丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶＣ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的核心抗原。结果：用限制性内切酶酶切后，片段大小与计算值相符。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，表达抗原的Ｍｒ约为２２０００。结论：ＨＣＶＣ基因能够插入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，并使其在真核细胞中表达，为进一步ＨＣＶ基因疫苗的研制和探讨抗ＨＣＶ感染打下了基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核 …

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶ Ｃ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表达的核心抗原     

乙肝核酸疫苗NV—HB／s接种后小鼠体液免疫应答的初步研究

乙肝核酸疫苗ＮＶ┐ＨＢ／ｓ接种后小鼠体液免疫应答的初步研究赵连三秦山李水仙唐红刘丽周思亮雷秉钧将乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）主蛋白的编码基因Ｓ插入真核细胞表达质粒ｐＲｃ／ＣＭＶ／ＡＴＧ中的ＣＭＶ启动子下游，获得的重组质粒（ＮＶ－ＨＢ／ｓ）转染真核细...     

应用S基因转染的Sp2／0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫？…

构建编码ＨＢｓＡｇ蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,免疫接种Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,以重组质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ转染的Ｓｐ２／０细胞作为靶细胞,采用＾５１Ｃｒ ４ｈ释放法,体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示,与空载体对照组相比较,ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠产生ＨＢＶ特生细胞毒性Ｔ细胞应答,提示以Ｓｐ２／０基因转染的细胞作为靶细胞,检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠淋巴细胞     

丙型肝炎病毒RNA和蛋白在肝组织中的定位研究

肝组织中丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）ＲＮＡ和蛋白的定位研究表明，ＨＣＶ具有泛嗜性，不仅能在肝细胞、单个核细胞、枯否氏细胞、窦壁上皮细胞和胆管上皮细胞的胞浆和胞核中贮存与复制，而且可在肝细胞中表达与成熟。肝细胞的损害可能与ＨＣＶ的直接细胞毒作用和宿主介导的免疫病理反应有关。     

人生长激素基因在小鼠体内的表达

本文报道了含人生长激素ｈＧＨ ｃＤＮＡ的重组真核表达质粒的构建及其直接注射后在小鼠体内的表达水平。构建含ＣＭＶ晚期启动子的重组真核基因质表达质粒Ｒｃ／ＣＭＶ ＧＨ ｃＤＮＡ，以阳离子脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ和Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ分别包裹后直接多点注射于小鼠后肢肌肉组织，并用ＲＴ－ＰＣＲ及免疫放射检测分析法分别在转录水平及蛋白水平检测到了ｈＧＨ ｃＤＮＡ的表达。     

应用S基因转染的Sp2/0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫苗的细胞免疫应答

构建编码ＨＢｓＡｇ 蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３－１Ｓ作为ＨＢＶ 基因疫苗, 免疫接种Ｂａ１ｂ／ｃ 小鼠。以重组质粒ｐＣＲ３－１Ｓ转染的Ｓｐ２／０ 细胞作为靶细胞, 采用５１Ｃｒ ４ｈ 释放法, 体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示, 与空载体对照组相比较, ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠产生ＨＢＶ 特异性细胞毒性Ｔ 细胞应答（ Ｐ＞ ０－０５） , 提示以Ｓｐ２／０ 基因转染的细胞作为靶细胞, 检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠淋巴细胞的杀伤功能是可靠的。     

佐剂白细胞介素2对乙型肝炎病毒核酸疫苗免疫效应的影响

核酸免疫是指将编码外源蛋白的核酸表达载体直接导入机体以激发机体产生特异性免疫应答。由于核酸疫苗可诱导机体产生较强的细胞免疫应答 ,故有望应用于慢性病毒性感染如乙型肝炎的治疗。探讨如何增强乙型肝炎病毒核酸疫苗的免疫效应 ,尤其细胞免疫效应具有重要意义。为此 ,我们构建了编码乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ ,ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ)表面抗原蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ3 1 Ｓ作为ＨＢＶ核酸疫苗 ,研究了人白细胞介素 2 (ｒｈＩＬ 2 ,ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ 2 )对ＨＢＶ核酸疫苗诱导ＢＡＬ…     

细胞性一氧化氮供体的建立及其对肿瘤细胞凋亡的诱 …

一氧化氮供体细胞系的建立及其对肿瘤细胞凋亡的诱导效应研究。方法采用＾３Ｈ－胍氨酸转移法进行了ＮＯ合成酶活性测定，亚硝酸盐检测；ＤＮＡ片段的提取及凝胶电泳分析；凋亡细胞的ＤＡＰ１染色观察；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果将ｉＮＯＳ真核表达质粒，ｐＣＭＶ／ｉＭＯＳ转染至Ｓｐ２／０骨髓瘤的变异株中，并获得能稳定表达ｉＮＯＳ和合成ＮＯＲ 重组细胞系，表达ｉＮＯＳ的效率为每升培养物含４００μｇ蛋白。     

