检测动物棘球蚴的3种PCR方法的比较

目的 比较多重PCR(muhiplex PCR)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、半巢式PCR等3种检测棘球蚴的PCR方法,优化可区分多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫羊株(G1型)和骆驼株(G6型)、石渠棘球绦虫和带科绦虫的方法.方法 根据细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、石渠棘球绦虫、带科绦虫线粒体基因序列,用...     

基于重组酶介导等温扩增技术的3种棘球绦虫核酸检测方法的建立及初步应用

目的　基于重组酶介导的等温扩增技术（recombinase⁃aided isothermal amplification assay, RAA）建立一种快速检测多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫的多重核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法　分别以多房棘球绦虫（GenBank登录号：NC_000928）、细粒棘球绦虫（GenBank登录号：NC_044548）和石渠棘球绦虫（GenBank登录号：NC_009460）线粒体基因组序列为靶序列,依据RAA引物设计基本原则设计、合成3对引物,并进行多重RAA扩增。分别扩增不同浓度3种棘球绦虫基因组DNA和不同浓度含3种靶基因的重组质粒,以评价多重RAA检测方法的敏感性;同时采用该方法检测3种棘球绦虫及多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫基因组DNA,以评价该方法的特异性。优化建立的多重RAA法的条件,再检测棘球蚴病病变组织样本、模拟犬粪便样本和现场狐狸粪便样本,以评价该方法的应用价值。结果　所建立的多重RAA检测方法可在39 ℃时40 min内特异性扩增多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫线粒体基因片段,长度分别约为540、430 bp和200 bp。该多重RAA法对多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA的最低检测限为2.0、2.5 pg/μL和3.1 pg/μL,对含多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫靶基因的重组质粒的最低检测限均可达到200拷贝/μL;该多重RAA法可以同时检测出多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫单一感染和多重感染,对多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫无扩增。优化后的多重RAA法能够检测出全部棘球蚴病病变组织样本及模拟犬粪样本和现场狐狸粪便样本中的阳性样品,且与单一PCR法检测结果完全一致。结论　成功建立了一种可用于多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA快速检测的多重RAA法,特异性和敏感性均较高。     

5对引物检测犬棘球蚴病感染方法评价

目的评估5对引物检测犬棘球蚴病感染的PCR方法并建立可将多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫羊株(G1型)和骆驼株(G6型)区分的方法。方法选用引物BG1/3、Bretange:1/2、Eglf/lr、EM-H15/H17和Cabrera:1/2,扩增稀释的细粒棘球绦虫虫卵DNA,进行敏感度测定。对水泡带绦虫、多头绦虫、羊绦虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫G1型和G6型进行PCR扩增,测定引物的特异度。结果5对引物在体外均能检测出1个虫卵的稀释度。Cabrera:1/2引物能在6种寄生虫样本中扩增出相同片段大小的条带;Bretange:1/2引物可以扩增出多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫G1型和G6型;BG1/3引物可以在多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫G1型中扩增出1条带,在细粒棘球绦虫G6型中扩增出2条带;Eglf/lr可以在细粒棘球绦虫G1型和G6型中扩增出相同片段大小的条带;EM-H15/H17可以在多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫G6型中扩增出相同的条带。结论5对引物中BG1/3具有较强的特异性,其余4对引物特异性不强;利用BG1/3和Eglf/lr、EM-H15/H17组合可以方便区分细粒棘球绦虫G1型、G6型和多房棘球绦虫。     

应用抗细粒棘球绦虫Ag5和AgB的单克隆抗体分析带绦虫抗原

细粒棘球绦虫是最重要的带绦虫之一。其它带绦虫与细粒棘球绦虫一样,其幼虫阶段常感染相同的宿主,以致免疫学上常常难与细粒棘球绦虫区分。自在细粒棘球绦虫囊液中鉴定出抗原5(Ag5)和抗原B(AgB)以来,人畜包虫病诊断的特异性已大有改进,但由于在感染多房棘球绦虫、伏氏绦虫(E.vogeti)和猪囊尾蚴的病人血清中以及感染水泡绦虫、羊绦虫的     

