间质干细胞和肿瘤干细胞的分离鉴定及临床意义

干细胞(stem cell,SC)是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞,根据干细胞的来源及分化潜能一般将干细胞分为胚胎干细胞(embryonal stem cell)、生殖干细胞(germinal stem cell)和成体干细胞(adult stem cell)。由于干细胞的可塑性,使得干细胞在临床应用方面有着诱人的前景。近年来,随着人们对肿瘤细胞研究的不断深入,又提出了“肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)学说”[1],认为肿瘤细胞具有异质性,在肿瘤组织中存在数量极少的瘤细胞,在肿瘤的发生、发展中充当着干细胞的角色,具有无限增殖的潜能,在肿瘤的发生和生长中起着决定性作用…     

间质干细胞与造血干细胞移植

近年来,人们对骨髓中非造血干细胞研究的兴趣日益增加.间质干细胞(mesenchymal stemcells)是第一个从骨髓中分离的非造血干细胞,除支持造血功能外,间质干细胞能分化成成骨细胞、软骨细胞、腱细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、神经元细胞等.其具有体外高度扩增、多向分化、可被移植等特性.在造血干细胞移植、组织修补、基因治疗等领域有着广泛的临床应用前景.本文就间质干细胞生物学特性及其在造血干细胞移植中的应用前景作一综述.     

干细胞研究的理论与实验

目的：通过探讨近年来干细胞研究的进展，对干细胞的概念、调控、特征及应用进行进一步的阐述，说明作为“种子细胞”的干细胞的研究对胚胎发育研究及临床疾病治疗具有极其重大的意义。资料来源：应用计算机检索Medline数据库1980-01／2001-01有关干细胞研究的进展及临床价值的文章，检索词“embryonic stem cells，embryonic stem cell．hematopoietiestemcell，HSC／HPC，mesenchymal stem cell”限定文章语言种类为English。 资料选择：纳入标准：①有关干细胞的研究。②有关干细胞研究的进展及临床价值的研究。排除标准：重复研究。资料提炼：共收集到105篇有关干细胞的研究与进展的文章，排除重复或类似的同一研究，31篇符合研究要求。 资料综合：①干细胞的基础研究及其特性。干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。不对称分裂对干细胞自我复制非常重要，而这一行为是通过干细胞内的一些结构蛋白和多肽因子调控的，同时干细胞的分化还受到其周围组织细胞及细胞外基质等外源性因素的影响。②干细胞研究的进展。最近干细胞的研究有两个重大的技术突破，一是人类胚胎干细胞在体外培养成功，为胚胎干细胞的临床应用奠定了基础；另外一个重大突破是成体干细胞的横向分化。此外分离纯化技术的进步，加速了应用干细胞治疗疾病的速度。③基于对不同种类干细胞特性的研究和临床应用及其前景。④国内目前干细胞研究的现状和面临的问题。结论：通过近年来对干细胞的研究，发现千细胞在不同条件下的特性，从而确定对干细胞的研究必将对胚胎发育的临床研究及临床疾病的治疗起到极大的推动作用。     

