GFP标记的TH基因在帕金森病大鼠脑内的表达

目的:探讨HTH_1基因治疗帕金森病的可能性。方法:以绿色荧光蛋白(GFP)作为标记,观察HTH_1基因在体外和脑内的表达。结果:构建同时表达GFP和HTH_1双基因的多基因表达载体GC-GFP-P-HTH_1-SN,并转染L-6TG细胞,移植入帕金森病模型大鼠纹状体内,用荧光显微镜、流式细胞仪、免疫组化、Western blotting等方法检测GFP、THT_1在体外和脑内均有表达。结论:本实验为外源基因表达产物的检测提供一个新方法。     

Nurr1在MN9D细胞中的过表达及其对酪氨酸羟化酶的影响

目的:观察MN9D细胞中Nurr1的表达和分布及Nurr1过表达对酪氨酸羟化酶的影响.方法:应用高压液相色谱、免疫细胞化学、转基因、Western blot和Northern blot等方法检测了MN9D细胞中多巴胺及其代谢物的水平和Nurr1蛋白在细胞中的分布,建立了过表达Nurr1的细胞株并观察了Nurr1过表达对TH基因的影响.结果:MN9D细胞裂解液中含有大量多巴胺及其代谢物;Nurr1蛋白主要分布在MN9D细胞的胞质中,尤以核周最多;MN9D细胞中有Nurr1的mRNA存在和蛋白质的表达;过表达Nurr1的MN9D细胞A1株酪氨酸羟化酶表达增高.结论:Nurr1与多巴胺能神经元发育有关,有可能用于帕金森病的基因治疗.     

Nurr1在MN9D细胞中的过表达及其对酪氨酸羟化酶的影响

目的 :观察MN9D细胞中Nurr1的表达和分布及Nurr1过表达对酪氨酸羟化酶的影响。 方法 :应用高压液相色谱、免疫细胞化学、转基因、Westernblot和Northernblot等方法检测了MN9D细胞中多巴胺及其代谢物的水平和Nurr1蛋白在细胞中的分布 ,建立了过表达Nurr1的细胞株并观察了Nurr1过表达对TH基因的影响。结果 :MN9D细胞裂解液中含有大量多巴胺及其代谢物 ;Nurr1蛋白主要分布在MN9D细胞的胞质中 ,尤以核周最多 ;MN9D细胞中有Nurr1的mRNA存在和蛋白质的表达 ;过表达Nurr1的MN9D细胞A1株酪氨酸羟化酶表达增高。结论 :Nurr1与多巴胺能神经元发育有关 ,有可能用于帕金森病的基因治疗。     

Nurrl在MN9D细胞中的过表达及其对酪氨酸羟化酶的影响

目的：观察MN9D细胞中Nurrl的表达和分布及Nurrl过表达对酪氨酸羟化酶的影响。方法：应用高压液相色谱、免疫细胞化学、转基因、Westernblot和Northemblot等方法检测了MN9D细胞中多巴胺及其代谢物的水平和Nurr1蛋白在细胞中的分布，建立了过表达Nurr1的细胞株并观察了Nurr1过表达对TH基因的影响。结果：MN9D细胞裂解液中含有大量多巴胺及其代谢物；Nurr1蛋白主要分布在MN9D细胞的胞质中，尤以核周最多；MN9D细胞中有Nurr1的mRNA存在和蛋白质的表达；过表达Nurr1的MN9D细胞A1株酪氨酸羟化酶表达增高。结论：Nurr1与多巴胺能神经元发育有关。有可能用于帕金森病的基因治疗。     

大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马CA1区神经元酪氨酸羟化酶和多巴胺-β-羟化酶表达的变化

目的　研究大鼠全脑缺血再灌注损伤后酪氨酸羟化酶 (TH)和多巴胺 β 羟化酶 (DβH)表达的改变及意义。方法　利用改良四血管闭塞法 ,建立大鼠全脑缺血模型。于缺血再灌注后 1,3,5d断头取脑 ,行免疫组化染色 ,在光镜下观察海马CA1区神经元TH及DβH表达的变化 ,并计数海马CA1区正常神经元。结果　全脑缺血再灌注后 1d ,TH及DβH的表达呈阴性 ,海马CA1区神经元未见显著的病理形态学改变 ;全脑缺血再灌注后 3d ,TH及DβH呈阳性表达 ,海马CA1区可见部分神经元死亡 ;全脑缺血再灌注后 5d ,TH及DβH呈明显阳性表达 ,海马CA1区可见大部分神经元死亡。结论　全脑缺血再灌注后 ,由于TH及DβH异常表达 ,使得儿茶酚胺生物合成增加 ,这可能是短暂性脑缺血损伤的机理之一。     

