甘草次酸抑制表皮细胞生长因子对HaCaT细胞促增殖作用的机制研究

目的 探讨甘草次酸对表皮细胞生长因子（EGF）诱导的HaCaT细胞增殖的影响,并对其可能机制进行相关研究。方法 MTT法检测不同浓度EGF （0、1、5、10、25、50、100 ?滋g/L） 以及不同浓度甘草次酸（0、0.1、1、10、25、50、100 ?滋mol/L）对HaCaT细胞增殖的影响,25 ?滋mol/L甘草次酸、10 ?滋mol/L MEK1/2抑制剂 （U0126） 对25 ?滋g/L EGF促HaCaT细胞增殖的抑制作用。蛋白免疫印迹法检测25 ?滋g/L EGF对ERK1/2磷酸化的促进作用,25 ?滋mol/L甘草次酸、10 ?滋mol/L U0126对ERK1/2磷酸化的抑制作用,25 ?滋g/L EGF、25 ?滋mol/L甘草次酸、10 ?滋mol/L U0126分别或同时作用下HaCaT细胞增殖细胞核抗原（PCNA）、Notch-1蛋白的表达情况。使用SPSS17.0统计软件对实验数据进行t检验、方差分析和相关分析。结果 EGF在0 ～ 100 ?滋g/L范围内促进HaCaT细胞增殖（r = 0.798,P ＜ 0.05）,在0 ～ 50 ?滋g/L 范围内与HaCaT细胞增殖呈线性相关（r = 0.859,P ＜ 0.05）。甘草次酸在10 ～ 100 ?滋mol/L范围内浓度依赖性地抑制HaCaT细胞增殖（r = －0.945,P ＜ 0.01）;25 ?滋mol/L甘草次酸明显抑制25 ?滋g/L EGF对HaCaT细胞的促增殖作用以及对ERK1/2的促磷酸化作用。同时,25 ?滋mol/L甘草次酸、10 ?滋mol/L U0126均抑制25 ?滋g/L EGF对HaCaT细胞PCNA、Notch-1蛋白的促表达作用。结论 甘草次酸可抑制EGF对HaCaT细胞的促增殖作用,其机制可能与甘草次酸抑制EGF对HaCaT细胞ERK1/2信号通路的激活有关。     

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达抑制对A431细胞增殖和细胞周期的影响

目的研究葡萄糖?6?磷酸脱氢酶（G6PD）表达下调对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）细胞增殖和细胞周期的影响。方法正常培养人永生化上皮细胞HaCaT、皮肤鳞癌SCL?1和A431细胞,采用Western印迹法检测细胞中G6PD蛋白的表达。当A431细胞生长至85%~90%融合时,将siRNA对照（siRNA对照组）和G6PD siRNA（G6PD siRNA组）分别转染A431细胞,未转染的A431细胞则为未转染组。Western印迹法检测3组不同处理的A431细胞中G6PD蛋白及细胞周期蛋白D1、CDK4的表达,CCK?8法检测3组A431细胞的增殖情况,流式细胞仪分析3组A431细胞周期的变化。结果正常培养的2株皮肤鳞癌SCL?1和A431细胞中G6PD蛋白的表达水平（分别为0.308±0.023和0.643±0.046）均显著高于HaCaT细胞（0.100±0.019）,且A431细胞显著高于SCL?1细胞（均P<0.05）。A431细胞G6PD siRNA组G6PD、细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白的表达（0.134±0.027、0.154±0.017、0.166±0.017）显著低于未转染组（0.425±0.029、0.344±0.024、0.330±0.020）和siRNA对照组（0.444±0.033、0.350±0.027、0.348±0.018）,差异均有统计学意义（P<0.05）。G6PD siRNA组在24~96 h各时间点的细胞增殖活性均明显低于siRNA对照组和未转染组（P<0.001）,而siRNA对照组与未转染组间细胞增殖差异无统计学意义（均P>0.05）。G6PD siRNA组G0/G1期A431细胞比例显著高于siRNA对照组及未转染组（P<0.001）,而G6PD siRNA组S期A431细胞比例又显著低于siRNA对照组及未转染组（P<0.001）。结论G6PD可能在调控皮肤鳞癌细胞增殖和细胞周期中发挥重要作用。     