骨髓间充质干细胞的分化潜能及临床应用价值

目的:观察人的骨髓间充质干细胞多分化潜能及在糖尿病治疗领域的价值。方法:实验于2005-07/2006-07在青岛大学医学院附属医院内分泌科完成。骨髓来源于非造血系统疾病的16岁儿童胸骨骨髓血(查体以排除造血系统疾病,结果显示为健康体质),经得家属同意。Percoll淋巴细胞分层液分离骨髓间充质干细胞,取第3代细胞,等密度接种于培养瓶中,经CD44抗体、CD45抗体、CD34抗体鉴定。取其第4代细胞,诱导其向脂肪细胞及神经细胞分化,利用碱性成纤维细胞生长因子预处理先获得巢蛋白阳性细胞,分别用两种方法诱导其向胰岛祖细胞的转化:化学物质诱导和共培养法诱导,免疫荧光检测胰岛祖细胞标志-胰十二指肠同源异型盒基因(蛋白的表达,电化学发光法检测其是否表达胰岛素)。胶原酶消化法获取胰腺间充质干细胞,鉴定,用添加碱性成纤维细胞生长因子的无血清低糖DMEM使其增殖。将胰腺间充质干细胞接种于底层已接种骨髓间充质干细胞的6孔板共培养,共培养法诱导骨髓间充质干细胞向胰岛祖细胞的初步转化。结果:成脂诱导及成神经诱导可获得油红O染色阳性细胞以及巢蛋白阳性细胞。化学法向胰岛祖细胞诱导后可检测到PDX-1免疫反应阳性细胞。共培养法诱导也可获得PDX-1免疫反应阳性细胞。新生儿胰腺具有巢蛋白、CK-19阳性的胰腺间充质干细胞,体外高糖诱导可形成胰岛样细胞团。结论:骨髓间充质干细胞在体外具有诱导分化为脂肪细胞、神经元样细胞及胰岛祖细胞的潜能。新生儿胰腺间充质干细胞向胰岛细胞分化过程中所分泌的一些物质对骨髓间充质干细胞向胰岛祖细胞的转化具有促进作用。     

干细胞移植修复臂丛神经损伤的应用前景

目的:介绍神经干细胞和/或骨髓间质干细胞移植修复臂丛神经损伤的应用及其前景。方法:应用计算机检索Medline数据库1997-01/2007-08,万方数据库2001-01/2007-08与神经干细胞、骨髓间充质干细胞移植修复周围神经损伤、尤其是修复臂丛神经损伤相关的文章,无论中英文、有无对照组均纳入,排除重复研究或Meta分析类文章。共收集到80篇相关文献,34篇符合标准。结果:干细胞移植治疗神经系统疾病越来越引起关注,其中神经干细胞和骨髓间充质干细胞研究较多。神经干细胞和骨髓间充质干细胞在一些相关因素作用下可以分化为许旺细胞、神经元细胞、胶质细胞等,移植后对动物模型有较好的治疗效果,所以有巨大的潜能来修复包括臂丛神经在内的周围神经损伤。神经干细胞和骨髓基质细胞可用来构建组织工程神经,也许能够达到周围神经功能更完美的修复。如何为损伤神经提供有利的环境,如何促进干细胞的存活和增加向许旺细胞或神经元分化的数量,仍是研究者要面临的问题。结论:随着基础研究的深入,神经于细胞、骨髓间充质干细胞移植治疗臂丛神经损伤的技术得会更加成熟,有望更好地应用于临床。     

间质干细胞与造血干细胞移植

近年来，人们对骨髓中非造血干细胞研究的兴趣日益增加，间质干细胞（mesenchymal stem cells)是和线个从骨髓中分离的非造血干细胞，除支持造血功能外，间质干细胞能分化成成骨细胞，软骨细胞，腱细胞，脂肪细胞，平滑肌细胞，神经元细胞等，其具体外高度扩增，多向分化，可被移植等特性，在造血干细胞移植，组织修补，基因治疗等领域有着广泛的临床应用前景，本文就间质干细胞生物学特性为其在造血干细胞移植中的应用前景作一综述。     

