A Study on Preparation of Anti-helicobacter Pylori Egg Yolk IgY and Its Biological Activity

目的:从免疫了幽门螺杆菌(Hp)抗原的母鸡蛋黄中提取抗Hp-IgY.方法:用超声破碎的Hp抗原免疫21周龄罗曼产蛋母鸡,取免疫后所产鸡蛋卵黄,利用水稀释法加硫酸铵盐析方法,提纯IgY,ELISA间接法检测抗体效价,Bradford法检测抗体蛋白含量,SDS-PAGE法检测其相对分子质量及纯度.结果:母鸡初次免疫后第7天,抗体效价即渐渐升高,约第45天达到高峰;蛋黄抗体经纯化后,抗Hp-IgY蛋白纯度可达90％以上,含量为6.25 g/L.结论:用超声破碎的Hp抗原免疫母鸡,盐析法提纯免疫母鸡产蛋黄中的抗Hp-IgY,可获得高纯度及高效价的抗Hp的特异性蛋黄抗体.     

鸡抗内毒素卵黄抗体IgY的制备

目的：研究分别应用内毒素（LPS）、类脂A(LipidA)和大肠杆菌突变株15免疫鸡后其蛋黄中抗内毒素抗体IgY的产量、纯度、效价并筛选最佳免疫抗原。方法：分别应用内毒素（LPS）、类脂A(LipidA)和大肠杆菌J5突变株作为抗原免疫25周龄Leghom鸡，水溶法（WD）提取蛋黄中抗体IgY，双紫外光测定抗体含量，SDS-PSGE电泳检测抗体纯度，细胞酶联染色和ELISA检测抗体特异性、效价及筛选最佳免疫抗原。结果：3种抗内毒素IgY含量和效价分别为14.4mg/ml和1：12 800（J5）、10.61mg/ml和1：12 800（LPS）、9.26mg/ml和1：3200（LipidA），抗体纯度均为95％左右。结论：大肠杆菌突变株J5和内毒素（LPS）为最佳免疫抗原，免疫鸡后其蛋黄中抗内毒素抗体IgY的产量和效价最高。     

含抗幽门螺杆菌特异性抗体免疫牛奶的制备

目的 :寻求幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)感染的防治方法。方法 :应用空肠弯曲菌选择培养基对胃镜取出的胃粘膜组织进行Hp培养及细菌学检查 ,用该菌免疫牛 ,采用 0、15、30、4 5天四次接种免疫 ,制备含高效价的抗Hp抗体的牛奶。 结果 :在牛被免疫 4 5天时 ,经琼脂免疫双扩散法检测 ,牛血中抗Hp抗体效价为 1:32 ,牛奶中抗Hp抗体的效价为 1:16。牛被免疫 5 0天时 ,琼脂免疫双扩散法检测 ,牛血和牛奶中抗Hp抗体效价均可达 1:32 ;酶联免疫试验 (ELISA)法检测 ,牛被免疫 5 0天时 ,牛血中抗Hp抗体效价可达 1:5 12 0 0 ,牛奶中抗Hp抗体的效价为 1:10 2 4。结　论 :经幽门螺杆菌免疫后的奶牛 ,在免疫 4 5天后即可获得高效价的抗Hp抗体牛奶。该方法为Hp感染的特异性防治开辟了美好的前景。     

抗白念珠菌鸡卵黄抗体的制备及温度对其效价的影响

目的:制备抗白念珠菌鸡卵黄抗体(IgY)并检测其生物学性能.方法:白念珠菌标准菌株10231灭活后作为抗原免疫25周龄产蛋海蓝鸡,从水溶法提取鸡卵黄IgY抗体.用考马斯亮蓝染色法测定IgY抗体提取液的蛋白浓度.用Tris-tricine电泳测定提取蛋白的相对分子质量、纯度,Western blot确定蛋白来源.以免疫组织化学检验抗白念珠菌IgY抗体与白念珠菌结合的特异性.ELISA测定抗白念珠菌IgY抗体的抗菌效价.结果:IgY抗体液中蛋白浓度为7.9 g/L,IgY抗体的纯度达到91.5%.提取的IgY抗体与鸡血清和正常鸡IgY抗体具有同源性.提取的IgY抗体可与白念珠菌发生特异性结合. ELISA测定抗白念珠菌IgY抗体的效价达到1:12 000.结论:研究得到的IgY,产量和纯度高,效价好,体温条件下48 h效价没有降低.在体外能够特异性地与白念珠菌结合.     