UVB应激性衰老成纤维细胞分泌细胞外基质对HaCaT细胞ERK信号的影响

目的 探讨UVB诱导的衰老（UVB-SIPS）成纤维细胞分泌的细胞外基质（ECM）对HaCaT细胞增殖的影响以及细胞外信号调节激酶（ERK）信号途径的作用。方法 采用辐射诱导人皮肤成纤维细胞衰老,分别制备由未衰老和衰老成纤维细胞分泌的ECM包被的培养皿（分别定为PRE-ECM组、SCIP-ECM组）。以空白培养皿（NON-ECM组）为参照,在HaCaT细胞接种于培养皿后,采用MTT法和流式细胞法检测其细胞增殖、细胞周期等指标的变化;免疫印迹法分析ERK活化水平。干预性研究ERK信号通路对上述功能的影响。结果 三组中,SCIP-ECM组可诱导最强烈的ERK1/2的活化。采用U0126抑制ERK信号活化可完全抑制衰老成纤维细胞来源的ECM的促细胞增殖效应。阻断HaCaT细胞的ERK活化,NON-ECM组、PRE-ECM组和SCIP-ECM组S + G2/M期细胞的比例明显下降,分别由处理前37.40%、41.34%和43.31%减少至29.41%、36.48%到39.96%。结论 UVB-SCIP成纤维细胞分泌的ECM通过刺激ERK磷酸化促进HaCaT细胞增殖。     

HaCaT细胞ADAR1基因沉默对Wnt11表达和A375细胞酪氨酸酶活性的影响

【摘要】 目的 探讨遗传性对称性色素异常症致病基因ADAR1对Wnt11表达和酪氨酸酶活性的影响。 方法 将HaCaT细胞等细胞数量分为对照组、实验1组、实验2组、实验3组。用3种针对ADAR1基因的shRNA质粒分别沉默3个实验组中HaCaT细胞的ADAR1基因,用Western印迹法检测4个组HaCaT细胞相关蛋白的表达水平。建立HaCaT细胞与黑素瘤细胞A375共培养模型,对实验组（HaCaT细胞中的ADAR1和Wnt11蛋白低表达）与对照组（HaCaT细胞中的ADAR1和Wnt11蛋白正常表达）的细胞形态和酪氨酸酶活性进行比较。 结果 蛋白印迹法发现,ADAR1基因沉默的HaCaT细胞中的Wnt11蛋白条带灰度值明显低于正常HaCaT细胞中的Wnt11蛋白条带灰度值, 证实HaCaT细胞中的ADAR1基因沉默后,Wnt11蛋白的表达水平明显下降。在共培养模型中,实验组HaCaT细胞与A375细胞连接处的树突状突起明显少于对照组,实验组A375细胞的酪氨酸酶活性与对照组相比显著降低,减去空白组A值后,实验组A值为0.0168 ± 0.0069,对照组为0.0490 ± 0.0132,P ＜ 0.01。 结论 HaCaT细胞中ADAR1基因沉默可降低Wnt11的表达,并影响A375细胞酪氨酸酶活性。 【关键词】 基因,ADAR1; Wnt11; 黑素细胞; 角蛋白细胞     

早老蛋白增强子2基因沉默对HaCaT细胞增殖及γ分泌酶表达的影响

【摘要】 目的 构建早老蛋白增强子2（PSENEN）基因沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型,探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法 设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列,与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒,经酶切及测序鉴定后,进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染：shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液,NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液,空白组不加病毒液。转染完成后,荧光显微镜下观察荧光表达,流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性,实时荧光定量PCR（qPCR）、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白（NCT）、早老蛋白1（PS1）、前咽缺陷蛋白1a（APH1a）mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 倒置荧光显微镜下观察到shRNA1 ~ shRNA3组、NC组均有荧光表达,流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示,与NC组（1.054 ± 0.272、1.076 ± 0.075）相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA（0.187 ± 0.010、0.163 ± 0.022、0.174 ± 0.009）、蛋白（0.219 ± 0.097、0.208 ± 0.014、0.185 ± 0.062）表达均显著降低（均P < 0.001）。CCK8法显示,与NC组相比,shRNA1组细胞增殖活性在0、12、36、48 h均显著增高（均P < 0.05）,24和60 h差异无统计学意义（均P > 0.05）;shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组（均P < 0.05）。shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、NC组、空白组间NCT、PS1、APH1a基因mRNA表达差异无统计学意义（F值分别为8.168、4.644、1.981,均P > 0.05）,mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义（F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663,均P ≤ 0.01）。与NC组相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低（均P < 0.01）,imNCT蛋白表达变化无统计学意义（均P > 0.05）。结论 成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型,PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强,γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。     