通过受体介导法将核酶特异导入肝细胞以阻断HBV蛋白表达的初步研究

应用半乳糖末端糖蛋白受体（ＡＳＧＰ－Ｒ）介导的内吞作用，将外源基因导入真核细胞，与脂质体介导的转染和细胞表面转铁蛋白受体（Ｔｆ－Ｒ）介导的内吞作用相比，虽然三种方式均能有效介导外源基因的转移，但ＡＳＧＰ－Ｒ法具有肝细胞特异性，而脂质体法和Ｔｆ－Ｒ法不具此特性。将克隆于真核表达载体的针对乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ｍＲＮＡＰｒｅＣ／Ｃ区的核酶质粒ｐＣＭＶ－Ｒｉｐｃ特异性导入肝细胞并发挥作用，通过酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测细胞培养液中的乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ），评价核酶在细胞水平对ＨＢＶ抗原表达的阻断作用。结果表明当核酶质粒ｐＣＭＶ－Ｒｉｐｃ与ＨＢＶ抗原表达质粒ｐＵＣ－２ＨＢＶ共转染ＨｅｐＧ２细胞时，核酶对ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ表达的抑制率分别为５５．２９％和６８．７３％。     

内部核糖体进入位点控制hytk基因和绿色荧光蛋白的表达

构建一种带有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）和ｈｙｔｋｃＤＮＡ（潮霉素磷酸转移酶和ＨＳＶ－ｔｋ的融合基因）的新型真核表达载体，用于简便、快速地了解自杀基因在恶性肿瘤听转染效率。利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖体进入位点，将ｇｆｐ的ＣＤＮＡ与ｈｙｔｋ真核表达载体重组，构建获得含ｇｆｐ和ｈｙｔｋ基因的重组质粒；Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导下分别转染ＣＯＳ－７细胞及人膀胱癌细胞株ＥＪ，并检测表达情况。结果示该载体在     

人源抗-HAV Fab真核表达载体的构建及表达

目的 构建人源抗－ＨＡＶＦａｂ真核表达载体并进行表达。方法 采用ＤＮＡ重组技术将抗体重轻链基因与信号肽基因连接,并分别插入真核表达载体ｐＣｄｈｆｒｌ、ｐＣＤＮＡ３．１;以脂质体介导法转染ＣＨＯ细胞,经Ｇ４１８筛选细胞,ＥＬＩＳａｂ基因的表达。结果 成功地构建了Ｆａｂ表达载体。转染细胞后,经ＥＬＩＳＡ检测,细胞增养上清中有抗原结合活性的Ｆａｂ片段。结论Ｆａｂ真核表达载体的构建及其在ＣＨＯ细胞中的表达     

逆转录病毒载体介导乙型肝炎病毒反义基因的转录表达

为了探索在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）反义核酸的方法，用基因重组技术将ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因（ＰｒｅＣ／Ｃ）和前Ｓ／Ｓ基因（ＰｒｅＳ／Ｓ）片段反向插入逆转录病毒载体质粒，再将重组体分别转染ＰＡ３１７包装细胞，进而获得能够介导ＨＢＶ反义基因向小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞转移表达的重组逆转录病毒。经分子杂交试验表明，含有ＨＢＶ反义基因的重组逆转录病毒序列已经整合到转染的ＰＡ３１７细胞染色体上；转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。结论：逆转录病毒载体包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞中转录表达，因而有可能利用反义技术和基因转移方法进行抗－ＨＢＶ基因治疗     

HBVx基因在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的：研究乙型肝炎病毒 Ｘ 基因在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响。方法：用分子生物学的方法构建 Ｈ Ｂ Ｖｘ 基因真核表达载体ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３１ Ｈ Ｂ Ｘ，用脂质体将真核表达载体ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３１ Ｈ Ｂ Ｘ转染入肝癌细胞 Ｈ Ｃ Ｃ９２０４ ， Ｇ４１８ ５００ ｍｇ· Ｌ－ １ 筛选，获得稳定表达 Ｈ Ｂｘ 蛋白的细胞，阿霉素２０ μｍｏｌ· Ｌ－ １ 诱导细胞凋亡。电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡细胞。结果：２０ μｍｏｌ· Ｌ－ １ 阿霉素可诱导肝癌细胞凋亡，稳定表达 Ｈ Ｂｘ 蛋白的肝癌细胞凋亡率比未进行基因转染的肝癌细胞凋亡率低。结论： Ｈ Ｂｘ 蛋白可抑制阿霉素诱导的肝癌细胞调亡。     

丙型肝炎病毒结构蛋白在哺乳动物细胞中的表达

目的 获得稳定表达丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构蛋白的哺乳动物细胞系，以便对ＨＣＶ结构蛋白的性质及其基因免疫效果作进一步的研究。方法 用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增ＨＣＶ结构基因，并将其克隆重人真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中，用磷酸钙转染法将其转入Ｓｐ２／０细胞，对目的蛋白获得稳定表达的细胞克隆重进行免疫组化及细胞全蛋白的Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ分析。结果 克隆重的基因片段全长约１．９ｋｂ，包括Ｃ及Ｅ２基因的全部和     