脂肪间充质干细胞移植对犬心肌梗死后心功能的影响

目的：观察将脂肪间充质干细胞移植人犬心肌梗死模型后，犬心功能的变化情况。方法：实验于2005—08／2006-03在解放军总医院心内科实验室及解放军总医院实验动物中心完成，选用杂种犬13只，按随机数字表法分为2组，对照组7只，脂肪间充质干细胞移植组6只。①两组犬均进行心肌梗死模型制备，取犬脂肪间充质干细胞进行体外分离培养和DAPI标记，脂肪间充质干细胞移植组犬心外膜下共注射2&;#215;10^6个DAPI标记后的脂肪间充质干细胞，对照组注射相同体积IMDM完全培养基。常规关闭胸腔，继续饲养4周。②于细胞移植术前、术后4周行超声心动检查，测定左心室射血分数、左心室舒张末容积及左心室收缩末容积；术后4周行血流动力学检查，测定左心室舒张末压力、左心室收缩末压力、左心室室内压最大上升速率及左心室室内压最大下降速率。术后4周后处死动物取心脏标本观察移植细胞存活及分化情况。结果：对照组1只犬于移植术后第2天死亡，进入结果分析共12只犬，对照组和脂肪间充质干细胞移植组各6只。①移植术后4周移植细胞存活及分化的观察结果：在脂肪间充质干细胞移植组心肌组织冰冻切片中可见发出DAPI蓝色荧光染色的细胞核，同一视野下还可看到发绿色荧光的细胞浆。②移植术后4周两组犬心功能的比较：脂肪间充质干细胞移植组与对照组比较，左心室室内压最大下降速率、左心室舒张末压力、左心室舒张末容积及左心室收缩末容积减少（P〈0．05～0．01），左心室射血分数、左心室收缩末压力、左心室室内压最大上升速率增加（P〈0．05-0．01）。结论：脂肪间充质干细胞移植可在心肌细胞内存活，并可分化为心肌细胞，改善急性心肌梗死后心力衰竭犬的心脏功能。     

骨髓间充质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养后的成骨特性

目的：观察由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养时对骨髓间充质干细胞成骨作用的影响。 方法：实验于2005—03／11在复旦大学附属中山医院外科中心实验室完成。①使用密度梯度离心法分离兔骨髓间充质干细胞。②取传两三代细胞分组分别进行如下操作：骨髓间充质干细胞组仅应用基础培养液（DMEM—LG培养基、体积分数为0．1的胎牛血清）常规培养；骨髓间充质干细胞成骨诱导组在基础培养液中加入成骨诱导剂；内皮细胞诱导组在内皮细胞生长培养基作用下将骨髓间充质干细胞诱导为内皮细胞；诱导的骨髓间充质干细胞与内皮细胞联合培养组将骨髓间充质干细胞和诱导而来的内皮细胞按1：1的比例接种于培养板中，加入成骨诱导培养液。③通过干细胞形态、免疫荧光、细胞增殖、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量等从酶学、组织学、生化等不同方面观察诱导的内皮细胞对骨髓间充质干细胞成骨活性及细胞生长情况的影响。 结果：①免疫细胞荧光染色结果：内皮细胞诱导组培养诱导的细胞成为内皮细胞。②倒置相差显微镜、苏木精一伊红染色结果：均显示联合培养组骨髓间充质干细胞和诱导的内皮细胞混合生长良好。③四甲基偶氮唑盐法检测结果：各组细胞增殖差异无显著性（P〉0．05）。④碱性磷酸酶活性：除内皮细胞诱导组外，其他3组细胞的活性均随时间的延长而逐渐增高，联合培养组增长最明显，第12天时联合培养组细胞碱性磷酸酶活性已达到（618．46&;#177;28．34）nkat／L，高于其他各组（P〈0．05）。⑤骨钙素检测结果：在培养的第7天、第14天，联合培养组的骨钙素分泌量分别为2．03，3．17μg／L，明显高于其他各组（P〈0．01）。 结论：由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞能够增强骨髓间充质干细胞的成骨活性，提高骨髓间充质干细胞的增殖能力。     

体外培养骨髓间质干细胞向神经细胞分化的研究进展

成年动物骨髓中有两类干细胞，一是造血干细胞，另一为非造血干细胞，最早称之为成纤维克隆形成单位(CFU—fibroblast)，现指骨髓间质干细胞(mesenchymal stemcell，MSCs)或称之为骨髓基质细胞(BMSCs)。MSCs并非由单一的细胞群体组成，根据MSCs的形态特点将其分为毯子样细胞、网状细胞、     

