中核因子抑制蛋白α（IκBα）的表达量。ELISA法测定各组细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。结果 （1）免疫荧光染色显示，空白对照组、La^3＋组、La^3＋＋LPS组和La^3＋／LPS组M小绿色荧光多分布于胞质，胞核荧光强度分别为42±7、73±30、48±11和67±19；LPS组绿色荧光集中于胞核，荧光强度为116±14，明显高于其余4组（P〈0.01）。（2）胞核NF-κB／p65蛋白活性：LPS组吸光度值为0．435±0．066，与空白对照组（0．048±0．027）、La^3＋组（0．062±0．049）、La^3＋＋LPS组（0.066±0.031）、La^3＋／LPS组（0．108±0.017）比较．明显偏高（P〈0．01）。（3）LPS组M由胞核NF-κB／p65蛋白表达水平明显高于其余4组，胞质IκBα蛋白表达水平明显低于其余4组。（4）TNF-α含量：La^3＋组培养上清液中TNF-α含量低于试剂盒检测下限（25pg／m1）及空白对照组（P〈0.05），La^3＋＋LPS组和La^3＋／LPS组低于LPS组（P〈0．01），但高于空白对照组。结论 LPS可激活小鼠腹腔M由NF-κB／p65核移位，并使胞核中NF-κB／p65的表达量和活性升高、胞质IκBα蛋白表达下调，导致TNF-α分泌增多。镧可抑制上述效应。     

成骨细胞与诱导剂对骨髓基质干细胞的增殖与成骨分化的影响

目的探索一种新的骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)增殖与成骨分化的体外诱导培养体系. 方法乳大鼠颅骨来源的第3代成骨细胞与诱导剂(1 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50μg/ml抗坏血酸)对大鼠股骨、胫骨来源的MSCs生长的影响.于8块24孔板上培养MSCs,每孔接种5×104个第3代MSCs.按培养成分不同分为4组,每组2块.DMEM培养为对照组;诱导剂培养为诱导剂组;成骨细胞培养为成骨细胞组;联合使用成骨细胞与诱导剂培养为联合诱导组.计数诱导1～8 d各组MSCs的数量并绘制细胞生长曲线,检测诱导10 d的MSCs的碱性磷酸酶活性,采用RT PCR检测诱导2周时MSCs骨钙素mRNA的表达水平.结果原代及传代MSCs形态正常.细胞生长曲线示MSCs数量均随时间延长增加.成骨细胞组增殖最快,诱导剂组增殖最慢,5～8 d成骨细胞组及诱导剂组细胞数量与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).联合诱导组碱性磷酸酶活性为2.01±0.56 U与对照组0.68±0.14 U、诱导剂组1.27±0.43 U及成骨细胞组0.77±0.19 U比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).对照组不表达骨钙素mRNA,诱导剂组为0.783±0.094、联合诱导组为0.814±0.071与成骨细胞组0.302±0.026比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论联合使用成骨细胞和诱导剂诱导MSCs,不影响MSCs的正常增殖而促进MSCs的成骨分化,诱导效果较好,可望成为一种新的骨组织工程种子细胞的体外培养体系.     

