脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用

<正>为研究细菌的流行特征、追踪传染源,国内外广泛采用的方法是对相关菌株进行分型,分析菌株间的同源性关系。细菌分型方法分为表型分型和基因分型两种,表型分型主要有根据菌落形态和生化特征等的生物分型、抗菌药物药敏谱分型、血清分型、噬菌体分型,基因分型包括质粒分型、核糖体分型、染色体DNA限制性内切核酸酶图谱分析(REA)、     

变性高效液相色谱分析浙江沿海地区ESBLs基因类型研究

目的运用变性高效液相色谱(DHPLC)技术,检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因型,了解浙江沿海地区ESBLs基因型分布情况。方法对171株多药耐药肠杆菌科细菌进行表型确证试验,采用多重PCR对标准菌株和ESBLs表型阳性的临床菌株进行CTX-M扩增,扩增产物经DHPLC分析,通过与标准菌株色谱峰比对进行临床菌株基因分型。结果 171株多药耐药肠杆菌科细菌,有142株临床菌株ESBLs表型阳性,经多重PCR扩增142株肠杆菌科109株携带CTX-M基因,52株为CTX-M-1产物,57株为CTX-M-9产物,检出率达79.80%,其中大肠埃希菌携带CTX-M基因比例最高,其次是肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌;109株临床菌株PCR产物经DHPLC分析检测出4种CTX-M基因型,33株携带CTX-M-3、19株携带CTX-M-15、5株携带CTX-M-9、52株携带CTX-M-14。结论运用DHPLC技术检测出CTX-M型ESBLs菌株有4种基因型,其中CTX-M-14型是CTX-M型ESBLs主要型别;该地区细菌携带CTX-M型ESBLs以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌最多见。     

陕西省布鲁氏菌分离株MLVA分型研究

目的 对陕西省1952—2019年以来保存的布鲁氏菌分离株进行MLVA分型研究,了解陕西省布鲁氏菌遗传变异情况,为制定预防控制策略提供依据。方法 基于MLVA技术对收集的121株布鲁氏菌分离株基因型进行研究,利用Bio Numerics 7.6软件进行聚类分析,计算辛普森指数。结果 基于MLVA-8分型,分为7种,即羊种菌5种（42、43、63、83及115型）,猪种菌1种（6型）及牛种菌1种（38型）,其中羊种42、43型占总数的91.74%;42型在全省10个市区均有分布;榆林、延安均有4种基因型,多样性较其他市区更丰富;基于MLVA-11,分为11种,基于MLVA-16对121株菌种进行聚类分析结果显示,所有菌株分为3个群,96个基因型,呈现基因型别的多样性,辛普森指数在0.000～0.800之间,Panel 1和Panel 2A多样性均明显低于Panel 2B。结论 MLVA技术可用于种属亲缘关系的确立、菌株遗传多样性分析以及分子流行病学溯源调查,陕西省布鲁氏菌MLVA分型显示高度基因多态性,提示陕西省布病流行呈零星和散发特征, 因此,降低传染源在区域之间的频繁流动,是控制布病疫情发生的有效手段。     

RAPD反应条件的优化及在微生物分型中的应用

分子生物学技术已成功应用于菌属内菌株分型。基因型分型比表型分更直接，可从根本上确定菌株遗传基因的相互联系及变异。与聚合酶链反应相结合的新的基因型分型方法日益受到欢迎，其中随机引物扩增多态性ＤＮＡ正广泛应用于越来越多的微生物分型中，     

布鲁氏菌PFGE分子分型的条件优化

[目的]将PFGE方法应用于布鲁氏菌分型研究,探索建立布鲁氏菌PFGE分型的最优化方法。[方法]在用PFGE方法进行布鲁氏菌基因分型的研究中,针对不同内切酶、酶切的浓度和时间、脉冲时间等影响PFGE分型结果的因素进行优化,利用优化后的条件对布鲁氏菌19株标准菌株进行分型研究。[结果]在布鲁氏菌的PFGE分型研究中,选择XbaI为内切酶、酶切浓度为96u/200μl、酶切时间为4h、脉冲时间为2～25s为PFGE电泳的优化条件,在分析的19株布鲁氏菌标准菌株中,6种布菌的PFGE图谱各不相同,但PFGE不能将种内不同生物型布菌完全区分开来。[结论]PFGE方法可用于布鲁氏菌的基因分型的研究,是对传统分型方法一种较好的补充。     