阿维A对HaCaT细胞体外凋亡和胰岛素样生长因子结合蛋白7及血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨阿维A对HaCaT细胞体外凋亡和胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。 方法 将10-5、10-6、10-7、10-8 mol/L的阿维A分别作用于HaCaT细胞24、48、72 h后,采用CCK8法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测阿维A对HaCaT细胞凋亡率的影响;Western印迹和RT-PCR法检测阿维A对HaCaT细胞IGFBP7、VEGF蛋白及其mRNA表达的影响。 结果 10-8 mol/L阿维A处理HaCaT细胞48 h时表现出对细胞增殖的抑制作用,随着时间延长和药物浓度升高,抗增殖作用亦增强,当药物浓度增加到10-5 mol/L时,48 h和72 h的抑制率分别为39.94% ± 2.27%和49.77% ± 1.87%。与对照组相比,10-5 mol/L阿维A作用48 h后,凋亡率由1.803% ± 0.313%（对照组）上升至7.617% ± 0.767%（阿维A组）（P ＜ 0.05）,IGFBP7的表达由0.436 ± 0.013上升至0.939 ± 0.040（P ＜ 0.05）,IGFBP7 mRNA的表达由0.190 ± 0.056上升至0.872 ± 0.079（P ＜ 0.05）,VEGF的表达由0.798 ± 0.036下降至0.213 ± 0.032（P ＜ 0.05）,VEGF mRNA的表达由0.933 ± 0.054下降至0.274 ± 0.041（P ＜ 0.05）。 结论 阿维A可促进HaCaT细胞的体外凋亡,并可在蛋白及mRNA水平上调IGFBP7及下调VEGF的表达。     

熊果酸对干扰素γ刺激HaCaT细胞产生白细胞介素33的影响

目的：探讨熊果酸对干扰素γ（IFN?γ）刺激HaCaT细胞产生白细胞介素33（IL?33）的影响及其机制。方法不同浓度熊果酸（0、0.1、1、5、10、20、40、80μmol/L）分别刺激HaCaT细胞24、48、72 h,MTT法检测其对细胞增殖的影响。将HaCaT细胞与200μg/L IFN?γ共培养建成炎性细胞模型,再与10和15μmol/L熊果酸共培养,以IFN?γ诱导的HaCaT炎性细胞模型为对照,探讨熊果酸的抗炎作用,RT?PCR法检测IL?6和IL?33 mRNA的表达,Western印迹法检测IL?33、p?ERK1/2和ERK1/2蛋白的表达。结果 MTT法检测显示,5~20μmol/L熊果酸作用24 h对细胞活力影响不大,而40~80μmol/L熊果酸在各个时间点均可明显抑制HaCaT细胞增殖（P<0.05）,故后续实验采用10和15μmol/L浓度。HaCaT细胞经IFN?γ刺激后,IL?33 mRNA（0.812±0.036）、IL?6 mRNA（0.947±0.091）表达量和IL?33蛋白表达（1.317±0.119）均显著高于空白对照组（分别为0.412±0.021、0.595±0.030和0.147±0.036,均P<0.05）;而IFN?γ+10μmol/L熊果酸组（分别为0.447±0.042、0.437±0.099和0.923±0.058）和IFN?γ+15μmol/L熊果酸组（分别为0.438±0.028、0.350±0.075和0.564±0.113）又较IFN?γ组（分别为0.812±0.036、0.947±0.091和1.317±0.119）显著降低（均P<0.05）,且这两个熊果酸组IL?33 mRNA水平与空白对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）,而IFN?γ+15μmol/L熊果酸组IL?33蛋白水平显著低于IFN?γ+10μmol/L熊果酸组（P<0.05）。HaCaT细胞分别经IFN?γ刺激5、60 min后,p?ERK1/2蛋白表达均明显高于空白对照组。IFN?γ+15μmol/L熊果酸5 min组和60 min组p?ERK1/2蛋白的相对表达量（0.458±0.053、0.302±0.054）分别低于IFN?γ5 min组（0.941±0.042）和60 min组（0.509±0.032）,差异均有统计学意义（P<0.05）,而总ERK1/2蛋白表达量不变。结论熊果酸能够降低IFN?γ刺激的HaCaT细胞IL?33的表达量,其机制可能与调节ERK信号通路相关蛋白的表达有关。     