兔抗猪Ⅱ型胶原抗血清的制备与检测

目的：采用纯化的猪Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔制备Ⅱ型胶原抗体,并经改良的ELISA法检测确定Ⅱ型胶原抗体效价。方法：提取猪Ⅱ型胶原,经层析纯化,将纯化无菌Ⅱ型胶原与不完全佛氏佐剂等量混合,注射于兔脚掌、背部和皮下。并每隔20天追加抗原刺激,共3次,每隔一定时间收集血浆,以ELISA法检测抗Ⅱ型胶原抗体。结果：提纯猪Ⅱ型胶原纯度与Sigma标准品一致。Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔,抗体含量具二个高峰期,分别在首次致敏后第21天和第40天,免疫第40天抗血清的效价达1：2430。结论：采用纯化猪Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔短期内可产生高效价抗体。     

抗钩虫特异性卵黄抗体的制备与鉴定

目的 制备并鉴定特异性抗十二指肠钩虫鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),为分析抗钩虫IgY抗体的作用奠定基础.方法 制备十二指肠钩虫成虫粗抗原,经皮下和肌肉注射免疫25周产蛋海兰母鸡3次,每只鸡每次的免疫剂量为200 μg,初次免疫后28 d进行加强免疫,加强免疫间隔时间为10 d.水稀释法提取卵黄中的IgY,盐析、透析法纯化IgY,BCA法测定蛋白含量,并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot分析.ELISA法动态检测抗体效价,观察抗体效价变化.结果 免疫后55 d的每个鸡蛋能提取40~55 mg IgY,经SDS-PAGE和Western blot分析,纯化的IgY有2条主带,分子量分别是35 ku和60 ku,即IgY的轻链和重链.初次免疫后10 d左右出现抗体,至免疫后50~55 d为高峰,效价达到1 ∶ 10 000以上.IgY与人血清抗体均可识别30 ku处钩虫抗原.结论 十二指肠钩虫成虫粗抗原免疫的海兰母鸡能产生高浓度、高效价、特异性的IgY抗体,为分析抗钩虫IgY抗体的作用奠定了基础.     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的 分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体.方法 应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度;用Western-blot、ELISA法检测纯化后IsG性质及效价.结果 重组NS1蛋白获得分泌表达,其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1:6000.结论 重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础.     

猪囊尾蚴cC1蛋白的原核表达及其特异性鸡卵黄抗体的制备与鉴定

目的 制备并鉴定特异性抗猪囊尾蚴鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),为猪囊尾蚴病的免疫学诊断提供新的途径.方法 原核表达猪囊尾蚴抗原cC1蛋白,纯化后经皮下和肌肉多点注射免疫25周产蛋海兰母鸡,200 μg/只,首次免疫28 d后加强免疫3次,每次间隔10 d.ELISA法检测IgY抗体效价,Akita法和EGGstractT...     

抗胸腺淋巴细胞球蛋白的研究

从胎儿胸腺分离淋巴细胞,作为抗原用以免疫家兔、用玫瑰花抑制试验测定效价,当效价达到1:5000以上时采血,分离血清。经杂抗体吸收和Sephadex—A_(50)浴法提纯免疫球蛋白部分。提纯的抗淋巴细胞球蛋白与瑞士制抗淋巴细胞球蛋白等进行了比较。生物效价的对比中自制球蛋白与瑞士球蛋血效价高度相关,经统计学处理γ值为0.9。本文为了减少球蛋白在临床应用中的副作用,在吸收杂抗体时进行了肾组织抗原的制作和用制作肾抗原进行抗体吸收试验。经荧光免疫测定法证明,用此抗原吸收后的抗血清对肾脏切片呈阴性反应。     

抗内毒素鸡蛋黄抗体F(ab′)_2制备

目的研究抗内毒素鸡蛋黄免疫球蛋白(IgY)用胃蛋白酶切后提取的F(ab′)2片段,探索防治内毒素血症的新途径。方法用内毒素(LPS)作抗原免疫25周龄leghorn鸡,改良水溶法提取抗内毒素IgY,胃蛋白酶切后提取IgY F(ab′)2段,光密度法测抗内毒素IgY F(ab′)2浓度和含量、ELISA检测抗内毒素IgY F(ab′)2效价,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分子量及纯度。结果抗内毒素IgY F(ab′)2含量为1.04mg/ml蛋黄液,效价为1∶25600,纯度为90%,相对分子质量为24000。结论抗内毒素IgY F(ab′)2产量大、效价高、特异性强。     