干细胞研究的理论与实验

目的:通过探讨近年来干细胞研究的进展,对干细胞的概念、调控、特征及应用进行进一步的阐述,说明作为“种子细胞”的干细胞的研究对胚胎发育研究及临床疾病治疗具有极其重大的意义。资料来源:应用计算机检索Medline数据库1980-01/2001-01有关干细胞研究的进展及临床价值的文章,检索词“embryonicstemcells,embryonicstemcell,hematopoieticstemcell,HSC/HPC,mesenchymalstemcell”限定文章语言种类为English。资料选择:纳入标准:①有关干细胞的研究。②有关干细胞研究的进展及临床价值的研究。排除标准:重复研究。资料提炼:共收集到105篇有关干细胞的研究与进展的文章,排除重复或类似的同一研究,31篇符合研究要求。资料综合:①干细胞的基础研究及其特性。干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。不对称分裂对干细胞自我复制非常重要,而这一行为是通过干细胞内的一些结构蛋白和多肽因子调控的,同时干细胞的分化还受到其周围组织细胞及细胞外基质等外源性因素的影响。②干细胞研究的进展。最近干细胞的研究有两个重大的技术突破,一是人类胚胎干细胞在体外培养成功,为胚胎干细胞的临床应用奠定了基础;另外一个重大突破是成体干细胞的横向分化。此外分离纯化技术的进步,加速了应用干细胞治疗疾病的速度。③基于对不同种类干细胞特性的研究和临床应用及其前景。④国内目前干细胞研究的现状和面临的问题。结论:通过近年来对干细胞的研究,发现干细胞在不同条件下的特性,从而确定对干细胞的研究必将对胚胎发育的临床研究及临床疾病的治疗起到极大的推动作用。     

兔脂肪间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的特征

目的：分离培养兔脂肪间充质干细胞，探讨兔脂肪间充质干细胞在体外向神经细胞分化的能力。 方法：实验于2002-09／2005—09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。选取清洁级新西兰大白兔5只，采用1型胶原酶消化兔腹股沟皮下脂肪组织，分离培养脂肪间充质干细胞。取生长状况良好的第2，5，10代细胞，绘制生长曲线，计算细胞群体倍增时间。采用免疫组化方法对脂肪间充质干细胞表面分子标志[CD14，CD29，CD34，CD44．CD45，CD105及人白细胞抗原DR亚类（群）]进行鉴定，并采用1，2、5，5，10mmol／L不同浓度的β-巯基乙醇检测脂肪间充质干细胞向神经细胞分化的能力。 结果：①脂肪间充质干细胞生长曲线分析：第2，5．10代细胞体外传代培养的潜伏期约为24-48h，传代培养细胞的对数增殖期为6d，接种后第9天进入平台期。在细胞生长的对数期．脂肪间充质干细胞的倍增时间为64．12h。②脂肪间充质干细胞分子特征的鉴定结果：第2～5代细胞90％以上CD29，CD44，CD105呈阳性表达，而不表达CD14，CD34．CD45及人白细胞抗原DR亚类（群）等表面分子标记。③脂肪间充质干细胞向神经细胞分化情况：体外能够分化为神经细胞。 结论：兔脂肪组织可分离培养出脂肪间充质干细胞，并能够向神经细胞分化，有望成为组织工程的种子细胞来源。     