PCR-RFLP在细粒棘球绦虫种株鉴定中的应用

目的根据细粒棘球绦虫线粒体DNA rrnL区段基因特征,建立一种新的细粒棘球绦虫种株（基因型）鉴定技术。方法应用PCR-RFLP方法,对新疆不同地区44个囊型包虫病（CE）病人分离株标本提取DNA,用特异性引物对mtDNA rrnL基因片段进行PCR扩增,将扩增产物用限制性内切酶SspI和Bg1Ⅱ消化,再用琼脂糖凝胶电泳分析片段大小,进行基因型鉴别。结果CE病人分离株PCR扩增产物均不能被限制性内切酶SspI酶切,为细粒棘球绦虫;其中43个病人分离株的PCR扩增产物不能被限制性内切酶Bg1Ⅱ酶切,为细粒棘球绦虫G1基因型;1个病人分离株的PCR扩增产物被Bg1Ⅱ切成158 bp和403 bp 2条DNA片段,为细粒棘球绦虫G6基因型。结论根据细粒棘球绦虫线粒体DNA rrnL区段基因特征建立的PCR-RFLP技术可用于细粒棘球绦虫的基因型鉴别。     

基于重组酶介导等温扩增技术的细粒棘球绦虫核酸检测方法的建立

目的　建立一种基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）的细粒棘球绦虫核酸检测方法。方法　针对细粒棘球绦虫12S rRNA基因序列片段,设计、筛选并合成RAA特异性扩增引物和荧光检测探针,构建细粒棘球绦虫荧光RAA检测方法。分别以含靶序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度细粒棘球绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;分别以细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果　成功建立了细粒棘球绦虫荧光RAA检测法,在39 ℃条件下20 min内可以实现对细粒棘球绦虫基因组DNA特异性扩增,最低可以检测出10拷贝/μL含靶序列的重组质粒DNA和0.1 ng/μL细粒棘球绦虫基因组DNA样本,具备较高敏感性;对多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA均无阳性扩增,具备较高特异性;且该荧光RAA法可成功检出细粒球绦虫包囊中DNA。结论　成功建立了一种快速、灵敏、特异的可用于细粒棘球绦虫核酸检测的荧光RAA法。     

PCR方法诊断家犬感染细粒棘球绦虫的特异性及在临床诊断中的应用价值

目的验证PCR方法检测终宿主家犬感染细粒棘球绦虫的特异性及其在临床诊断中的应用价值。方法取感染细粒棘球绦虫家犬粪便,显微镜下计数细粒棘球绦虫虫卵,稀释后PCR检测其敏感性。同时取家犬小肠内水泡带绦虫、多头绦虫、羊绦虫,将其DNA与细粒棘球绦虫DNA一起进行PCR扩增,观察其特异性。对133 bp的目标条带进行序列测定,对比分析。结果PCR检测终宿主家犬感染细粒棘球绦虫具有高度的灵敏性,即使粪便中有1个虫卵(8pg的DNA),也能测出,但扩增后特异性较差,无法利用扩增带型进行诊断。4种寄生虫均具有相同的133 bp DNA重复序列,在400 bp均可检测出相同条带。结论PCR方法检测终宿主感染细粒棘球绦虫DNA重复序列尽管有优良的灵敏性,因其特异性差,不适合用于临床诊断和推广。     

细粒棘球绦虫的种内变异及对人体的致病性

以往主要是从形态学、生物学及生物化学的角度研究细粒棘球绦虫虫株之间的差异,目前从基因水平进一步证实了差异的存在。流行病学资料和分子生物学研究提示细粒棘球绦虫的羊株、牛株和鹿株对人具有致病性,而马株、骆驼株和猪株对人致病性很低或无致病性。     