抗肌A—A^＊0201重链卵黄抗体的制备及初步鉴定

OBJECTIVE: To prepare a high-titer specific and efficient egg yolk immunoglobulin (IgY). METHODS: The antigen of HLA-A* 0201 heavy chain was used to immunize the hens together with Freud's adjuvant and the eggs these hens laid were collected. IgY was purified from the egg yolk by water extraction, salt precipitation with ammonium sulfate and dialysis. The immunoactivity of the IgY was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its purity was determined by SDS-PAGE. RESULTS: The titer of IgY was 1 10(6) as shown by ELISA, with protein concentration of 9.77 mg/ml. The purity of the resultant IgY was more than 90% as suggested by SDS-PAGE analysis. CONCLUSIONS: The antigen of HLA-A* 0201 heavy chain along with complete Freund adjuvant is effective to elicit an immune response of hens for producing IgY antibodies in high yields.     

抗内毒素IgY的制备及稳定性研究

目的 用大肠杆菌J5制备特异抗内毒素IgY，探索防治内毒素血症的新途径。方法 用大肠杆菌J5作抗原免疫25周龄Roman鸡，水溶法提取抗体，进行SDS-PAGE及Western blot分析，通过酶联染色反应检测其免疫学活性，ELISA检测其时酸、碱和酶的稳定性。结果 抗体含量为11．4mg／ml蛋黄液，纯度为92．3％，分子量为180KD，初步鉴定其时内毒素具有特异性结合作用，并且对酸、碱、酶有很好的稳定性。结论 用大肠杆菌J5株免疫鸡可刺备出特异性抗内毒素的IgY，且具有良好的稳定性，作为口服制剂为预防和治疗内毒素血症奠定了基础。     

抗白色念珠菌鸡卵黄抗体(IgY)的研制

目的：观察鸡蛋黄中抗体的产量、纯度、来源及稳定性。方法：应用白色念珠菌作为抗原免疫25周龄Leghorn鸡，通过改良水溶法（WD）提取蛋黄中抗体IgY，双紫外光测定抗体含量，SDS-APGE电泳检测抗体纯度，Western blot免疫印迹法测定该抗体来源，ELISA检测热处理后的抗体活性。结果：抗体含量13mg/ml蛋黄液，抗体纯度达到95%，Western blot免疫印迹证明该抗体与鸡血清中的IgG具有相同的分子量和抗原性。ELISA检测热处理后的抗体活性，其具有良好的热稳定性。结论：鸡蛋黄内含有丰富的抗体，通过WD水溶提取法可得到高产量，高纯度的特异性抗体IgY，证明其来源于鸡血清中的IgG，对热具有高度稳定性。     

抗加特纳杆菌卵黄免疫球蛋白(IgY)的研究

目的 观察鸡卵黄中抗加特纳杆菌抗体的产量、纯度、来源及稳定性。方法 用阴道加特纳杆菌作为抗原免疫Leghorn鸡。通过改良水稀释法提取卵黄中的IgY。双紫外光波长测定抗体含量,SDS-PAGE电泳检测抗体纯度。Westernblot免疫印迹法测定该抗体来源。ELISA检测IgY对温度、酸碱度的稳定性。结果 抗体含量12．8mg／mL蛋黄液,抗体纯度达95％。免疫印迹证明IgY与鸡血清中的IgC具有相同的分子量和抗原性。IgY具有良好的热稳定性,对酸碱具有一定的耐受力。结论 WD水稀释法能得到高产量、高纯度的特异性IgY,而且有良好的生物学活性。     

p53蛋白的原核表达及其鸡卵黄抗体的制备

目的 制备抗p53蛋白卵黄抗体。方法 原核表达p53融合蛋白，纯化后免疫产蛋母鸡。结果 融合蛋白能有效刺激母鸡产生抗体，末次免疫后其卵黄抗体滴度达到1：10^4,并且能维持较长时间。结论 本文介绍的方法是一种简便、经济、特异、高效、均一、来源充足的抗体产生方法。     

抗HPV16L1 IgY抗体的制备及活性检测

目的 制备出高特异性的抗HPV16L1 IgY抗体,为HPV16L1蛋白的检测提供一种方法.方法 用纯化HPV16 L1蛋白免疫母鸡,分别收集鸡蛋,4℃下保存备用;经聚乙二醇法提取鸡蛋黄中IgY抗体;用酶联免疫吸附法检测IgY抗体效价的测定;采用免疫组织化学法通过对转染pcDNAEGFP-HPV16L1(含EGFP-HPV16L1融合基因)质粒的CHO细胞中L1蛋白的检测评价IgY抗体的特异性.结果 3次免疫之后,IgY抗体效价达到1:10 240,同时可特异性与转染pcDNAEGFP-HPV16L1(含EGFP-HPV16L1融合基因)质粒的CHO细胞中EGFP-HPV16L1 结合.结论 采用HPV16L1蛋白免疫母鸡,成功获得了较高效价的特异性IgY抗体,并可用于HPV16L1蛋白的细胞学检测,为IgY抗体在免疫组织化学检中的应用提供实验依据.     