储运条件对脐带间充质干细胞存活率的影响

背景：国内外尚无对脐带间充质干细胞运输过程中相关活力指标的全面评估。目的：检测白蛋白和储运时间等不同条件对脐带间充质干细胞存活率的影响。方法：体外培养的脐带间充质干细胞分为实验组和对照组,每组将3．15×10^9L-1细胞悬浮在3mL生理盐水中。其中实验组加入1％白蛋白并避光保存,对照组分为不加白蛋白避光保存组和加白蛋白光照保存组,在0,2,4,8和24h分别测定各组细胞数、锥虫蓝拒染率和细胞存活率。结果与结论：与对照组相比,实验组（保存液中加白蛋白且避光）的8h细胞损失率几乎为零,细胞存活率接近90％。对照中不加白蛋白组8h细胞损失率高达38．5％,细胞存活率为86％。在脐带间充质干细胞的长途运输中,加入1％白蛋白可以有效保证细胞存活量。运输时间超出8h后,细胞损失率上升且存活率下调。实验数据表明,16℃、避光和1％白蛋白生理盐水的保存条件下,脐带间充质干细胞在8h内符合临床输注要求。     

胎儿骨髓间质干细胞与细胞因子对脐血CD34+细胞扩增作用

目的　探讨胎儿骨髓间质干细胞对CD34 细胞体外扩增的造血支持作用。方法　体外分离、纯化胎儿骨髓间质干细胞 ;Mini MACS免疫磁珠分选 3份脐血CD34 细胞 ;建立胎儿骨髓间质干细胞与CD34 细胞共培养体系 :第 1组为单独CD34 细胞培养 ,第 2组为胎儿骨髓间质干细胞 CD34 细胞共培养 ,第 3组为细胞因子 (干细胞因子 ,白细胞介素 3,Flt3配体 ,血小板生成素 ) CD34 细胞共培养 ,第 4组为胎儿骨髓间质干细胞 细胞因子 CD34 细胞共培养。用流式细胞仪检测不同培养时间的CD34 细胞。结果　胎儿骨髓间质干细胞表达CD2 9,CD4 4 ;免疫磁珠分选CD34 细胞的平均纯度为 97.4 % ;胎儿骨髓间质干细胞 CD34 细胞共培养 2 8d ,有核CD34 细胞仍占有核细胞的 6 .4 3% ;CD34 细胞在胎儿骨髓间质干细胞、细胞因子作用下培养 2 8d ,有核细胞总数、CD34 细胞数分别被扩增 1.6 5× 10 5倍、788倍。结论　胎儿骨髓间质干细胞可有效扩增脐血造血干 /祖细胞。     

体外诱导胎盘间充质干细胞分化为内皮细胞的可能性

目的：观察体外诱导胎盘间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性。 方法：实验于2004-05／-2005—10在无锡第三人民医院细胞实验室完成。①分离培养胎盘间充质干细胞，鉴定其表面抗原，分别加入CD34-nTC，CD45-PE，CD19-FITC，CD29-FITC，CD44-PE，CD105-FITC，CD106-FITC，HLA—DR—FITC鼠抗人单克隆抗体，进行流式细胞仪分析。②培养细胞诱导分化：取培养2代细胞，用培养基为DMEM／F12＋体积分数为0．02的胎牛血清＋50μs／L血管内皮细胞生长因子的条件培养基诱导。③诱导细胞免疫组织化学染色分析：诱导后细胞通过内皮细胞标志物KDR，FLT—1以及v—WF染色鉴定。 结果：①胎盘间充质干细胞的原代培养结果：随着细胞密度的增加，胞体变得细长，形态类似成纤维细胞。原代细胞生长较慢，传代细胞在3～5d左右可增殖1倍。培养的细胞可以稳定生长传代。②胎盘间充质干细胞的表面抗原测定结果：胎盘间充质干细胞表面抗原CD29，CD44，CD105阳性；CD34，CD45，CD19，CD106以及HIA—DR阴性。③胎盘间充质干细胞的诱导分化及染色结果：诱导后细胞形态明显改变，胞体逐步回缩，立体感增强，内皮细胞标志物KDR，FLT—1以及v—WF染色结果阳性。 结论：胎盘间充质干细胞在体外具有分化为血管内皮细胞的能力，可以作为干细胞研究的一种有效来源。     