缺氧诱导因子-1α小干扰RNA对HaCaT细胞VEGF表达的影响

目的 探讨缺氧诱导因子-1α( HIF-1α )RNA干扰对低氧条件下HaCaT细胞HIF -1α和血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响。方法 将HaCaT细胞分为4组：常氧对照组(无干预因素)、低氧组(缺氧培养24h)、脂质体对照组(转染空载脂质体后缺氧培养24h)、RNA干扰组(转染脂质体介导的RNA干扰序列后缺氧培养24 h)。荧光实时定量PCR法检测各组HaCaT细胞HIF-1α和VEGF mRNA表达水平,Western印迹检测各组HaCaT细胞HIF-1α和VEGF蛋白表达水平。结果 低氧组和常氧对照组HIF-1α mRNA的表达水平分别为0.907±0.032和0.878±0.034,两者比较差异无统计学意义(F=1.108,P＞0.05),而低氧组VEGF mRNA和HIF-1α及VEGF蛋白的表达水平分别为0.935±0.032和0.813±0.047,0.791±0.030,均较常氧对照组(分别为0.652±0.053、0.236±0.014和0.316±0.013)明显增高(P值均＜ 0.05);RNA干扰组HIF-1α mRNA及蛋白的表达水平为0.230±0.044和0.213±0.026,VEGF为0.497±0.033和0.249±0.028,均较脂质体对照组(分别为0.978±0.030、0.817±0.049和0.806±0.040、0.833±0.052)显著降低(P值均＜0.05)。结论 低氧可以使HaCaT细胞HIF-1α和VEGF的表达增加,而抑制HIF-1α的表达可以使低氧条件下HaCaT细胞VEGF的表达减少。     

微RNA-125a靶向白细胞介素23受体信号通路抑制HaCaT细胞增殖机制的初步研究

【摘要】 目的 探讨微RNA（miR）-125a抑制角质形成细胞增殖的相关机制。方法 用白细胞介素（IL）-23干预处理人永生化角质形成细胞（HaCaT）24 h后,分为miR-125a组和miR-NC组,分别转染miR-125a过表达质粒和过表达对照质粒。采用细胞计数试剂盒（CCK8）法检测两组转染后0、24、48、72 h HaCaT细胞增殖能力,采用实时荧光定量PCR检测转染后24 h两组miR-125a及IL-23受体（IL-23R）mRNA的表达,采用Western印迹法测定两组转染后48 h IL-23R、Janus激酶2（JAK2）、蛋白激酶B（AKT）和磷酸化AKT（p-AKT）的表达。采用双荧光素酶报告实验验证miR-125a和IL-23R间的靶向关系。两组间均数比较采用t检验,HaCaT细胞增殖能力随时间的变化采用重复测量方差分析法评估。结果 质粒转染后,miR-125a组miR-125a相对表达水平（6.377 ± 0.745）高于miR-NC组（0.700 ± 0.222）,差异有统计学意义（t = 7.305,P = 0.002）。转染后0、24、48 h,miR-125a组与miR-NC组细胞增殖能力差异无统计学意义（t值分别为0.663、0.623、1.930,均P > 0.05）;转染后72 h,miR-125a组细胞增殖能力显著低于miR-NC组（t = 4.407,P < 0.05）。MiR-125a组IL-23R mRNA表达水平显著低于miR-NC组（t = 3.082,P < 0.05）。与miR-NC组相比,miR-125a组IL-23R、JAK2和p-AKT蛋白表达量均降低,差异有统计学意义（t值分别为11.715、6.996、12.424,P值分别 < 0.001、 = 0.002、 < 0.001）。双荧光素酶报告实验显示,miR-125a可靶向结合IL-23R。结论 MiR-125a可能通过负性靶向调控IL-23R/JAK2/AKT信号通路抑制角质形成细胞的增殖。     