犬体内细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的混合感染

目的 证实家犬体内是否存在细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫混合感染。方法 从新疆和静县巴音布鲁克草原现场收购的30条牧羊犬,经麻醉后处死解剖,在1只雌性牧羊犬小肠内发现棘球绦虫成虫1万条以上,经显微镜观察,疑为细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫混合感染。用Eg1f/r和EM-15/17EM引物分别对两种棘球绦虫的线粒体DNA特异目的片段进行序列分析鉴定。结果 形态学观察:细粒棘球绦虫孕节长大,生殖孔偏后,位于节片一侧中部。子宫有不规则的分支和侧突(侧囊),内含虫卵200~800个。多房棘球绦虫较短小,4~5体节。孕节中子宫呈简单的囊状,无侧囊。生殖孔开口于侧缘的前半部。线粒体12S RNA序列鉴定,扩增样本DNA经同源序列比较发现,与细粒棘球绦虫G1型具有相同的序列;扩增样本与多房棘球绦虫具有相同的序列。分别确定为细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫两种虫种。结论 首次证实家犬体内存在细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的混合感染。     

细粒棘球绦虫的种内变异及对人体的致病性

以往主要是从形态学、生物学及生物化学的角度研究细粒棘球绦虫虫株之间的差异，目前从基因水平进一步证实了差异的存在。流行病学资料和分子生物学研究提示细粒棘球绦虫的间株、牛株和鹿株对人具有致病性，而马株、骆驼株和猪株对人致病性很低或无致病性。     

Copro-diagnosis of Echinococcus granulosus infection in dogs by amplification of a newly identified repeated DNA sequence

Diagnosis of Echinococcus granulosus infection in dogs by detecting adult worms recovered post mortem or purged from the intestines after treatment with arecoline is not suitable for mass screening. Large-scale diagnosis by detection of copro-antigens is useful but only with relatively high intensity infections, and only by genus. To provide a more sensitive and specific diagnosis, a polymerase chain reaction (PCR) assay was developed, that amplified a target repeated sequence (EgG1 Hae III) newly identified in the genome of the common sheep strain of E. granulosus. This repeated sequence consists of approximately 6,900 copies, arranged in tandem, in groups of 2-6 repeats. The corresponding primers used in the PCR easily detected a single egg with no cross-amplification of DNA from closely related cestodes, including E. multilocularis and Taenia spp. Fecal samples from naturally infected dogs, with 2-10,000 E. granulosus worms at necropsy, were all PCR positive, while E. multilocularis or Taenia spp. positive controls as well as non-endemic controls were all PCR negative. This copro-PCR assay was demonstrated to be 100% specific and also detected all necropsy-positive E. granulosus-infected dogs. It is suggested that this copro-PCR assay has the potential for pre-mortem diagnosis of E. granulosus infection even in areas where E. granulosus and E. multilocularis are co-endemic.     

Molecular genetic characterization of different isolates of Echinococcus granulosus in east and southeast regions of Turkey

We used PCR-RFLP analysis of ribosomal ITS1 fragment using four different restriction enzymes and DNA sequencing of mitochondrial CO1 gene to investigate the genetic characteristics of isolates of Echinococcus granulosus obtained from different hosts (179 sheep, 19 cattle, 7 goat, 1 camel, 1 dog and 1 human) and regions (Elazig, Malatya, Erzurum, Van, Diyarbakir and Sanliurfa) of Turkey. The report represents the most comprehensive genotypic investigation of E. granulosus isolates undertaken in Turkey, with Turkish samples of cattle, goat, camel and dog origin being characterized for the first time. We show that the predominant genotype involved in E. granulosus transmission in Turkey is the common sheep strain (G1 genotype) infecting humans, cattle, sheep, goats, camels as well as the dog definitive host. Nevertheless, we urge that coordinators of local control programs in Turkey should take into consideration the potential occurrence and risk of additional strains of E. granulosus infecting humans and animal hosts, and plan accordingly.     