脂肪间充质干细胞移植对犬心肌梗死后心功能的影响

目的:观察将脂肪间充质干细胞移植入犬心肌梗死模型后,犬心功能的变化情况。方法:实验于2005-08/2006-03在解放军总医院心内科实验室及解放军总医院实验动物中心完成,选用杂种犬13只,按随机数字表法分为2组,对照组7只,脂肪间充质干细胞移植组6只。①两组犬均进行心肌梗死模型制备,取犬脂肪间充质干细胞进行体外分离培养和DAPI标记,脂肪间充质干细胞移植组犬心外膜下共注射2×106个DAPI标记后的脂肪间充质干细胞,对照组注射相同体积IMDM完全培养基。常规关闭胸腔,继续饲养4周。②于细胞移植术前、术后4周行超声心动检查,测定左心室射血分数、左心室舒张末容积及左心室收缩末容积;术后4周行血流动力学检查,测定左心室舒张末压力、左心室收缩末压力、左心室室内压最大上升速率及左心室室内压最大下降速率。术后4周后处死动物取心脏标本观察移植细胞存活及分化情况。结果:对照组1只犬于移植术后第2天死亡,进入结果分析共12只犬,对照组和脂肪间充质干细胞移植组各6只。①移植术后4周移植细胞存活及分化的观察结果:在脂肪间充质干细胞移植组心肌组织冰冻切片中可见发出DAPI蓝色荧光染色的细胞核,同一视野下还可看到发绿色荧光的细胞浆。②移植术后4周两组犬心功能的比较:脂肪间充质干细胞移植组与对照组比较,左心室室内压最大下降速率、左心室舒张末压力、左心室舒张末容积及左心室收缩末容积减少(P<0.05～0.01),左心室射血分数、左心室收缩末压力、左心室室内压最大上升速率增加(P<0.05～0.01)。结论:脂肪间充质干细胞移植可在心肌细胞内存活,并可分化为心肌细胞,改善急性心肌梗死后心力衰竭犬的心脏功能。     

狼疮骨髓间质干细胞的免疫调节及免疫治疗

间质干细胞（MSC）具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、骨髓基质细胞、肝脏细胞和神经细胞等多种细胞分化的一类多能干细胞。MSC不仅具有支持造血和修复作用，还有多种免疫调节作用，它们还可诱导免疫耐受。MSC已用于治疗移植物抗宿主病（GVHD），最近作者采用异基因MSC移植治疗系统性红斑狼疮（SLE）取得了满意的效果，     