内蒙古自治区乌兰察布市羊种布鲁氏菌HOOF基因分型特征

目的 调查2012-2015年内蒙古自治区乌兰察布市83株布鲁氏菌HOOF分型特征。方法 对临床分离的83株布鲁氏菌采用常规方法和AMOS-PCR进行鉴定;利用8个数目可变串联重复序列 位点的HOOF分型方法对菌株进行基因分型,并用Hunter-Gaston 分辨指数评估各VNTR 位点的多态性和对菌株的综合辨别能力,采用BioNumerics 5.0软件聚类分析和构建聚类图。结果 83株试验菌全部为羊种布鲁氏菌,全部8个分型位点具有极高的多态性,多态性指数为0.998;其中6个位点（1、2、4~7）的多态性指数 ≥ 0.678,其分辨力主要来自多态性指数较高的位点。83株羊种布鲁氏菌聚为8大类76个基因型。6个共享基因型包括13株布鲁氏菌,提示感染患者具有流行病学相关性;另70株菌呈现独特的基因型,提示病原分离自无流行病学相关的散发患者。结论 乌兰察布市人布鲁氏菌病流行以散发和局部暴发共存,且散发为主,而交叉感染患者与传染源转移有关。     

RAPD在重症脑卒中患者呼吸机相关性肺炎病原学上的应用

目的 本研究探讨RAPD-PCR在医院感染病原菌流行病学分析上的应用. 方法收集重症脑卒中使用机械通气的患者中,呼吸机相关性肺炎常见致病菌并进行细菌表型鉴定及RAPD基因分型. 结果在生物学分型相同的细菌中有不同的基因型.通过基因分型能明确判定交叉感染及院内感染流行的存在. 结论 RAPD可用于医院感染的常规监控及临床用药指导.     

2014 - 2020年四川省人间布鲁氏菌病分离菌株多位点序列分型研究

目的了解四川省人间布鲁氏菌病(简称布病)分离菌株的分型情况。方法 66株菌株分离自2014 - 2020年四川省人间布病确诊病例, 分别应用BCSP31-PCR、AMOS-PCR方法对分离菌株进行属、生物型鉴定;选用多位点序列分型(MLST)-9方法对分离菌株进行分型实验, 通过在线全球MLST数据库对比序列型(ST);并通过BioNumerics 7.6软件, 使用最小生成树(MST)对新发现和已知ST序列进行聚类分析。结果 2014 - 2020年四川省自人间布病确诊病例分离的66株菌株均为布鲁氏菌属, 其中羊种布鲁氏菌65株, 牛种布鲁氏菌1株。存在3个已知ST(ST-8、ST-39、ST-2)和1个新发现型别(ST-101)。其中, ST-8为四川省主要ST(90.91%, 60/66), 另有4株羊种布鲁氏菌为ST-39, 1株牛种布鲁氏菌为ST-2。新发现型别ST-101于2019年分离自乐山市, 属羊种布鲁氏菌克隆群, 与ST-8进化关系紧密。结论四川省布鲁氏菌主要流行株为羊种布鲁氏菌, 主要基因型为ST-8, 同时存在少量ST-39、ST-101、ST-2。     

结核分支杆菌株水平鉴定技术及其研究进展

结核分支杆菌菌株分型对结核病流行病学调查和监测、传染源的发现、传播途径的阻断以及发病机制的研究都极为重要。结核分支杆菌的分型方法 ,主要分为非核酸法和核酸法。非核酸分型方法即传统分型方法 ,多是在细菌表型特征的基础上认识细菌的 ,包括生化分型法、血清分型法和噬菌体分型法。但由于结核分支杆菌分离株具有高度同源性 ,通过常规的生化试验和血清学方法是无法鉴别的 ,所以 ,对于结核分支杆菌 ,唯一可用的传统的菌株鉴定方法只有噬菌体分型法。随着分子生物学理论和技术的飞速发展 ,1980年以后 ,逐步建立了一些根据核酸序列进行菌…     