新疆新源县和四川石渠县啮齿动物及家畜棘球绦虫线粒体cox1基因遗传多态性分析

目的了解新疆新源县和四川石渠县棘球绦虫线粒体细胞色素。氧化酶亚基1 (cox1)基因的遗传多态性,探讨棘球绦虫在我国的传播动力和传播方向。方法 2014-2018年,在新疆新源县、四川石渠县捕捉啮齿类动物并采集其肝组织样品,收集家畜病变脏器。提取肝组织和病变脏器组织的DNA,PCR扩增棘球绦虫cox1基因片段,经分子克隆、测序后,在NCBI数据库中比对以确定所感染的虫种。使用Clustal X2和MEGA 7剪辑序列,使用DnaSP v5和Arlequin 3.5计算核苷酸多态性和中性检验,分析新源县和石渠县棘球绦虫的遗传多样性。以石渠棘球绦虫为外群,用MrBayes 3.2.4建立基于cox1基因的贝叶斯系统进化树,总结分析虫种的基因型。采用Network 5.0绘制棘球绦虫cox1基因的单倍型网络图,分析单倍型结构。结果在新疆新源县捕获普通田鼠122只,收集绵羊病变脏器5个;在四川石渠县捕获青海田鼠144只、经营田鼠44只和高原鼠兔135只,收集牦牛病变脏器6个。其中从5只绵羊、4头牦牛的病变脏器样品DNA扩增获得细粒棘球绦虫cox1基因片段40条(新源县26条,石渠县14条),从8只普通田鼠、14只青海田鼠、5只经营田鼠和2只高原鼠兔获得多房棘球绦虫线粒体cox1基因59条(新源县20条,石渠县39条),扩增产物长度均为875 bp。细粒棘球绦虫在两地的遗传分化程度(Fst=0.088 63)高于多房棘球绦虫(Fst=0.000 88),新源县细粒棘球绦虫遗传多样性(0.002 58±0.000 46)低于石渠县(0.005 88±0.000 58),而其多房棘球绦虫遗传多样性(0.002 28±0.000 46)高于石渠县(0.001 37±0.000 30)。贝叶斯系统进化树显示,两地的细粒棘球绦虫基因型为G1型,多房棘球绦虫为亚洲型。序列比对发现25个细粒棘球绦虫cox1基因单倍型(新源县15个,石渠县9个,共同单倍型1个)和29个多房棘球绦虫cox1基因单倍型(新源县13个,石渠县15个,共同单倍型1个),两种棘球绦虫的单倍型网络图均为环绕主单倍型(共同单倍型)的辐射状结构,新源县的细粒棘球绦虫序列中有9条为主单倍型(34.6%,9/26),而石渠县仅有1条(1/14),显示出新源县在细粒棘球绦虫单倍型结构中的核心位置;石渠县的多房棘球绦虫基因序列中有23条为主单倍型(58.9%,23/39),而新源县为7条(35.0%,7/20),表明石渠县在多房棘球绦虫的单倍型结构中更具有主导地位。结论新源县和石渠县的棘球绦虫线粒体cox1基因型一致,但遗传多态性存在一定差异,同等空间跨度上细粒棘球绦虫的遗传分化程度要高于多房棘球绦虫,这些差异为探讨棘球绦虫传播方向和动力提供了重要参考依据。     

环介导等温扩增技术(LAMP)检测棘球绦虫感染犬粪DNA的研究Ⅱ

目的 为有效地控制预防流行区犬科动物的棘球绦虫感染情况,建立一种快速检测棘球绦虫感染犬的粪便DNA检测方法—环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification. LAMP)。方法 针对细粒棘球绦虫线粒体DNA ND2基因6个位点特异性的设计4条LAMP引物,利用LAMP法和普通PCR方法同时检测棘球绦虫、肥胖带绦虫以及犬肠道内的其它寄生虫DNA来验证LAMP方法的特异性;将转入ND2基因片段的质粒作为标准阳性对照,并做梯度稀释后同时用 LAMP 和 PCR 方法进行检测比较两者的敏感性。此外,将采集的46份犬粪便标本提取DNA,分别运用LAMP和犬尸体剖检进行感染犬的初步检测评估。结果 E.g mtDNA ND2基因的LAMP引物能够鉴别多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫这两个相近的种属,并不与其它待检寄生虫发生交叉反应,且最低检测限度为4×10¹拷贝(灵敏度比普通PCR高出10³倍)。在初步对46份犬粪便DNA检测结果中 ND2 LAMP 引物显示出较好的灵敏度和特异度,χ²检验结果该方法与犬尸体剖检方法的诊断效果无统计学差异。结论 本研究初步建立了LAMP技术检测细粒棘球绦虫感染犬的新方法,在各项特异度、灵敏度和样本检测中展现出较好的效果。该方法不需要昂贵的仪器设备和繁琐的电泳分析过程,有望成为流行区和基层兽医站细粒棘球绦虫感染犬检测的新方法。     

