不同培养容器和光照对2种微藻生长的影响

目的 研究具药用价值的海洋微藻杜氏盐藻Dunaliella salina和亚心形扁藻Platymonassubcordiformis在不同培养容器以及光照下的细胞生长情况,为促进海洋微藻生物资源的培养保存提供参考.方法 选取杜氏盐藻和亚心形扁藻2种海洋微藻为生物材料,在植物培养箱中分别利用三角瓶和试管,在正常光照和遮光光照条件下开展为期10 d的一次性培养试验,利用倒置显微镜和血球计数板观测微藻细胞密度,统计分析不同培养容器和光照对2种海洋微藻生长影响的作用.结果 在该实验条件下,2种海洋微藻的细胞生长均表现出初期生长缓慢、中期生长快速、后期生长放缓的趋势.杜氏盐藻在三角瓶中正常光照培养条件下的生长最好(504× 104个/mL),其次为在试管中正常光照培养的条件下(364× 104个/mL);亚心型扁藻细胞在三角瓶中正常光照培养的条件下生长最好(227×104个/mL),其次为在三角瓶中遮光处理的条件下(177× 104个/mL).结论 培养容器(三角瓶和试管)和光照(正常光照和遮光)对2种海洋微藻生长的影响均具有统计学意义,在进行微藻生物资源培养和保存时,应充分考虑或利用这2种因素的作用.     

3种具药用价值绿藻的生长特性比较研究

目的比较研究具潜在药用价值的亚心形扁藻Platymonas subcordiformis、眼点拟微绿球藻Nannochloropsis ocutala、海洋小球藻Chlorella vulgaris 3种绿藻门海洋微藻的细胞生长特性,为海洋微藻在医药保健食品行业的应用提供参考依据。方法选取上述3种海洋微藻为生物材料,以添加f/2营养液的人工海水为培养介质,在光照培养箱中利用三角瓶开展一次性培养实验。利用显微镜观测微藻生长14 d内的细胞密度变化情况,采用最小二乘法拟合细胞密度法计算微藻生长速率。结果在实验周期内,3种海洋微藻的细胞生长曲线均呈现出"S"型。在生长平稳期,亚心型扁藻、眼点拟微绿球藻和海洋小球藻的细胞密度分别约为1.30×106、3.50×107和2.45×107个/mL;最大生长速率分别约为0.7/d、0.8/d和1.5/d。结论上述3种具药用价值绿藻的细胞增长经历明显的缓慢期、快速期和平稳期阶段;不同微藻的细胞生长特性差异较大,在进行其高密度培养开发应用时应结合考虑品种特性与收获时期。     

3种典型海洋微藻的细胞增殖特性研究

目的研究硅藻门的三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum、甲藻门的东海原甲藻Prorocentrum donghaiense和金藻门的球形棕囊藻Phaeocystis globosa的细胞增殖情况,为认识其基本生物学特性,推动海洋微藻在医药保健食品行业的应用提供参考。方法选取上述3种海洋微藻为生物材料,以添加f/2营养液的人工海水为培养介质,在植物培养箱中利用三角瓶开展为期2周的一次性培养实验。利用倒置显微镜和血球计数板观测微藻细胞密度,采用最小二乘法拟合法计算微藻日生长速率。结果 3种海洋微藻的细胞生长均经历缓慢期、快速期和平稳期3个阶段;实验结束时,三角褐指藻、东海原甲藻和球形棕囊藻的细胞密度分别约为1.126×107、1.167×107和1.210×107个/mL;其最大生长速率分别出现在第2天(1.11/d)、第4天(1.13/d)和第3天(1.02/d)。结论 3种海洋微藻的细胞增殖具有多样性;它们的最大细胞密度和日生长速率出现的时间或程度均存在一定的差异,提示在进行经济微藻培养生长过程中必须考虑各藻种的细胞增殖特性。     