帕金森病脑内移植基因工程细胞系的构建

目的 为进行帕金森病（PD）的转基因细胞治疗，在实验室构建人类酪氨酸羟化酶（hTH）基因表达工程细胞系。方法 重组质粒pcDNA3/hTH经亚克隆、纯化后，用脂质体法转染到人类神经母细胞瘤细胞系SH－SY5Y细胞内，经G418筛选、克隆，分离培养经免疫细胞化学分析。结果 转染pcDNA3/hTH的SH－SY5Y细胞免疫细胞化学染色明显，与仅呈非特异性染色的对照组SH－SY5Y细胞形成鲜明的对比。结论 转染pcDNA3/hTH的SH－SY5Y细胞能够有效地表达hTH，在PD治疗的非人类灵长目实验中具有潜在的应用价值。     

熄风定颤汤干预帕金森病模型大鼠中脑酪氨酸羟化酶及其mRNA表达

熄风定颤汤可缓解帕金森病患者的临床症状、延缓疾病进展,但熄风定颤汤的作用机制尚不明确。实验结果显示,帕金森病大鼠灌胃熄风定颤汤15,7.5,3.75g/(kg.d)治疗后异常行为学改变明显好转,中脑黑质酪氨酸羟化酶mRNA表达上调,中脑腹侧被盖部和黑质致密部酪氨酸羟化酶含量增加,效果与美多巴相当,且以7.5g/(kg.d)效果最好。由此说明,熄风定颤汤对帕金森病的治疗作用与上调中脑酪氨酸羟化酶及其mRNA表达有关。     

急性鱼藤酮中毒大鼠α-突触核蛋白与酪氨酸羟化酶的表达

目的探讨鱼藤酮中毒大鼠α-突触核蛋白与酪氨酸羟化酶免疫活性的变化。方法采用大鼠背部皮下持续注射小剂量鱼藤酮的方法,观察大鼠运动功能和生物学特征的变化。结果接受鱼藤酮注射的大鼠均出现明显的运动功能障碍,最严重表现是运动不能。大部分大鼠的黑质-纹状体酪氨酸羟化酶阳性神经元数目减少,全部大鼠的黑质细胞内均有α-突触核蛋白的过度表达。结论鱼藤酮中毒大鼠可以产生帕金森病的运动障碍及有关病理生理学特征。     

大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马CAl区神经元酪氨酸羟化酶和多巴胺—β—经化酶表达的变化

目的 研究大鼠全脑缺血再灌注损伤后酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺—β—羟化酶(DβH)表达的改变及意义。方法 利用改良四血管闭塞法，建立大鼠全脑缺血模型。于缺血再灌注后1，3，5d断头取脑，行免疫组化染色，在光镜下观察海马CA1区神经元TH及DβH表达的变化，并计数海马CAl区正常神经元。结果 全脑缺血再灌注后1d，TH及DβH的表达呈阴性，海马CA1区神经元末见显著的病理形态学改变；全脑缺血再灌注后3d，TH及DβH呈阳性表达，海马CA1区可见部分神经元死亡；全脑缺血再灌注后5d，TH及DβH呈明显阳性表达，海马CA1区可见大部分神经元死亡。结论 全脑缺血再灌注后，由于TH及DβH异常表达，使得儿茶酚胺生物合成增加，这可能是短暂性脑缺血损伤的机理之一。     

基因治疗帕金森病的实验研究

本研究把Ⅰ型人酪氨酸羟化酶(human tyrosine hydroxylase type Ⅰ;HTH_1)cDNA连接到逆转录病毒载体LNSX上,构建成真核表达载体 LNSHTH_1,然后通过in vivo途径转染帕金森病模型鼠的纹状体细胞。外源的HTH_1基因在宿主脑内得到了表达,并使其病理行为改善约70％。这种新的基因治疗帕金森病的方式,有其独特的优越性。     

