登革病毒1型和2型国内分离株NSI基因的扩增和克隆

登革病毒为单链正股ＲＮＡ病毒，其非结构蛋白ＮＳ１在病毒免疫反应中起重要作用。我们在ＮＳ１基因序列设计了一对通用引物，扩增序列长度的４１３ｂｐ。应用逆转录－－聚全酶链反应成功地扩增了ＤＶ１－４型部分基因长段，采用该引物增国内分离株ＤＶ１和ＤＶ２同样出现一条特异扩增带，回收该ＤＮＡ片段，并将ＤＶ１和ＤＶ２ＮＳ１基因部分片段分别克隆到ＰＵＣ１９质粒载体中。     

恶性疟原虫云南株丝氨酸重复抗原部分基因的克隆和序列 …

用ＰＣＲ方法特异性扩增ＳＥＲＡ基因片段，并将该基因片段克隆于Ｍ１３噬菌体，用双脱氧链末端终止法进行测定，应用ＰＣＧＥＮＥ软件对该基因序列进行了分析，结果显示该基因片段长度为４５３ｂｐ，Ａ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ为２．６：１，符合恶性疟原虫结构基因的特点。同源性分析显示该基因在不同虫株间高度保守，我国ＰＦＤ－３／ＹＮ虫株ＳＥＲＡ基因片段仅及Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３（巴西）株及Ｓ１６（塞内加尔）株在第６６７位氨基酸有不同     

恶性疟原虫云南株丝氨酸重复抗原部分基因的克隆和序列分析

用ＰＣＲ方法特异性扩增ＳＥＲＡ基因片段，并将该基因片段克隆于Ｍ１３噬菌体，用双脱氧链末端终止法进行测序，应用ＰＣＧＥＮＥ软件对该基因序列进行了分析，结果显示该基因片段长度为４５３ｂｐ，Ａ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ为２．６∶１，符合恶性疟原虫结构基因的特点。同源性分析显示该基因在不同虫株间高度保守，我国ＰＦＤ－３／ＹＮ虫株ＳＥＲＡ基因片段仅与Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３（巴西）株及Ｓ１６（塞内加尔）株在第６６７位氨基酸有不同，与ＦＣＲ３（冈比亚）、ＦＣＢＲ（哥化比亚）、及Ｓ１４、Ｓ１５（塞内加尔）等其它虫株ＳＥＲＡ基因序列完全一致。抗原表位预测分析显示该多肽Ｎ端和Ｃ端可能有抗原表位存在。     

用RAPD-PCR鉴定抗溴氰菊酯淡色库蚊

用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ法对淡色库蚊抗溴氰菊酯品系和敏感品系的基因组ＤＮＡ进行了分析鉴别。结果表明：不同引物扩增出的产物数量不等，明显可分辨的带一般在４～１３条之间，带的大小在０．５～５．１ｋｂ之间；２２个引物在两品系中各扩增出１７０条可分辨带，绝大部分条带在两品系间是共同的；Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ７个引物的扩增产物在两者间共显示差异带２１条（２，３，７，４，１，１和３条），其中抗性品系特异带１２条（１，２，５，２，１，０和１条）；敏感品系特异带９条（１，１，２，２，０，１和２条）。这些特异片段可望作为抗性的分子标志用于抗性品系的鉴定以及进一步研究     

山东地区庚肝病毒的流行病学及部分核酸序列测定

庚型病毒性肝炎是１９９５年才确认的一种新型肝炎［１］．为探讨庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）感染的检测方法及ＨＧＶ山东株感染及变异的情况,我们对部分慢性肝病（ＣＬＤ）患者的血清进行ＲＴＰＣＲ检测,并对ＰＣＲ扩增产物作ＨＧＶＣＥ１区部分核苷酸序列分析．１　材料和方法１．１　材料　本组９６例ＣＬＤ患者血清来自山东地区系１９９４／１９９７在本院住院和门诊长期随访患者．全部病例均经临床和病理确诊证实．１．２　方法　①引物设计与ＰＣＲ扩增采用半巢式ＰＣＲ技术扩增中国山东株ＨＧＶＣＥ１区部分基因片段．根据中国株ＨＧ…     