球等鞭金藻生长抑制物的分离提取与抑制活性

以含有生长抑制物的球等鞭金藻的微藻滤液为研究对象,考察pH、时间、料液体积比和溶剂等因素对生长抑制物提取效果的影响,确定了球等鞭金藻的微藻滤液中生长抑制物的适合提取工艺;通过比较两种型号的葡聚糖凝胶对生长抑制物粗提物的分离效果,确定了适合的凝胶类型;同时研究温度对生长抑制物抑制活性的影响以及生长抑制物对其他微藻生长的抑制作用。结果表明:生长抑制物的适宜提取工艺为pH 2~4、提取时间3 h、料液体积比10∶1、溶剂为乙酸乙酯;Sephadex G-15凝胶对生长抑制物的分离效果好于Sephadex G-25;生长抑制物的抑制活性具有很强的热稳定性,其对角毛藻和小球藻有明显的抑制作用。     

用基因枪法将bar基因导入杜氏盐藻及转基因藻株的检测

目的：探讨基因枪转化方法不同轰击条件和启动子的选择对转化杜氏盐藻的影响。方法：以抗除草剂(bar)基因作为报告基因,用基因枪法将其导入杜氏盐藻。通过草丁膦筛选培养获得转化藻株,对转化藻株进行分析。结果：在氦气压力为100L／min条件下,微弹轰击2次比微弹轰击1次或3次的效果都好;杜氏盐藻碳酸酐酶(CA1)基因启动子可驱动bar基因在杜氏盐藻巾瞬时表达,而双拷贝碳酸酐酶(DCA1)基因启动子可驱动bar基因在杜氏盐藻中稳定表达。结论：在氦气压力为100L／min条件下微弹轰击2次,可能是基因枪法转化杜氏盐藻的较好转化条件。在转基因杜氏盐藻研究中,DCA1基因启动子可能是一种较为理想的启动子类型。     

杜氏盐藻叶绿体转化载体pchlN-CAT-BAR的构建

目的：利用同源重组方法将外源选择标记基因转入杜氏盐藻叶绿体中并表达。方法：以光非依赖性的原叶绿素酸酯还原酶chlN基因为同源片段,以氯霉素乙酰转移酶（cat）基因和除草剂草丁膦（PPT）抗性bar基因为选择标记,构建盐藻叶绿体转化载体pchlN-CAT-BAR,并通过基因枪法转入野生型盐藻细胞,筛选转化藻株。对转化株和野生对照组的细胞计数结果进行统计学分析。结果：在200mg/L氯霉素的选择下,野生型盐藻12d左右死亡,转化藻仍正常生长,再经4mg/LPPT继代筛选3～5代,得到表达氯霉素和PPT抗性的盐藻转化株。盐藻转化株和野生株1个月内藻株生长差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：以chlN基因作为同源片段构建盐藻叶绿体转化载体是可行的。     

杜氏盐藻叶绿体转化载体pUC-chlN1622-CAT的构建

目的:构建杜氏盐藻叶绿体转化载体pUC-chlN1622-氯霉素乙酰转移酶(CAT)。方法:以光非依赖性的原叶绿素酸酯还原酶chlN基因为同源片段,以CAT抗性基因为选择标记,构建盐藻叶绿体转化载体pUC-chlN1622-CAT,并通过电击法转入野生型盐藻细胞,筛选转化藻株。结果:在氯霉素浓度为300mg/L的选择压力下,野生型盐藻10d左右死亡,转化藻仍正常生长,得到表达氯霉素抗性的盐藻转化株。结论:以chlN基因作为同源片段构建盐藻叶绿体转化载体是可行的。     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶缺陷型突变株的筛选与鉴定