GFP,TH双基因在NIH-3T3细胞及帕金森病大鼠脑内的表达

目的以绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）作为一个标记,观察ＧＦＰ标记的ＨＴＨ１基因修饰的ＮＩＨ－３Ｔ３细胞在体外及植入脑内后的生长情况,判断ＧＦＰ基因能否作为一种新的筛选标记基因。方法构建同时表达ＧＦＰ和ＨＴＨ１双基因的多基因表达载体ＧＣ－ＧＦＰ－Ｐ－ＨＴＨ１－ＳＮ。并转染ＮＩＨ－３Ｔ３细胞,且移植入Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ病模型大鼠纹状体内。结果用荧光显微镜、流式细胞仪、免疫组化、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ等方法均检测到ＧＦＰ、ＨＴＨ１在体外和脑内的表达。结论ＧＦＰ可作为一个筛选标记基因,可对目的基因或植入细胞的其他功能性产物的表达进行观察和检测。     

pcDNA3.1(+)GDNF真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建pcDNA3.1( )胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达。方法：将GDNF逆转录聚合酶链 式反应（RT－PCR）产物克隆至pcDNA3.1( ）真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以FuGene6介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及春表达蛋白折生物学活性。结果：RT－PCR产物为640bp特异性片段,pcDNA3.1( )GDNF重组体经酶切后分别出现640bp和300bp片段,测序分析与文献报道结果完全一致,表明重组pcDNA3.1( )GDNF表达质粒克隆成功,可见pcDNA3.1( )GDNF质粒在真核动物细胞中得到表达,GDNF蛋白能刺激含多巴胺的细胞生长,表明重组质粒能在真核动物细胞中出具有活性的GDNF蛋白。结论以FuGene6介导pcDNA3.1( )GDNF质粒传染真核细胞为基因治疗帕金森病奠定了一定基础。     

C6胶质瘤细胞多药耐药基因启动子靶向的双自杀基因表达载体的构建及鉴定

目的克隆多药耐药基因（MDRl）启动子，构建并鉴定MDR-1启动子靶向的CD、TK双自杀基因表达载体。方法提取耐药胶质瘤细胞株C6／ADR的基因组DNA，通过PCR方法选择性扩增多药耐药MDRl启动子片段，连接到T载体上，酶切后定向克隆入pcDNA3．TK载体上的CMV启动子位置，然后从pcDNA3．CD．TK上酶切下CD片段并插入上述载体形成pcDNA3．MDR1P．CDTK，通过电泳及DNA测序对其进行鉴定。结果通过PCR方法扩增出了MDR1启动子片段，并连接到T载体上，然后成功克隆入pcDNA3．TK中，形成pcDNA3．MDR1P．TK，将pcDNA3．CD．TK上的CD基因切下后插入pcDNA3．MDR1P．TK，电泳及DNA测序证实连接准确。结论成功构建了含正确MDR1启动子靶向的双自杀基因表达载体pcDNA3．MDR1P．CDTK，为今后靶向治疗耐药肿瘤构建载体提供了实验基础。     

α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶基因启动子的影响

目的 探讨α-突触核蛋白对多巴胺代谢的调节机制.方法 以人基因组DNA为模板,PCR法扩增酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)基因区的部分DNA片段(-495～ 25),将其插入质粒pGL3-Basic,构建荧光素酶报告基因重组质粒pGL3-THprom,转染多巴胺能神经元细胞系MES23.5和MES23.5/hα-Syn .结果 双荧光素酶活性分析表明,pGL3-Basic、pGL3-THprom和pGL3-Control在MES23.5细胞中表达的荧光素酶活性分别为5.60±0.67,26.80±4.11和32.90±4.75,而pGL3-THprom在MES23.5和MES23.5/hα-Syn 中表达的荧光素酶活性分别为26.80±4.11和14.40±0.61,差异极显著(P＜0.01).结论 这些结果提示扩增的DNA片段具有启动子活性,而α-Syn作为反式作用因子通过影响TH基因启动子的功能发挥对多巴胺代谢的负性调控作用.     

锌指转录因子snai1高表达质粒构建和稳定株的筛选

背景：研究表明Snai1和E-钙黏素在肿瘤组织中有负向表达关系，且与Snai1与CDH1启动子区box盒结合，抑制CDH1基因转录。 目的：构建针对snai1的高表达载体，建立稳定转染的细胞株。 方法：根据GenBank中snai1的基因序列人工合成snai1全序列，将合成好的序列装入Pmd-18T载体并转化感受态细胞DH5α，进行阳性克隆筛选。测序验证重组克隆中基因序列正确后，用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切Pmd-18T/snai1质粒，将所得的snai1全基因片段转入pcDNA3.1(+)空质粒，构建pcDNA(+)/snai1真核表达质粒，同时构建阴性对照质粒，并分别对结肠腺癌细胞HT-29进行转染，最后利用G418进行稳定表达株的筛选，并采用RT-PCR和Western blot鉴定宿主细胞内snai1基因的表达情况。 结果与结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA(+)/snai1，顺利转染结肠癌细胞HT-29后于600 mg/L G418浓度时筛选 21 d得到snai1基因稳定表达株，构建的snai1基因正义表达质粒pCDNA3.1(+)/snai1转染宿主细胞后可促进snai1基因的表达。 关键词：锌指转录因子snai1；表达质粒；感受态细胞；结肠癌；转染     

pcDNA3-hNGFb真核表达载体的构建及其表达

目的构建人神经生长因子β（NGF-β）基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表达。方法以RT-PCR从人脑组织总RNA中扩增NGF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD-NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NGF-β在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒pcDNA3-hNGFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人NGF-βcDNA完全一致。将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NGF-β及其前体proNGF-β能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hNGFb,为后续的研究奠定基础。     