嗜肺军团菌分子分型研究进展

军团菌病主要由嗜肺军团菌引起,尤其以血清1型为多见。在军团菌病暴发流行时,为了了解环境标本与病人标本来源的分离株的亲缘关系,需要对其进行分型。目前主要有表型分型和分子分型。表型分型只能了解最基本的分型信息,而新近发展起来的基于DNA水平的分子分型在疫情的溯源及细菌群体进化研究中发挥着越来越重要的作用。该文对嗜肺军团菌分子分型方法进行综述。     

辽宁省2010年布鲁氏菌病疫情及 MLVA 分型

布鲁氏菌病(brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌属(Brucella)细菌侵入机体引起的人兽共患的传染-变态反应性疾病.近些年,辽宁省布病疫情呈明显的上升趋势,居中国前列,对人民生命财产安全造成了巨大的威胁[1].多位点可变数目串联重复序列(multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis,MLVA)[1]即多位点可变数量串联重复序列分析,是近年发展起来的以PCR为基础,根据被检菌株散在于基因组中不同位点的、变数量串联重复序列(variable number tandem repeat,VNTR)的重复单元拷贝数的差异来进行分子分型的技术.为分析辽宁省2010年布病的流行特征及菌型基因特征情况,采用MLVA分型方法,选择LeFleche等[2]提出的布鲁氏菌MLVA-16分型引物对辽宁省2010年分离到的33株羊种布鲁氏菌进行基因分型研究.     

青藏高原喜马拉雅旱獭分离布鲁氏菌的MLVA分型与溯源分析

目的观察青海省青藏高原喜马拉雅旱獭分离的布鲁氏菌的多位点可变数目串联重复序列分析(multiple locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA)分型, 探讨其与既往青海省布鲁氏菌分离菌株间的亲缘关系。方法 2019年3月至2020年10月, 采集青海省青藏高原喜马拉雅旱獭全血样本, 对虎红平板凝集试验(rose bengal test, RBT)布鲁氏菌抗体阳性样本进行病原体分离培养, 采用传统生物学方法和分子生物学方法(BCSP31-PCR和AMOS-PCR方法)进行菌株鉴定。同时, 应用MLVA方法对分离菌株进行基因分型, 并结合既往青海省不同宿主分离的70株布鲁氏菌的基因型, 应用聚类分析方法探讨菌株间的亲缘关系。结果共采集青藏高原喜马拉雅旱獭全血样本1 466份, 从其中64份RBT阳性样本中分离培养出2株布鲁氏菌, 分别命名为QH2013054、QH2013062, 经传统生物学和分子生物学方法鉴定为羊种布鲁氏菌生物Ⅲ型。MLVA分型结果显示, QH2013054与QH2013062菌株在Bru16位点有差异, 为不同...     

RAPD反应条件的优化及在微生物分型中的应用

分子生物学技术已成功应用于菌属内菌株分型。基因型分型比表型分型更直接,可从根本上确定菌株遗传基础间的相互联系及变异。与聚合酶链反应(PCR)相结合的新的基因型分型方法日益受到欢迎,其中随机引物扩增多态性DNA(RAPD)正广泛应用于越来越多的微生物分型中,其以快速、简易、分辨力高等优点成为直接分析许多病原菌基因组、明确菌属间克隆来源的重要方法,尤其是用于临床爆发的研究中,但该方法对实验条件高度依赖,可重复性相对 较低。本文对RAPD实验条件的控制及应用加以综述。     