目的:制备杜氏盐藻氯酸盐抗性突变株库并从中筛选出硝酸盐还原酶(NR)缺陷型突变株,测定其NRcDNA全长序列,分析其突变位点.方法:①用乙基亚硝基脲(ENU)对杜氏盐藻进行诱变,得到突变株库.然后用氯酸盐抗性筛选方法获得氯酸盐抗性藻株,经复筛和不同氮源生长试验,获得了氯酸盐抗性突变株库.再用96孔板法进行单藻培养,获得氯酸盐抗性突变株单藻群.用磺胺比色法测定各个单藻群的NR活性,挑选出NR活性完全丧失的突变株.然后用氯酸盐抗性实验和不同氮源生长实验验证其NR突变的稳定性.②根据已知的盐藻NR全长序列,设计3对PCR引物,提取突变株盐藻细胞mRNA,反转录成cDNA,分3段扩增其NR cDNA的全长序列,产物与T载体连接后转化至大肠杆菌JM109中,经筛选后测序,测序结果与野生型盐藻NR eDNA序列比较,分析其突变位点.结果:序列分析表明,3株突变株共有11处相同的突变,其中的3处点突变引起了氨基酸性质的改变.它们均在近3'端有一段相同的移码突变,造成19个氨基酸的完全改变.此外,2株还分别由于在1 235和1 639的位点突变而产生了一个终止密码子.结论:筛选出了3株杜氏盐藻NR完全缺陷型突变株.     

杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白的表达分析

目的 研究杜氏盐藻(Dunaliella salina)核基质结合区结合蛋白(matrix attachment region binding protein,MBP)基因随盐藻的生长表达变化情况及真核表达.方法 利用实时荧光定量PCR检测盐藻中MBP基因的表达变化,构建MBP的cDNA全长序列及N端和C端序列的含有组氨酸标签的真核表达载体,转染CHO细胞,筛选稳定转染株,Western blotting检测融合蛋白表达情况.结果 盐藻的MBP基因表达随生长周期变化,MBP及其N端和C端的融合蛋白成功在CHO细胞表达.结论 MBP可能参与盐藻增殖过程中RNA的加工,并为下一步分离真核表达的MBP,研究其功能提供了实验基础.     

杜氏盐藻叶绿体16S rRNA基因的克隆

目的：克隆和鉴定杜氏盐藻叶绿体16Sr RNA基因。方法：根据衣藻、小球藻等绿藻叶绿体16Sr RNA基因序列,利用软件分析找出其高度保守区,据此设计引物,PCR扩增杜氏盐藻叶绿体16Sr RNA序列,并与莱茵衣藻、普通小球藻、绿肾藻和原始绿藻Mesostigma Vivide进行同源性比较。结果：序列分析表明所克隆的序列1110bp与莱茵衣藻、普通小球藻、绿肾藻和原始绿藻Mesostigma Vivjde 4种绿藻的序列同源性分别为85．0％、79.9％、81．3％和81．6％。结论：本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻的叶绿体16S rRNA基因。     

抗生素及草酊磷对盐藻生长的影响

目的：研究常用抗生素和草酊磷（Phosphinothricin,PPT)对盐藻生长的影响。方法：在固体培养基中加入不同浓度的卡那霉素、青霉素、链霉素、壮观霉素、利福平和PPT，在液体培养基中加入不同浓度PPT，对盐藻进行选择培养，观察盐藻在选择试剂作用下的生长情况。结果：卡那霉素、青霉素、链霉素、壮观霉素1600mg/L时尚不影响固体培养基中盐藻的生长；利福平400mg/L时可完全抑制固体培养基中盐藻的生长；而PPT3mg/L时即可完全抑制固体和液体培养基中盐藻的生长，5mg/L时可以杀死液体培养基中的盐藻。结论：PPT对盐藻的生长具有很强的抑制作用，在基因工程中，以抗除草剂（BAR）基因作为盐藻的选择标记基因研究盐藻的转化是合适的，草酊磷可以作为有效的选择试剂。     

2种PCR方法扩增盐藻肌动蛋白基因3'旁侧序列比较

目的：比较扩增盐藻肌动蛋白基因3’旁侧序列的2种PCR方法。方法：用pvuⅡ、EcoR Ⅴ和StuⅠ3种限制性内切酶消化盐藻基因组DNA后，供2种PCR用，一种是连接介导法PCR(LMPCR)，与用人工合成的适配子相连并用适配子引物和盐藻肌动蛋白基因特异引物扩增未知序列；另一种是反向PCR(IPCR)，酶切后的DNA自身环化做模板，用2对基因特异引物反向扩增。结果：2轮PCR后，LMPCR中得到大量的非特异扩增产物，测序结果发现许多产物是由适配子引物AP2单独扩增引起。而反向PCR在得到pvuⅡ和Stu Ⅰ消化的自连文库中扩增得到2．5kb特异产物，经测序发现，片段两侧为基因特异引物，部分序列与已知序列相一致。Southern也进一步证实了IPCR扩增片段来源于盐藻基因组DNA。结论：IPCR技术在克隆基因旁侧序列时优于LMPCR方法。     