高镁对高磷诱导血管钙化的影响及其机制

目的 探讨高镁对高磷诱导血管钙化的影响及其可能的机制.方法 体外原代培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs),用β甘油磷酸盐(β-GP)诱导钙化.VSMCs细胞被分为4组:对照组、高磷组(10 mmol/L β-GP)、镁干预组(10 mmol/L β-GP+3 mmol/LMgSO4)、镁通道抑制剂(2-APB)干预组(10 mmol/L β-GP+3 mmol/L MgSO4+10-4 mol/L 2-APB).采用茜素红染色及邻甲酚酞络合酮比色法检测细胞钙化情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性;RT-PCR法和Western印迹法检测细胞核心结合因子α-1(Cbfα-1)的表达.24只雄性SD大鼠被随机分为3组:对照组(甲基纤维素灌胃+高磷饮食)、血管钙化组(硫酸腺嘌呤灌胃+高磷饮食)、高镁干预组(硫酸腺嘌呤灌胃+高磷高镁饮食).造模成功后测定大鼠主动脉脉搏波速率(PWV);采用yon Kossa染色及邻甲酚酞络合酮比色法检测胸主动脉钙化情况;免疫组织化学方法检测胸主动脉Cbfα-1表达.结果 细胞培养14 d后,与高磷组相比,镁干预组VSMCs钙盐沉积明显减少,ALP活性降低(P＜0.05),Cbfα-1表达下调;2-APB可抑制高镁对VSMCs的保护性作用.Cbfα-1的动态观察结果显示,镁干预组第3天Cbfα-1的表达下调(P＜0.05),其抑制效应随时间延长呈增强趋势.体内实验中,大鼠慢性肾衰竭血管钙化模型制备成功.和体外实验一致,与血管钙化组相比,高镁干预组大鼠血浆镁离子水平明显升高,胸主动脉PWV明显降低(P＜0.05),血管钙盐沉积程度亦明显减轻.免疫组织化学结果显示高镁可明显降低高磷诱导的Cbfα-1表达(P＜0.05).结论 高镁可抑制血管钙化,其机制可能与其抑制VSMCs骨源性分化相关.     

乳酸对成骨样细胞成骨表型及碱性磷酸酶基因表达的影响研究

目的 明确聚乳酸降解终产物乳酸对细胞成骨表型和基因表达的影响机理，为聚乳酸支架的精确设计提供参考意义。方法 配制乳酸浓度为8、16、22、27 mmol/L的培养基，将不含乳酸培养基作为对照组，检测培养基的pH和渗透压。利用培养基培养大鼠成骨样细胞Ros17/2.8，观察细胞形态，测定细胞I型胶原、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和骨钙素含量，盐酸四环素染色钙结节并定量分析。采用实时定量PCR法检测细胞ALP mRNA表达。结果 与对照组相比，随着乳酸浓度增加，培养基pH下降，渗透压升高，成骨样细胞形态改变，数量减少。低浓度乳酸组（8、16 mmol/L）的I型胶原量都显著高于对照组，其余组与对照组相比无显著差异。含乳酸组的细胞ALP活性都低于对照组，并且乳酸浓度越高，细胞ALP活性越低。含乳酸组的骨钙素量与对照组之间没有显著差异。随着乳酸浓度增加，含乳酸组细胞所形成的钙结节阳性面积减少，都低于对照组。低浓度乳酸组（8、16 mmol/L）的细胞ALP mRNA表达量都低于对照组。结论 聚乳酸降解终产物乳酸可抑制细胞ALP mRNA的表达，降低ALP活性。随着乳酸浓度增加，乳酸抑制作用增强，最终降低细胞的成骨矿化能力。此外，乳酸不会抑制细胞分泌I型胶原和骨钙素。     

仿生活性人工骨修复兔桡骨节段性骨缺损的研究

目的 研制在成分和结构上与天然骨基质高度仿生的新型材料，应用于节段性骨缺损的修复。方法 以Ⅰ型胶原蛋白分子为模板，引入钙磷盐生成体重，合成纳米相羟基磷灰石/胶原（NHAC）并以之为主体，以1：1的质量比加入聚乳酸（PLA）制备多孔框架，与重组人骨形态发生蛋白2（rh-BMP2)复合后植入兔桡骨15mm缺损，观察骨修复情况。结果 所合成的材料具有纳米级的层装排列结构。层间距为11.7nm，实验组中10只兔术后12周骨缺损均完全愈合。结论 NHAC可能成为修复骨缺损的较理想材料，具有较大的临床应用潜力。     