A375细胞外信号调节激酶通路与核因子κB通路的交互作用初探

【摘要】 目的 探讨黑素瘤细胞A375细胞外信号调节激酶（ERK）通路与核因子κB（NF-κB）信号转导通路的交互作用。 方法 将培养的A375细胞分为对照组、选择性ERK信号通路抑制剂U0126（10 μmol/L、5 μmol/L）处理组和选择性NF-κB通路抑制剂BMS-345541（10 μmol/L、5 μmol/L）处理组,分别提取蛋白质和mRNA,用Western 印迹、RT-PCR观察U0126抑制ERK通路后,NF-κB P65、p-IκBα蛋白及NF-κB P65 mRNA的表达,观察BMS-345541抑制NF-κB通路后ERK1/2 、p-ERK1/2蛋白及ERK1 mRNA的表达。 结果 应用10 μmol/L、5 μmol/L U0126抑制ERK通路后,胞核NF-κB P65蛋白表达（分别为0.60 ± 0.04、0.56 ± 0.06）均较对照组（1.54 ± 0.15）减少（P < 0.01）,其表达量与药物浓度无显著相关性（P > 0.01）;p-IκBα蛋白的表达（0.90 ± 0.05、0.70 ± 0.02）均较对照组（0.61 ± 0.03）增加（P < 0.01）,两药物浓度组之间的表达量差异有统计学意义（P < 0.01）;NF-κB P65 mRNA的表达（0.79 ± 0.05,0.75 ± 0.04）均较对照组（0.86 ± 0.05）减少（P < 0.01）。应用10 μmol/L BMS-345541抑制NF-κB通路后,ERK1/2、p-ERK1/2蛋白及ERK1 mRNA的表达（0.73 ± 0.07、0.75 ± 0.09、1.51 ± 0.02）较对照组减少（P < 0.01）,BMS-345541浓度为5 μmol/L时,ERK1/2、p-ERK1/2蛋白和ERK1 mRNA的表达（0.94 ± 0.11、0.99 ± 0.04、1.62 ± 0.03）较对照组的差异无统计学意义（均P > 0.05）。 结论 NF-κB通路和ERK通路在黑素瘤A375细胞中存在交互作用。     

节律基因隐花色素2在银屑病小鼠模型及HaCaT细胞中的表达变化及机制研究

【摘要】 目的 探讨节律基因隐花色素2（CRY2）在银屑病小鼠模型及HaCaT细胞中的表达变化及其机制。方法 咪喹莫特诱导小鼠模型实验：12只C57BL/6雌鼠随机均分为咪喹莫特组（连续外用咪喹莫特乳膏5 d诱导构建银屑病小鼠模型,6只）和对照组（不予任何处理,6只）,第6天处死小鼠,取其背部皮肤组织,免疫荧光染色检测表皮中CRY2的表达。HaCaT细胞转染实验：使用小干扰RNA（siRNA）技术在HaCaT细胞中敲减CRY2的表达（siRNA-CRY2组）,以siRNA-NC组作为对照,5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色检测HaCaT细胞增殖活力,实时荧光定量PCR（qPCR）检测HaCaT细胞中趋化因子mRNA表达水平,Western印迹检测细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）蛋白的磷酸化水平。肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激动物和细胞实验：12只C57BL/6雌鼠随机均分为TNF-α组（小鼠耳部皮下连续注射TNF-α溶液6 d,6只）和磷酸盐缓冲液（PBS）组（注射等量的PBS,6只）,第7天处死小鼠,取其耳部皮肤组织,免疫荧光染色检测表皮中CRY2的表达;用50 ng/ml TNF-α刺激CRY2基因敲减的HaCaT细胞12 h（siRNA-CRY2 + TNF-α组）,以siRNA-NC + TNF-α组作为对照,qPCR检测各组细胞中趋化因子mRNA的表达。统计分析采用两独立样本t检验。结果 免疫荧光染色显示,咪喹莫特组小鼠背部表皮层中CRY2蛋白的表达（0.94 ± 0.23）显著低于对照组（2.30 ± 0.25,t = 3.99,P = 0.016）。HaCaT细胞转染实验：siRNA-CRY2组EdU阳性细胞比例（48.13% ± 10.97%）显著高于siRNA-NC组（38.23% ± 0.81%,t = 5.00,P = 0.007）,且siRNA-CRY2组趋化因子CXCL1、CXCL8 mRNA相对表达量及p-ERK1/2蛋白相对表达量均显著高于siRNA-NC组（均P < 0.05）,但两组间CCL20 mRNA表达量及ERK1/2蛋白表达量差异无统计学意义（均P > 0.05）。TNF-α刺激实验：免疫荧光染色显示,TNF-α组鼠耳表皮组织中CRY2蛋白表达水平（0.37 ± 0.34）显著低于PBS组（2.04 ± 0.17,t = 4.38,P = 0.012）;siRNA-CRY2 + TNF-α组HaCaT细胞趋化因子CXCL1、CXCL8、CCL20 mRNA相对表达量均显著高于siRNA-NC + TNF-α组（均P < 0.05）。结论 CRY2在银屑病小鼠模型中表达降低,促进了角质形成细胞的增殖以及趋化因子CXCL1、CXCL8和CCL20的表达,且TNF-α可能是下调CRY2表达的上游细胞因子。     