丙型肝炎病毒结构蛋白在痘苗病毒中的表达

为研究中国丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的抗原性及在细胞内的加工，将丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５’非编码区（ＮＴＲ）和结构基因（Ｃｏｒｅ＋Ｅ１＋Ｅ２／ＮＳ１）插入痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５中，转染ＴＫ－１４３细胞，经纯化得到丙型肝炎（ＨＣＶ）重组痘苗病毒ｖＪＳＡ１１７５ＣＥ株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交表明，ＨＣＶ结构基因存在于痘苗病毒之中。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析发现，ｖＪＳＡ１１７５ＣＥ表达蛋白带位于９０ｋＤａ，为一多聚蛋白；此蛋白为分泌型，分泌量与细胞裂解物内量大致相同     

HBVx基因在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞凋？…

目的：研究乙型为病毒Ｘ基因在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响。方法：用分子生物学的构建ＨＢＶｘ真核表达载体ｐ＾ＣＤＮＡ３．１．ＨＢＸ,用脂质体将真核表达载体Ｐ＾ＣＤＮＡ３．１－ＨＢＸ转染入肝癌细胞ＨＣＣ９２０４,Ｇ４１８ ５００ｍｇ·Ｌ＾－１筛选,获得稳定表达ＨＢｘ蛋白的细胞,阿霉素２０μｍｏｌ·Ｌ＾－１诱导细胞凋亡。电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡细胞。结果：２０μｍｏｌ·Ｌ＾－     

丙型肝炎病毒非结构区抗原制备及其相应抗体的检测

目的 研究丙型肝炎病毒非结构区３（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｄ ｒｅｇｉｏｎ３,ＨＣＶ－ＮＳ３）与丙型肝炎发病的关系,寻求一种可用于判断临床干扰素（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ,ＩＦＮ）治疗疗效的检测方法。方法 采用基因重组,以大肠埃岙菌表达,提取ＨＣＶ－ＮＳ３不同末端蛋白作为抗原,并回顾性的对ＩＦＮ治疗的６３例ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性的丙型肝炎患者血清用免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ     

EB病毒BHRF1基因的克隆及其表达产物抑制细胞凋亡的研究

目的ＥＢ病毒ＢＨＲＦ１基因克隆，其表达产物抑制ＣＨＯ细胞凋亡功能的研究。方法以Ｂ９５－８细胞株ＥＢＶＤＮＡ为模板设计一对引物，采用ＰＣＲ技术扩增ＢＨＲＦ１基因，用目的基因内的两个单酶切点ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅠ进行酶切鉴定。用引物上所引入的两个酶切位点ＮｃｏⅠ、ＳｃｌⅠ酶切目的基因后定向连接到ｐＢＶ２２１载体上，转入宿主菌ＤＨ５α经质粒抽提，单、双酶切鉴定，从所获克隆中筛选重组质粒克隆。温控诱导目的基因表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及凝胶薄层扫描分析。采用缺血清培养方法建立ＣＨＯ细胞凋亡模型。结果所得扩增产物长５９２ｂｐ与预期大小一致；筛选出的９个重组质粒克隆经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和扫描表明重组蛋白表达量占菌体蛋白总量的２．５％。将含重组蛋白的菌体蛋白加入缺血清培养体系，通过与空白菌体蛋白对照表明，重组蛋白具有明显的抑制ＣＨＯ细胞凋亡的能力。结论ＢＨＲＦ１蛋白具有有效控制血清缺乏所诱导的ＣＨＯ细胞凋亡功能，这为ＢＨＲＦ１蛋白的广泛应用提供了依据。     

维生素D3受体对hsp90β基因表达的调控作用

鉴于热休克蛋白９０β（ｈｓｐ９０β）基因内含子中含有维生素Ｄ３受体（ＶＤＲ）结合位点，为探讨作为核受体家族成员的ＶＤＲ是否对核受体特异分子伴侣的ｈｓｐ９０β基因的表达具有调控作用，我们开展了本项研究。分别将野生型ＶＤＲ、含Ｎ端（１～１３３氨基酸残基）及Ｃ端（２８１～４２７氨基酸残基）片段的ＶＤＲ突变体真核表达质粒与人ｈｓｐ９０β基因调控片段（－１０３９／＋１５３１）介导的氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）报告基因质粒共转染Ｊｕｒｋａｔ细胞，检测正常及经热休克（４２℃，１ｈ）处理后细胞裂解液中ＣＡＴ活性。结果表明ＶＤＲＮ端增强、而Ｃ端抑制ｈｓｐ９０β的组成性表达；在热诱导条件下野生型ＶＤＲ对ｈｓｐ９０β的表达有一定的抑制作用，而其Ｃ端片段的抑制较强。为进一步研究ＶＤＲ对细胞内源性热休克基因表达的影响，我们用ＲＴＰＣＲ方法研究了ＶＤＲ的对细胞内ｈｓｐ９０β基因ｍＲＮＡ水平的影响，发现ＶＤＲ过表达对ｈｓｐ９０β的热诱导表达明显抑制。结果提示ＶＤＲ对ｈｓｐ９０β基因的组成性和热诱导表达的调控机制不同。