广东、海南两省人血清12种虫媒病毒抗体调查

目的　为了解南方地区虫媒病毒的感染分布情况。方法　本文应用间接免疫荧光法（ＩＦＡ） 对广东省、海南省两地共２４５６ 份人血清检测１２ 种虫媒病毒抗体。结果　甲病毒抗体阳性率为１－４７％ （３６／２４５６）,其中海南省人血清甲病毒阳性占总阳性数的１－２２ ％ ,广东省人血清甲病毒阳性占总阳性数的０－２４％ 。罗斯河病毒（ＲＲ）、基孔肯亚病毒（ＣＨＩＫ）、盖塔病毒（ＧＥＴ） 阳性率分别为０－４９％ 、０－３７％ 、０－２０％ 。黄病毒抗体阳性率为９－８５ ％ ,登革Ⅰ Ⅳ型（ＤＥＮ１ －４） 和乙脑（ＪＥＶ） 阳性率分别为３－５４ ％ 和２－０４ ％ 、０－７３ ％ 、１－０６％ 、２－００％ 。结论　从这次在广东,海南两地调查均能检测出甲病毒抗体,表明两地人群除存在黄病毒中ＤＥＮ１－ ４,ＪＥＶ感染外,还存在甲病毒的感染,特别是ＲＲ、ＣＨＩＫ病毒的感染。     

应用长片段PCR扩增全长HIV— 1DNA的研究

目的 探讨长征段ＰＣＲ（ＬＤ－ＰＣＲ）扩增特点,并将它用于对全长ＨＩＶ ＤＮＡ的研究。方法 应用ＬＴＤ（Ｕ５）／ＬＴＤ（Ｒ）,ＣＬ－ＮＳＣ／ＣＬ－ＮＥＦ和ｇａｇＡｌ／ｇａｇＡ２等不同引物,＾３２Ｐｇａｇ,ｐｏｌ,ｎｅｆ和ｔａｔ等为片段探针,对克隆有ＨＩＶ－１完整基因片段,部分基因片段的质粒和ＨＶＩ感染者外周血单核细胞（ＰＢＭＣ）中的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ进行扩增。结果 ＬＤ－ＰＣＲ对０．４－９ｋｂ的第     

赖型钩体重组质粒及表达保护性抗原,p68的研究

目的　寻找钩体病基因工程疫苗保护性抗原候选。方法　 （１） 鸟枪法构建赖型钩体０１７ 株基因库; （２） α互补、 Ｄ Ｎ Ａ 原位杂交筛选重组质粒; （３） Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交行 Ｄ Ｎ Ａ 同源性分析; （４） 双脱氧链中止测重组 Ｄ Ｎ Ａ 序列及与外膜蛋白基因 （ｏｍｐ） 匹配; （５） Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导重组子表达; （６） 免疫印迹、 Ｍ Ａ Ｔ、 Ｅ Ｉ Ａ、 Ｍ Ｔ Ｔ 检测表达蛋白抗原特性及 Ｉ Ｌ—２ 、 Ｉ Ｌ—６ 活性; （７） 纯化表达蛋白ｐ６８ 进行豚鼠主动免疫 攻击实验, 观免疫保护性。结果　 （１） 重组质粒ｐ Ｄ Ｊ Ｈ２ （ 亚克隆ｐ Ｄ Ｊｔ） 插入片段１９ｋｂ , 与各致病钩体不同片段 Ｄ Ｎ Ａ 高度同源; （２） 序列测定插入片段实际１８１１ｂｐ , 推测有２ 个读框 （ Ｏ Ｒ Ｆ） , 各有启动子、终止密码。查 Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ｅ Ｍ Ｂ Ｌ 无类似序列; （３） 表达蛋白分子量６８ｋ Ｄ （ｐ６８） ; （４） ｐ６８ 是胸腺依赖性 （ Ｔ Ｄ） 抗原,有良好抗原特性, 抗血清效价１ ： ５２４２８８ , （ Ｅ Ｉ Ａ） 具很强的动物免疫保护作用。结论　 （１） ｐ６８ 编码基因是致病钩体保护性抗原基因; （２） ｐ６８ 是致病钩体外膜保护性抗原,     