安石榴苷对中波紫外线诱导HaCaT细胞光损伤的预防作用研究

目的 探讨安石榴苷对中波紫外线（UVB）诱导角质形成细胞损伤的保护机制。 方法 培养的HaCaT细胞分为空白对照组、安石榴苷组、UVB组、安石榴苷 + UVB组。噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力,Hoechst/碘化丙锭（PI）染色和流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法测定金属基质蛋白酶1（MMP1）及其组织抑制因子1（TIMP1） mRNA表达水平,Western印迹检测丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路相关蛋白P38、JNK、ERK的磷酸化水平变化。 结果 MTT试验示,10 ～ 40 μmol/L安石榴苷对UVB诱导的HaCaT细胞损伤有较佳的预保护作用。UVB组HaCaT细胞强Hoechst和强PI双染细胞较空白对照组增多,安石榴苷 + UVB组较UVB组减少。流式细胞仪分析,UVB组凋亡细胞百分率（9.82% ± 0.11%）高于空白对照（1.24% ± 0.91%,P < 0.01）,而安石榴苷（10、20、40 μmol/L） + UVB组凋亡细胞百分率（分别为6.38% ± 0.14%、5.24% ± 0.17%、3.77% ± 0.11%）较UVB组低,差异有统计学意义（均P < 0.01）。UVB组MMP1 mRNA相对表达量（12.376 ± 0.602）高于空白对照组（1.007 ± 0.147,P < 0.01）,而TIMP1 mRNA相对表达量（0.103 ± 0.006）低于空白对照组（1.006 ± 0.139,P < 0.01）,安石榴苷组MMP1及TIMP1 mRNA与空白对照组比较,差异无统计学意义（均P > 0.05）。安石榴苷预处理的HaCaT细胞经30 mJ/cm2 UVB照射后MMP1 mRNA相对表达量较UVB组降低（均P < 0.01）,而TIMP1 mRNA较UVB组升高（均P < 0.01）。Western印迹示,经UVB照射后,HaCaT细胞p-ERK、p-JNK及p-p38表达升高（均P < 0.01）。安石榴苷组HaCaT细胞p-ERK、p-JNK及p-p38表达没有明显改变（P > 0.05）,而安石榴苷 + UVB组有不同程度下降（均P < 0.01）。 结论 安石榴苷对UVB引起HaCaT细胞损伤有一定的预防作用。     

蛋白激酶B和丝裂原活化蛋白激酶在烟酸保护的HaCaT细胞抵抗中波紫外线损伤中的作用

目的 探讨烟酸保护由UVB诱导的角质形成细胞损伤的胞内信号传导分子机制。 方法 UVB照射和烟酸处理HaCaT细胞,TUNEL法检测细胞凋亡,Western印迹检测蛋白激酶B（Akt）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路相关蛋白Akt、P38、JNK、ERK1/2的磷酸化水平变化。ELISA检测细胞分泌内皮素1（ET-1）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的水平。结果 Western印迹结果表明,UVB照射和烟酸处理HaCaT细胞后,p-Akt、p-P38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白在60 min内都显著激活（P < 0.01）。烟酸预处理后的HaCaT细胞再经UVB照射,可以发现p-Akt、p-P38、p-ERK1/2信号分子在2 h内激活更显著（P < 0.01）。３个抑制剂加UVB照射组较3个单独抑制剂组ET-1、bFGF表达降低,差异均有统计学意义,其中LY294002组、SB203580组ET-1、bFGF水平最低;烟酸预保护的抑制剂处理组HaCaT细胞在UVB照射后,LY294002和U0126组没有出现ET-1、bFGF水平回升,SB203580组bFGF水平出现回升。结论　Akt信号分子在烟酸保护的HaCaT细胞抵抗UVB损伤中起一定的调控作用。     