杭州市库蚊复组抗性相关酯酶Estβ基因类型和频率及动态分布

目的 了解杭州市尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶基因类型、频率和动态分布,为蚊虫防制提供对策。方法 采用聚合酶链反应-限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）方法进行抗性相关酯酶的基因分型,对2003-2005年杭州市自然种群库蚊酯酶基因的频率进行动态监测。同时结合酯酶淀粉凝胶电泳技术检测抗性酯酶基因表型监测。结果 连续3年用PCR-RFLP法对酯酶等位基因的分子分型结果表明,杭州市存在4种酯酶基因类型,主要存在世界范围内广泛分布的酯酶Estβ1（50％～54％）纯合型,其次是Estβ2（29％～34％）纯合型,Estβ1／B2（5％～10％）杂合型和一种新的EstβN（3．13％）纯合型等位基因型。用淀粉凝胶电泳分析2005年杭州市库蚊种群的抗性酯酶基因表型,主要是Estβ1型（61％）,其次是Estα2／β2型（12％）,Estαβ／β8型（7％）,敏感表型（29％）。结论 杭州市自然种群尖音库蚊复组存在多种抗性酯酶基因型,2003-2005年来Estβ1型为主,其次是Estα2／β2型,在2005年发现EstβN,是一个新的酯酶基因型,但是比例较低,仅占3．13％。该新的酯酶基因可否引起新的杀虫药剂的抗性,尚有待进一步的跟踪研究。扩增酯酶基因分子分型与抗性酯酶表型,也都表明了一致性。     

甘肃省228株临床分离结核分枝杆菌DNA分型初步研究

目的了解目前甘肃结核分枝杆菌流行株的基因型特征,并评价两种基因分型方法的应用价值。方法收集甘肃省结核分枝杆菌临床分离菌株,分别采用多位点数目可变串联重复序列分析(multiple-locus variable number tandem repeat analysis,MLVA)和间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing,Spoligotyping)技术进行基因分型,用BioNumerics软件进行聚类分析后,进行结果综合分析、比对。结果利用MLVA分型方法,228株结核分枝杆菌被分为4大基因群,7个主要基因型;Spoligotyping可将228株结核分枝杆菌分为4个基因群,8个主要基因型,其中最大的基因型为北京家族基因型。两种方法在基因型分型方面经卡方检验差异无统计学意义(χ2=0.06,P0.05)。结论两种方法对结核分枝杆菌的分型效果良好,重复性高,操作简便,可试用于大规模分子流行病学调查。北京家族是甘肃最主要的流行基因群。     

青海省2005-2019年人间布鲁氏菌病流行特征及分子特征分析

目的 分析青海省人间布鲁氏菌病（布病）流行规律与趋势,对2005-2019年布鲁氏菌分离株进行分子分型,为制定青海省布病预防控制策略提供依据。方法 收集中国疾病预防控制信息系统青海省2005-2019年布病报告数据,描述和分析其时间、地区和人群三间分布。采用BCSP31聚合酶链式反应（BCSP31-PCR）、AMOS聚合酶链式反应（AMOS-PCR）和多位点串联重复序列分析（MLVA-16）方法鉴定布鲁氏菌分离株,进行聚类分析。结果 2005-2019年青海省累计报告病例577例,平均发病率为0.07/10万,不同年份差异有统计学意义。一年四季均可发病,集中在每年的3-10月。577例病例分布在6个自治州（市）的31个县（市、区）中,病例数位居前5位的是门源回族自治县（22.88%,132/577）、天峻县（10.57%,61/577）、西宁市（10.57%,61/577）、河南蒙古族自治县（10.51%,58/577）和海晏县（9.53%,55/577）。年龄范围8～82岁,男女性别比为1.8：1（374/203）,职业分布以牧民为主（47.83%,276/577）。从人全血中分离的10株菌株均为羊种Ⅲ型布鲁氏菌,分为5种基因型（2种基因型为单基因型,3种基因型为相同基因型）,MLVA-16分型和聚类分析结果显示,同青海省已发表文献的26株羊种Ⅲ型布鲁氏菌的遗传关系较近。结论 青海省布病疫情呈回升趋势,应加强人群监测和疫情通报,MLVA-16分型呈基因多态性,提示MLVA-16可用于遗传多样性分析和分子流行病学溯源调查,以提高布病监测能力。     