副溶血性弧菌高免卵黄抗体的制备和不同提纯方法效果的比较

目的：通过比较聚乙二醇（PEG）沉淀法、氯仿抽提法和氯仿/PEG法3种卵黄抗体（IgY）提纯方法的提纯效果,为批量提纯高质量IgY提供依据。方法：制备副溶血性弧菌灭活疫苗,采用肌肉多点注射法免疫高产蛋鸡,收集鸡蛋,分别采用PEG沉淀法、氯仿抽提法和氯仿/PEG法对鸡蛋中的IgY进行提纯,比较3种提纯方法获得的IgY的蛋白质量浓度、抗体效价和纯度,结合操作过程、成本效益及安全性对3种提纯方法进行综合分析比较。结果：3种方法所提纯的IgY中,蛋白质量浓度从高到低依次为氯仿抽提法、氯仿/PEG法、PEG法;抗体效价相差不大,氯仿抽提法稍高;抗体纯度由高到低依次为PEG法、氯仿/PEG法、氯仿抽提法。PEG法安全性较好,但提取效率相对较低,成本投入较高;氯仿抽提法能够高效地从卵黄中获得IgY,但提取物中掺杂了大量的杂质蛋白;氯仿/PEG法提纯效率高,抗体纯度好,成本效益相对较高。结论：PEG法适用于实验室中少量IgY的提取;氯仿/PEG法的提取效率高,抗体纯度好,可用于批量提取高质量的IgY。     

抗哇巴因抗体IgY的制备及其应用

目的 制备高度特异性的抗哇巴因多克隆抗体,并将其应用于组织中内源性哇巴因的免疫学检测.方法 采用哇巴因.牛血清蛋白耦联物作为免疫原免疫母鸡.免疫后1周收集鸡蛋.鸡蛋黄采用PEG-6000方法进行纯化分离,并采用12%SDS-PAGE分析其纯度.酶联免疫吸附法检测IgY抗体效价.然后应用IgY的竞争性酶联免疫吸附法检测哇巴因水平,并将IgY应用于大鼠肾上腺组织中内源性哇巴因的检测.结果 IgY抗体效价在第二次免疫后迅速升高,最高效价达到1:10240,并持续至少4周左右.竞争性酶联免疫吸附法检测哇巴因的批内差异及批间差异分别为2.03%、2.34%.免疫组化结果显示内源性哇巴因主要分布于大鼠肾上腺皮质的网状带,髓质未见明显阳性颗粒.结论 免疫母鸡简单、快速,并且高效价抗体持续时间较长.同时本研究结果提示IgY抗体可用于常规免疫学检测.     

抗肠道病毒71型外壳蛋白1卵黄抗体的制备和鉴定

目的 克隆肠道病毒71型（EV71）BrCr株外壳蛋白1（VP1）基因,构建原核表达载体PET28a/VP1,表达VP1重组蛋白,以VP1免疫产蛋母鸡,获得抗VP1的鸡免疫球蛋白（IgY）.方法 培养Vero细胞,利用Vero细胞增殖肠道病毒EV71 BrCr株,提取病毒总RNA,利用RT-PCR扩增出VP1目的基因,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切获得目的基因,插入原核表达载体pET-28a,重组子同时BamHⅠ,EcoRⅠ双酶切和测序鉴定,转化入感受态工程菌E.coli BL21（DE3）,获得阳性重组工程菌,经IPTG诱导获得表达融合蛋白,试剂盒纯化蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,用VP1蛋白免疫开产母鸡,收集鸡蛋,利用EGG stractTM IgY Purification System试剂盒提取卵黄抗体IgY,间接ELISA测滴度,SDS-PAGE和Western blotting验证其表达量和免疫活性.结果 本实验成功扩增出肠道病毒EV71 BrCr株VP1基因,获得了含重组表达质粒pET28a/VP1的阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1蛋白,VP1经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,利用纯化后VP1蛋白免疫产蛋母鸡,提取的IgY经ELISA 鉴定后其滴度为1：104,SDS-PAGE和Western blotting证实为抗VP1的特异性IgY.结论 成功的从EV71 BrCr株扩增出VP1基因,构建了PET28a/VP1表达载体,获得高效表达融合蛋白,免疫产蛋母鸡后制备高效价抗VP1蛋白的特异性IgY.