核心结合因子α1促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的观察核心结合因子α1(core binding factor α1,Cbfα1)对兔骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)的促成骨效应.方法体外分离培养日本大白兔MSCs,按培养方法的不同分为3组.对照组:常规培养;单纯诱导组:以条件培养液(低糖DMEM 10%胎牛血清 10 mmol/L地塞米松 50 mg/L维生素C 10 mmol/L β-甘油磷酸钠)培养;实验组:以AdEasy1/Cbfα1转染MSCs,加入条件培养液培养.在诱导3 d,1、2、3和4周时,行组织学观察和免疫组织化学等方法检测成骨标志碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨钙素的表达.结果体外培养兔MSCs生长良好,实验组AdEasy1/Cbfα1转染后90%以上MSCs表达绿色荧光蛋白.实验组及单纯诱导组ALP染色呈棕黑色阳性,随培养时间延长逐渐加深,对照组仅少量散在细胞ALP呈弱阳性;第1、2、3和4周实验组ALP浓度与单纯诱导组及对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).实验组及单纯诱导组从2周开始有红色的阳性染色矿化结节出现,对照组为阴性,结节数目随时间推移而增多.实验组及单纯诱导组1周时有少量骨钙素染色阳性,2、3及4周时大量出现,对照组为阴性.结论应用Cbfα1可促进兔MSCs向成骨细胞分化,其分子机制仍需进一步深入研究.     

兔自体细胞-载体复合物修复关节软骨缺损的实验研究

目的 研究兔MSCs向软骨细胞方向诱导后复合自体双相骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)对膝关节软骨缺损的修复作用.方法 健康成年新西兰大白兔24只,雌雄不限,体重2～3 kg,随机分为A、B、C组,每组8只.取A组骨髓行原代培养,胰酶消化按12比例传至第5代,倒置相差显微镜观察细胞形态.取1、3、5代细胞绘制生长曲线.于第3代MSCs生长密集时加入TGF-a1 10 ng/mL、IGF-1 10 ng/mL、维生素C 50 ng/mL诱导8 d后倒置相差显微镜下观察,爬片行免疫组织化学及Mallory染色.取A组髂骨按Urist方法 制备双相BMG,将第3代经诱导8 d得到的种子细胞以5 X 106/mL密度接种于自体BMG制备细胞.载体复合物,体外培养3 d后扫描电镜观察.制作膝关节软骨直径3 mm,深3 mm的缺损模型,A组植入自体细胞.载体复合物,B组植入自体BMG,C组不作处理,第8、12周取材行大体观察、HE染色、免疫组织化学染色观察,Wakitani法组织学评分.结果 倒置相差显微镜观察MSCs原代细胞呈短梭形;传代细胞呈长梭形.传代细胞1～3 d增殖缓慢,3 d后增殖旺盛,7～8 d进入平台期,第3代增殖最为旺盛.诱导后MSCs细胞呈椭圆形,Ⅱ型胶原、S-100免疫组织化学染色阳性,Mallory染色胞浆蓝染.细胞-载体复合物扫描电镜观察BMG结构符合细胞载体要求,细胞种植于BMG后生长良好.动物实验大体观察A组术后8、12周缺损处均由透明软骨样组织修复,8周较12周表面稍凹陷;B、C组术后8、12周均为纤维样组织修复,表面凹凸不平.组织学观察HE染色A组术后8、12周修复组织与周围软骨组织结合良好,以圆形、椭圆形透明软骨样细胞为主,12周较8周细胞数多且大B、C组均为纤维样组织修复,12周较8周纤维样组织增厚.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色A组术后8周呈阳性、12周呈强阳性;B、C组均无表达.Wakitani评分术后8周A、B、C组分别为(3.50±1.51)、(10.00±1.41)、(12.00±0.93)分,术后12周分别为(1.13±0.99)、(8.38±1.30)、(10.13±1.64)分,A组优于B、C组,B组优于C组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 自体MSCs向软骨细胞方向诱导后,复合自体BMG对关节软骨缺损有较好的修复作用.