诺如病毒基因分型研究进展

诺如病毒是引起急性胃肠炎的主要病原体之一,极易突变和重组,型别众多。研究早期采用VP1区氨基酸序列对诺如病毒进行分型及鉴定。由于处在或接近聚合酶和衣壳区的重叠区为重组发生的热点区域,因此国际上提出使用聚合酶和衣壳区的双区域分型系统。目前基于2 s标准的双区域分型方法,聚合酶区可分为10个基因组及76种基因型,包括2个暂定基因组及16种暂定基因型,VP1可分为12个基因组及53种基因型,包括2个暂定基因组及5种暂定基因型。暂定基因组和基因型有待进一步型别鉴定和基因组划分。本文对诺如病毒分子特征、不同分型方法的原理、序列扩增方法、在线分型工具及最新的基因分型研究进展进行综述。     

海南省布鲁氏菌病疫情特征研究

目的 分析海南省布鲁氏菌病（布病）流行病学特征。方法 对2012-2017年海南省收集的16株布鲁氏菌采用Vitek 2 compact进行布鲁氏菌初步鉴定,再用传统生物学分型方法进行确证,结合饲养家畜血清学和病原学检测结果分析患者的流行病学特征。结果 Vitek 2 compact鉴定12株为羊种布鲁氏菌,4株为人苍白杆菌。传统生物学分型方法鉴定11株为羊种布鲁氏菌3型,5株为猪种布鲁氏菌3型。菌株对应的16例病例中2012年1例,2013年2例,2014年4例,2015年1例,2016年2例,2017年6例,分布在东方市、临高县、海口市、万宁市、乐东县、定安县等地。同时对疫区东方市745份羊血清进行布鲁氏菌血清抗体检测,阳性47例（6.3%）,从东方市病羊采集的标本中分离到羊种布鲁氏菌3型。结论 Vitek 2 compact是一种简单、方便的布鲁氏菌鉴定方法,但不能替代传统生物学分型方法;海南地区布病主要流行的菌种为羊种3型及猪种3型,通过东方市2017年布病疫情,说明海南省有布病疫畜传染人的疫情,布病防控形势严峻。     

质粒指纹图谱分析及其在细菌流行病学研究中的应用

在细菌流行病学调查中,对病原菌的追踪、分型,人们根据其生物学特征建立了许多方法。不论是那种方法,其关键是鉴别细菌和确认与疾病或暴发流行有关的病原菌。传统的方法是依赖于细菌的表型特征、如形态、生化反应、血清学特点、耐药谱、噬菌体谱等。应当注意的是所有这些表型特征的物质基础一酶,抗原、毒素等的存在是病原菌的基因调控的、由于多数表型的稳定性受普遍存在的环境选择作用的影响、同株菌的表达受许多因素的限制,因此,任何表型的方法均有一定的局限性。     

肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因SnaPshot技术检测方法的建立与研究

目的碳青霉烯类抗生素的大范围使用导致多药耐药株肺炎克雷伯菌不断出现,给该菌感染的临床治疗带来极大的困难,针对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌,建立一种高通量、快速、准确地甄别15种碳青霉烯酶基因型的分析方法,进行碳青霉烯酶基因型筛查,同时采用特异性引物测序寻找碳青霉烯酶新的基因型,为产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的防控、流行病学分析、溯源和临床治疗提供可靠的分析方法。方法采用Sna Pshot技术,设计引物,优化反应体系和条件,通过高通量、快速、准确的PCR反应,反应产物经测序仪检测,用Gene Mapper 3.2软件分析检测结果,从而得到基因分型结果。结果对已知分型的6株KPC分型结果与已知分型一致。临床收集的耐药样本均为KPC-2型,这也是国内外报道较多的一种亚型。结论采用Sna Pshot技术成功构建了一种可对15种碳青霉烯酶基因型进行分型和寻找碳青霉烯酶新的基因型的方法。