Transfer of Paralytic Shellfish Toxins via Marine Food Chains：A Simulated Experiment

Objective To study the transfer of paralytic shellfish toxins (PST) using four simulated marine food chains: dinoflagellate Alexandrium tamarense→Artemia Artemia salina→Mysid shrimp Neomysis awatschensis; A. tamarense→N. awatschensis; A. tamarense→A. salina→Perch Lateolabrax japonicus; and A. tamarense→L. japonicus. Methods The ingestion of A. tamarense, a producer of PST, by L. japonicus, N. awatschensis, and A. salina was first confirmed by microscopic observation of A. tamarense cells in the intestine samples of the three different organisms, and by the analysis of Chl.a levels in the samples. Toxin accumulation in L. japonicus and N. awatschensis directly from the feeding on A. tamarense or indirectly through the vector of A. salina was then studied. The toxicity of samples was measured using the AOAC mouse bioassay method, and the toxin content and profile of A. tamarense were analyzed by the HPLC method. Results Both A. salina and N. awatschensis could ingest A. tamarense cells. However, the ingestion capability of A. salina exceeded that of N. awatschensis. After the exposure to the culture of A. tamarense (2 000 cells·mL-1) for 70 minutes, the content of Chl.a in A. salina and N. awatschensis reached 0.87 and 0.024 μg·mg-1, respectively. Besides, A. tamarense cells existed in the intestines of L. japonicus, N. awatschensis and A. salina by microscopic observation. Therefore, the three organisms could ingest A. tamarense cells directly. A. salina could accumulate high content of PST, and the toxicity of A. salina in samples collected on days 1, 4, and 5 of the experiment was 2.18, 2.6, and 2.1 MU·g-1, respectively. All extracts from the samples could lead to death of tested mice within 7 minutes, and the toxin content in artemia sample collected on the 1st day was estimated to be 1.65×10-5 μg STX equal/individual. Toxin accumulation in L. japonicus and N. awatschensis directly from the feeding on A. tamarense or indirectly from the vector of A. salina was also studied. The mice injected with extracts from L. japonicus and N. awatschensis samples that accumulated PST either directly or indirectly showed PST intoxication symptoms, indicating that low levels of PST existed in these samples. Conclusion Paralytic shellfish toxins can be transferred to L. japonicus, N. awatschensis, and A. salina from A. tamarense directly or indirectly via the food chains.     

杜氏盐藻核基质的制备

目的：制备盐藻核基质,进而分离核基质结合区(matrix attachment regions)。方法：采用体积分数0．5％ TritonX—100破碎细胞,体积分数15％Percoll分离盐藻细胞核,二碘水杨酸锂(1ithium diiodosalicylate,LIS)抽提核蛋白,SDS—PAGE电泳分析蛋白质成分。结果：分离出了高纯度的盐藻细胞核,电泳分析表明绝大部分核蛋白已被去除。结论：体积分数0．5％TritonX—100能有效破碎盐藻细胞,体积分数15％Percoll可分离高纯度的盐藻细胞核,25mmol／L LIS抽提可除去盐藻绝大部分核蛋白获得核基质。     