NCSTN基因沉默对HaCaT细胞增殖分化的影响

【摘要】 目的 检测NCSTN基因稳定沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）增殖活性及相关分化蛋白的改变，初步探索反常性痤疮发病的可能机制。方法 构建慢病毒介导shRNA沉默NCSTN基因的HaCaT细胞模型（shRNA组），转染空载慢病毒的HaCaT细胞作为阴性对照组，实时定量PCR和Western印迹法检测NCSTN基因的沉默效率。CCK8法检测HaCaT细胞增殖活性，实时定量PCR和Western印迹法检测HaCaT细胞角蛋白（CK1、CK5、CK7、CK10、CK14、CK16、CK17、CK18、CK19、CK20）及其他分化分子（内披蛋白、兜甲蛋白）mRNA和蛋白的表达。两组计量资料的比较采用两独立样本t检验。结果 shRNA组NCSTN mRNA及蛋白表达（0.42 ± 0.19、0.30 ± 0.07）均显著低于阴性对照组（1.00 ± 0.34、1.00 ± 0.26；t = 5.196、2.637，P < 0.001、< 0.05），基因沉默效率达70%。与阴性对照组相比，shRNA组HaCaT细胞明显增殖活跃，CK16、CK19蛋白表达显著下调（t = 3.787、3.817，P < 0.01、< 0.05），终末分化分子内披蛋白表达明显降低（t = 2.904，P < 0.05）。结论 稳定沉默NCSTN基因表达会引起HaCaT细胞异常增殖分化，为后续探究NCSTN基因突变引起反常性痤疮提供新思路。     

双氢睾酮对HaCaT细胞SREBP-1c表达的影响

目的 探讨双氢睾酮（DHT）在HaCaT细胞固醇调控元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）表达中的作用。 方法 体外培养HaCaT细胞,分为4组,对照组不加任何刺激因素,DHT组分别加入3种不同浓度的DHT,LY294002 + DHT组在加入50 μmol/L PI3K抑制剂（LY294002）预处理40 min后加入100 nmol/L DHT,PD98059 + DHT组即在加入50 μmol/L MEK抑制剂（PD98059）预处理40 min后加入100 nmol/L DHT。用实时定量PCR和Western印迹法检测DHT对HaCaT细胞SREBP-1c mRNA和蛋白表达的影响。Western印迹法检测DHT作用于HaCaT细胞后蛋白激酶B（AKT）、胞外信号调控激酶（ERK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）的磷酸化情况。 结果 DHT可呈浓度依赖性上调HaCaT细胞SREBP-1c mRNA和蛋白的表达,并诱导AKT、ERK的磷酸化,但对p38、JNK的磷酸化无明显激活作用。LY294002预处理后HaCaT细胞SREBP-1c mRNA的表达较单纯DHT组明显降低（t = 9.406,P < 0.05）;SREBP-1蛋白水平降为0.7113 ± 0.0313,与单纯DHT组2.2577 ± 0.0601比较,差异有统计学意义（t = 39.498,P < 0.05）。而PD98059预处理后,SREBP-1c mRNA和蛋白的表达与单纯DHT组比较,差异均无统计学意义（P > 0.05）。结论 DHT可诱导HaCaT细胞SREBP-1c mRNA和蛋白的表达。     

瘦素调节HaCaT细胞角蛋白17的表达

目的 探讨瘦素对HaCaT细胞角蛋白17（K17）表达的影响。 方法 体外培养HaCaT细胞,给予100 ng/ml的瘦素作用24 h,应用实时PCR检测K17 mRNA表达水平、Western印迹及免疫荧光染色法检测K17蛋白表达水平变化。 结果 与阴性对照组（1.000 0 ± 0.000 0）相比较,瘦素组（3.086 7 ± 0.186 1）K17 mRNA表达显著升高,差异有统计学意义（P < 0.01）。Western印迹结果表明,瘦素组K17蛋白较阴性对照组显著上调,细胞免疫荧光染色结果与RT-PCR、Western印迹结果相符。与单纯使用瘦素组（2.242 7±0.188 7）相比较,STAT3抑制剂组和Erk1/2抑制剂组K17 mRNA分别为0.674 1 ± 0.060 0、0.855 0 ± 0.390 3,Western印迹和细胞免疫荧光染色显示,两个抑制剂组的K17蛋白较瘦素组均显著下调,差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论 瘦素可以诱导HaCaT细胞表达K17,其机制可能与激活STAT3、Erk1/2信号转导途径有关。