鸡疟原虫雌配子单克隆抗体的制备和鉴定

用鸡疟原虫雌配子免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取免疫鼠脾细胞与ＮＳＩ鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出的６株（３Ｈ１、２Ｈ１、１Ｇ１、１２Ｄ１、６Ｅ２、６Ｃ２）杂交瘤细胞，证明能分泌效价高、特异性强的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）。亚类鉴定为ＩｇＧ１（６Ｃ２，３Ｈ１）、ＩｇＧ２ａ（１Ｇ１，２Ｈ１）、ＩｇＧ２ｂ（６Ｅ２）、ＩｇＧ（１２Ｄ１），其中２Ｈ１、６Ｅ２、１Ｇ１、１２Ｄ１株ＭｃＡｂ为抗膜抗体，而３Ｈ１和６Ｃ２株ＭｃＡｂ为非抗膜抗体。除１２Ｄ１株ＭｃＡｂ与蓝氏贾第鞭毛虫滋养体有交叉反应外，其它各株ＭｃＡｂ与阴道毛滴虫滋养体、杜氏利什曼原虫前鞭毛体、鼠疟原虫和鸡疟原虫红细胞内期均无交叉反应。     

Inflammatory bowel disease in Hubei Province of China

ＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｂｏｗｅｌｄｉｓｅａｓｅｉｎＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｈｉｎａＸＩＡＢｉｎｇ１，Ｓ．ＳＨＩＶＡＮＡＮＤＡ２，ＺＨＡＮＧＧｕｉＳｈｕｉ１，ＹＩＪｉＹｕｎ１，ＪＢＡＣＲＵＳＩＵＳ３ａｎｄＡＳＰＥＮ～Ａ３Ｓｕｂｊｅｃｔｈｅ...     

11株经输血传播病毒（TTV）基因型分析

目的 对11株经输血传播病毒（transfusion transmit virus,TTV）进行基因型分析。方法 用巢式PCR扩增不同地区不明病因的急、慢性肝炎、肝硬化、肝癌和自然健康人群TTV DNA片段,并对此巢式PCR产物进行克隆,测序分析和同源性比较。结果 11例标本的222bp9引物序列除外）的TTV DNA同源性结果为：武汉WH1、WH2、WH33个患者血清中TTV DNA序列与N22同源性分别为97.0％、97.0％和98.0%;广州GZ1、GZ2、GZ33患者血清中TTV DNA序列与N22同源性分别为98.0%、95.0%和95.0%;山东SD2、SD3TTV DNA序列与N22同源性分别为94.6%和95.5%;广州GZ4、山东SD1,新疆XJ1患者TTV DNA序列与TX011同源性分别为98.0%、98.0％和95.0%。结论 根据Okamoto的分类方法,这11株TTV可属于两个亚型,即基因1型的a和b亚型。     

登革病毒2型广东省分离株的鉴定及NS1基因序列分析

目的 明确广东省南海市1998年夏、秋季一批发热、出疹患者的诊断,并从基因水平分析其流行株的来源。方法 收集疑似登革热（DF）患者 血清52份,应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）、病毒分离和间接免疫荧光技术分别进行了病原学和血清学检测;同时采用分子克隆技术将PCR扩增产物克隆到T载体,并进行序列测定。结果 从25份发病早期患者血标本中分离病毒10份,经用单克隆抗体间接免疫荧光检测和RT－PCR检没让实为登革病素2型感染。基因序列分析表明,1998年广东分离的登革2型病毒与ThNH-P28/93、C0166`16681`NGC`JAM`04`GD06/93和S1株核苷酸的同源性分别是：98％、97％、96％、93％、92％、91％。结论 此次南海市登革热暴发流行为 登革病毒2型感染所致。基因序列分析提示：1998年广东省南海市分离的登革病毒2型可能来源于泰国。     