重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫的核酸检测方法,并进行检测效果评价。方法以多房棘球绦虫线粒体基因序列(GenBank登录号:AB018440)作为靶序列,根据RAA反应原理设计并合成引物,利用该引物进行RAA扩增。以聚合酶链反应(PCR)作为平行对照,应用RAA方法扩增不同稀释浓度的多房棘球绦虫基因组DNA及梯度稀释的含不同拷贝数目的基因片段的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测的敏感性。应用此方法检测细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价其特异性。在对建立的方法进行条件优化后,检测9份感染多房棘球蚴的动物组织样本、3份模拟现场多房棘球蚴感染阳性犬粪样本以及2份现场阳性犬粪样本,以验证所建立的RAA方法的可靠性和实用性。结果所建立的RAA法可在40 min内特异性扩增多房棘球绦虫目的基因片段。以多房棘球绦虫基因组DNA为模板,RAA法最低检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10^4个。以细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA为模板,应用所建立的RAA法扩增结果均为阴性。应用本研究建立的RAA法检测感染多房棘球蚴的动物组织样本以及模拟和现场阳性犬粪便样本结果均为阳性,且与PCR法检测结果一致。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA检测方法,其在多房棘球绦虫虫种鉴定以及棘球蚴病基因诊断方面展现出较好应用前景。     

环介导等温扩增技术(LAMP)检测棘球绦虫感染犬粪DNA的研究

目的 建立快速检测棘球绦虫感染犬粪便的DNA检测方法一环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification.LAMP).方法 针对细粒棘球绦虫线粒体DNA Cox1基因6个位点特异性的设计4条LAMP引物,利用LAMP法和普通PCR方法同时检测棘球绦虫、肥胖带绦虫以及犬肠道内...     

细粒棘球蚴线粒体CO1基因的克隆与序列分析

目的 研究细粒棘球蚴(Echinococcus granulasus)种间遗传标记特点,为该虫种的分子分类学研究提供基础。方法 在内蒙古地区从羊肝脏采集细粒棘球蚴,肝包虫病患者手术剥离囊包后,签署知情同意书,采集细粒棘球蚴。提取虫体DNA,扩增线粒体细胞色素氧化酶1(CO1)基因,将其克隆到PGM-T载体后,用PCR技术鉴定阳性菌落,并进行测序,运用DNAstar5.0 软件计算序列间的相似性,计算遗传距离,同时,应用MEGA4.0软件的最大似然法(ML-Maximum Likelihood)和邻接法(NJ-Neighbor Joining)构建系统发育树,进行聚类分析。结果 细粒棘球蚴DNA扩增出的羊株、人株CO1基因序列片段长度为936 bp。同其他亲缘关系较近的属CO1基因序列比对:羊株、人株细粒棘球蚴CO1序列与黄花棘球绦虫的同源性最高,分别为91.9%、91.2%;羊株、人株细粒棘球蚴CO1序列与黄花棘球绦虫位于同一分支,自展值(Boostrap)最高,均为100%。羊株、人株细粒棘球蚴CO1序列所属分支与原头目的Proteocephalus macrocephalus所属分支相隔较远。结论 CO1基因序列稳定保守,无宿主特异性,可作为细粒棘球蚴理想的种间遗传标记。