杜氏盐藻RbcS基因cDNA片段的克隆和序列分析

目的：克隆杜氏盐藻-，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶(RuBisCO)小亚基RbcS cDNA片段。方法：根据莱茵衣藻、团藻、玉米等真核生物的RuBisCO小亚基RbcS氨基酸的高度保守序列ETRSYLPP和MNKLPMFG，设计一对简并引物，采用RT—PCR方法及该简并引物克隆杜氏盐藻RbcS cDNA。PCR产物经T—A克隆与T-vector相连，转化大肠杆菌JM109，随机挑取数个菌落，筛选鉴定，对阳性克隆进行测序分析。将测序结果推导成氦基酸序列进行同源性比较。结果：得到的cDNA长度为209bp，编码69个氨基酸。推导的氦基酸序列与团藻、Chloromonas sp．ANT3、衣藻、伞藻、菠菜、玉米的Rbc S相比较，同源性分刖为85％、84％、82％、76％、70％、69％。结论：所克隆的序列为杜氏盐藻RbcS DNA片段。     

杜氏盐藻高盐诱导蛋白的分离和鉴定

目的:对高盐和低盐培养条件下杜氏盐藻蛋白质组的双向电泳(2-DE)图谱进行比较分析,筛选高盐诱导蛋白并鉴定.方法:提取高盐(3.5 mol/L NaCl)和低盐(1.5 mol/L NaCl)培养条件下杜氏盐藻的总蛋白并进行2-DE,考马斯亮蓝染色后用Image-Scanner扫描仪扫描,ImageMaster 5.0...     

不同浓度骨髓基质细胞修复大鼠牙周组织缺损的实验研究

目的探讨不同浓度骨髓基质细胞（BMSCs）对牙周组织再生的影响。方法将BMSCs以不同浓度（5×105,5×106,5×107mL-1）与胶原膜BME-10X复合培养后,复合物和空白胶原膜BME-10X分别植入SD大鼠牙周缺损部位,并覆盖膨体聚四氟乙烯膜（e-PTFE膜）,以缺损处只覆盖e-PTFE膜为对照组,4周后取材,H-E染色观察牙周组织再生情况。结果各实验组新生牙槽骨面积与对照组相比有明显增加（P〈0.05）,5×106,5×107mL-1组的新生牙槽骨量与5×105mL-1和空白BME-10X组比较,差别有统计学意义（P〈0.05）,而5×106,5×107,5×105mL-1与空白BME-10X组组间比较则无统计学意义（P〉0.05）;各组新生牙骨质面积之间差别无统计学意义（P〉0.05）。结论 BMSCs浓度可影响其体内成骨能力,高浓度BMSCs能有效促进牙周组织再生。     

Anti-spermatogenic Effects of Ethanol Extract of Mucuna Urens

Objective To investigate the age-long claim by the locales that the food thickener, M. urens seed, has antispermatogenic, hence, antifertility effects in man. Methods Eight-week old male Albino rats were used as the mammalian model for this study. They were assigned to four groups of 6 rats each and treatment with the ethanol extract was for a period of 14 d. The treatment regimes were 70 mg/kg, 140 mg/kg, 210 mg/kg and 0 mg/kg BW in groups A, B, C and D, respectively. Extracts were prepared by Soxhlet extraction using 80% ethanol as the extracting solvent. The stock solution was prepared by dissolving 1 g of the paste extract in 10 ml corn oil （vehicle） to make up 100 mg/ml concentration. At the end of the treatment, sperm from the distal caudal epididymis was collected and analyzed for sperm count, sperm motility and sperm morphology. Results Significant reduction was observed in sperm count and sperm motility （P〈0.05）. The mean sperm count for group A was 6.27±0.02×10^6, for group B was 6.16±0.02×10^6 and group C had 6.0±0.0×10^6 sperm cells The control （group D） had a mean sperm count of 6.50±0.09×10^6 which was higher than that of any treated group. Results of the sperm motility test gave the following mean rates for motile sperm cells after treatment： group A, 57.6±% 2.1; group B, 50.0±4.0; group C, 45.0±4.0. The control had the highest mean motility rate of 72.3±2.1. The observed sperm abnormalities included unusual head with large acrosome, looped tailpiece, mid piece with distal droplet, pin head, pyriform head and long hook.Conclusion The anti-spermatogenic effects of the extract on the sperm in the Albino rat may lead to reduction of fertility.