用3'非编码区通用引物通过RT-PCR检测登革1～4型病毒RNA

目的 　根据登革病毒 (DEN) 3 端非编码区的一段高度保守序列 ,设计登革 1～ 4型通用引物 ,采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测登革病毒 1～ 4型RNA。方法　用C6/ 3 6细胞培养登革病毒。用热酚法提取病毒RNA ,进行RT PCR扩增 ,并对扩增产物测序。结果　DEN 2 NGC株可扩增出至少 10TCID5 0 的病毒 ,测序结果与已知序列一致。DEN 1～ 4型标准株和DEN -2 -0 4与DEN 2 4 3株均能够扩增出唯一的一条特异条带。结论　应用通用引物RT PCR法可从病毒浓度少至 10TCID5 0 的感染细胞培养液中检出DEN 2 NGC株病毒 ,并且该对通用引物对于其他 3型登革病毒亦具有很好的通用性 ,其方法的特异性和敏感性亦较强。     

成人手足口病四例患者肠道病毒71型的检测及核苷酸序列分析

目的 了解成人手足口病的病原体,并分析肠道病毒71型(EV71)核苷酸序列特征.方法 RT-PCR技术对4例成人手足口病患者标本进行肠道病毒基因检测,并测定EV71核苷酸序列,所得序列通过BLAST程序作EV71序列的进一步确认,与基因库中不同基因型EV71核苷酸序列进行比对分析、同源性分析,并构建种系进化树.结果 4例患者肠道病毒通用引物和EV71特异性引物RT-PCR检测均阳性.经BLAST分析,测序所得4条核苷酸序列(分别命名为GZl9610、GZ99310、GZ99355和GZ46477)与EV71毒株序列同源.序列分析表明,4条核苷酸序列之间的同源性为96.O%～99.1%,与2008年初我国安徽省阜阳市暴发的手足口病疫情所分离的EV71毒株同源性最高.EV71序列遗传进化分析确定其均为EV71基因亚型C4,与阜阳、深圳、重庆、上海地区及2004年我国台湾地区流行毒株基因型一致,且距离最近.结论 成人也可感染EV71引起手足口病,与我国现在及既往流行病毒株相比,此次4例成人手足几病患者感染的EV71未发生大的变异;应加强对成人手足口病患者的隔离治疗,以免其传播病毒引起疾病更大的流行.     

Detection of diverse variants of human immunodeficiency virus-1 groups M, N, and O and simian immunodeficiency viruses from chimpanzees by using generic pol and env primer pairs

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection of humans is the result of independent cross-species transmissions of simian immunodeficiency viruses (SIVcpz) from naturally infected chimpanzees (Pan troglodytes troglodytes) to man. To develop a polymerase chain reaction-based assay capable of detecting members of all major phylogenetic SIVcpz and HIV-1 lineages (groups M, N, and O), primer pairs in conserved pol and env regions were designed. Both primer sets amplified 99%) in amplifying viral sequences from plasma taken from patients infected with HIV-1 group M (n=226) and O (n=17) viruses.     

载脂蛋白B-100 3500精氨酸→色氨酸突变的简便快速诊断

目的 建立一个简便快速方法，用于诊断家族性载脂蛋白B-100缺陷症R3500W。方法 设计一对寡核苷酸引物，其上游引物为突变引物。以PCR扩增目的DNA顺序，产物用限制酶Ncol酸解，酶解体系中加入含Ncol切口的DNA片段作内参照物，以排除酶切时假阴性的出现。结果 所设计引物能成功地用行PCR以扩增目的DNA片段，长144碱基对。产物与限制酶Ncol保温，正常基因产物不被切割，突变基因产物则由于引入一个人工限制酶切口而被切割，产生117碱基对的片段，这两长度不同的片段可被2%琼脂糖凝胶电泳所分离。利用这一方法，于162例高血浆胆固醇患中检出两例杂合R3500W突变基因携带。结论 本突变引物PCR法成功地检出Apo B-100R3500W突变基因，方法可靠，简便易行。