Dickopff-1的真核表达载体构建及其对SHG44的作用

目的 构建Diekopff-1(DKK-1)的真核表达质粒,研究SHG44转染DKK-1并经BCNU处理后其生物学特性的变化.方法 将纯化扩增的人DKK-1与真核表达载体peDNA3.1连接后转化人大肠杆菌DH5α感受态扩增重组,以LipofectamineTM2000介导将重组质粒转染SHG44细胞,经G418筛选后进行鉴定.BCNU处理转染DKK-1基因后的SHG44细胞,流式细胞仪检测细胞特性变化.结果 扩增获得的816 bp特异片段,重组质粒经鉴定及测序分析结果 完全一致.重组载体转染SHG44细胞经G418筛选后,转染细胞在DNA、mRNA、蛋白水平均有DKK-1的表达.BCNU处理后的未转染、空质粒转染、重组质粒转染的三组SHG44细胞,平均凋亡率分别为1.0%、1.4%、8.0%.结论 本实验成功构建了pcDNA3.1-DKK-1真核表达质粒,并建立稳定表达DKK-1蛋白的胶质瘤细胞株(SHG44-DKK-1).转染DKK-1能增强SHG44对BCNU的敏感性,促进肿瘤细胞的凋亡.     

Beclin 1 基因对恶性胶质瘤细胞 U87 自噬活性和增殖的影响简

目的研究BeclinJ基因对U87胶质瘤细胞自噬和增殖的影响。方法实验分5组：空白对照组．pSUPER—Bec组（表达BeclinsiRNA）与其阴性对照组（pSUPER—non组）,pcDNA3．1-Bec组（表达BeclinJ基因质粒）与其阴性对照组（pcDNA3．1-non组）。分别转染U87细胞,采用免疫印迹检测Beclin1、LC3和p62蛋白在各组的表达;用氚标胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TdR）检测各组细胞增殖率。结果转染后48h,pSUPER—Bec组Beclin1、LC3B—11蛋白表达下降,p62蛋白表达升高。pcDNA3．1-Bec组Beclin1、LC3B-Ⅱ蛋白表达升高,p62蛋白表达下降。与空白对照组或pcDNA3．1-non组相比．pcDNA3．1-Bec组细胞增殖速度降低（P〈0．05）,其他各组细胞增殖速度无明显差异。结论恶性胶质瘤细胞中自噬相关基因Beclinj表达下降,过表达Beclinl蛋白能增强细胞的自噬活性,抑制细胞的增殖活性。     

反义封闭hTERT基因对人TJ905胶质瘤细胞端粒长度及p33ING1b表达的影响

目的 探讨反义封闭胶质瘤细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达,对其端粒长度及p33ING1b表达的影响.方法 用真核表达质粒(pcDNA3.0)构建hTERT正义和反义RNA表达载体.经脂质体介导,将空载体peDNA3.0及正义和反义RNA表达载体分别导人人胶质母细胞瘤细胞株(TJ905细胞),经G418筛选获得分别携带空载体、hTERT正义或反义RNA表达载体的三种TJ905细胞亚克隆.用Western blot、Tolo TAGGG端粒长度分析和RT-PCR方法,检测各对照组和反义封闭组不同代数TJ905细胞的hTERT蛋白表达、端粒长度及p33ING1b mRNA转录.结果 空白对照组、空载体组及正义RNA组TJ905细胞均有hTERT蛋白异常表达、端粒缩短迟缓及p33ING1b mRNA表达异常减少,以上三个对照组间这些指标的差异均无统计学意义(P>0.05).与以上三组相比,反义封闭组TJ905细胞的hTERT蛋白表达水平明显降低(P<0.01),端粒长度明显缩短(P<0.01),而p33ING1b mRNA表达水平则明显升高(P<0.01),它们各自与三个对照组相同指标之间的差异均有统计学意义.结论 胶质瘤细胞hTERT过表达导致的端粒酶异常再活化,可通过维持有效端粒长度抑制其抑癌因子p33ING1b表达,反义封闭hTERT基因表达可矫正该异常过程,提示hTERT是胶质瘤分子靶向治疗的重要靶点.