细胞间接触诱导大鼠骨髓间质干细胞向平滑肌细胞的分化

背景:干细胞能够分化为血管平滑肌细胞,参与动脉粥样硬化发生、发展,其机制尚不清楚。“环境诱导分化学说”认为细胞-细胞接触、细胞因子可能在干细胞分化过程中起关键作用。骨髓间质干细胞具有向平滑肌细胞分化的潜能。目的:体外诱导骨髓间质干细胞分化为平滑肌细胞,观察已分化成熟平滑肌细胞及细胞因子对骨髓间质干细胞分化的影响。设计:以细胞为观察对象的重复观察测量,对照性体外实验。单位:西安交通大学第一医院心内实验室。材料:实验于2003-05/2004-05在西安交通大学第一医院心内实验室完成。SD大鼠60～80g、90～110g,雌雄不限,由本校动物中心提供。PE标记小鼠抗大鼠CD34(Santa Cruz),PE标记小鼠抗大鼠CD71(Oxford Biotechnology),FITC标记小鼠抗大鼠CD90(Oxford Biotechnology),小鼠抗人单克隆抗体SM-α-actin(NeoMarkers),小鼠抗人单克隆抗体Calponin(NeoMarkers),TRITC标记山羊抗小鼠IgG(SBA),pEGFP-N3(本实验室提供),Lipofectamine2000(Invitrogen)。方法:采用密度梯度离心和细胞贴壁法与组织贴块法分离培养骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞。通过流式细胞仪检测,平滑肌细胞抗体免疫荧光染色,鉴定骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞。将骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白,以未转染的骨髓间质干细胞为对照。骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞分条件培养:①取3代骨髓间质干细胞传至12孔培养板,培养液为低糖DMEM加骨髓间质干细胞条件培养液各半,胎牛血清浓度为0%、5%、7.5%。细胞固定后,应用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果。②将半透膜小室置于6孔培养板每一孔内,使每孔隔成内外两室。将骨髓间质干细胞在外室培养,平滑肌细胞在内室培养。以单独培养的骨髓间质干细胞为对照,胎牛血清浓度为3%、7.5%。用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果。③骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养:于骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白后24h,向每孔内加入等量的平滑肌细胞混合培养,观察细胞形态变化。以单独培养的骨髓间质干细胞为对照。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞流式细胞仪检测结果。②不同条件培养下平滑肌细胞抗体免疫荧光染色结果。结果:①免疫荧光染色示,平滑肌细胞抗SM-α-actin阳性,抗calponin阳性。骨髓间质干细胞抗SM-α-actin阳性,而抗calponin阴性。②流式细胞仪检测,骨髓间质干细胞不表达CD34,弱表达CD71,高表达CD90。③骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白持续表达约2周～3周。④加入平滑肌细胞培养液或不同浓度的胎牛血清,骨髓间充质干细胞生长良好。骨髓间充质干细胞与平滑肌细胞分层培养中,骨髓间充质干细胞生长对胎牛血清呈浓度依赖性。骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养7d后免疫荧光染色,可见绿色荧光蛋白和抗SM-α-actin、Calponin的双标细胞存在。而加平滑肌细胞条件培养液与分层培养组中骨髓间质干细胞均不表达Calponin。结论:①平滑肌细胞培养液及细胞因子只能促进骨髓间充质干细胞生长,细胞胞浆颗粒增多,并不能诱导骨髓间充质干细胞分化为平滑肌细胞。②细胞间直接接触对诱导骨髓间质干细胞定向分化为平滑肌细胞起决定作用。     

骨髓间充质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养后的成骨特性

目的:观察由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养时对骨髓间充质干细胞成骨作用的影响。方法:实验于2005-03/11在复旦大学附属中山医院外科中心实验室完成。①使用密度梯度离心法分离兔骨髓间充质干细胞。②取传两三代细胞分组分别进行如下操作:骨髓间充质干细胞组仅应用基础培养液(DMEM-LG培养基、体积分数为0.1的胎牛血清)常规培养;骨髓间充质干细胞成骨诱导组在基础培养液中加入成骨诱导剂;内皮细胞诱导组在内皮细胞生长培养基作用下将骨髓间充质干细胞诱导为内皮细胞;诱导的骨髓间充质干细胞与内皮细胞联合培养组将骨髓间充质干细胞和诱导而来的内皮细胞按1∶1的比例接种于培养板中,加入成骨诱导培养液。③通过干细胞形态、免疫荧光、细胞增殖、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量等从酶学、组织学、生化等不同方面观察诱导的内皮细胞对骨髓间充质干细胞成骨活性及细胞生长情况的影响。结果:①免疫细胞荧光染色结果:内皮细胞诱导组培养诱导的细胞成为内皮细胞。②倒置相差显微镜、苏木精-伊红染色结果:均显示联合培养组骨髓间充质干细胞和诱导的内皮细胞混合生长良好。③四甲基偶氮唑盐法检测结果:各组细胞增殖差异无显著性(P>0.05)。④碱性磷酸酶活性:除内皮细胞诱导组外,其他3组细胞的活性均随时间的延长而逐渐增高,联合培养组增长最明显,第12天时联合培养组细胞碱性磷酸酶活性已达到(618.46±28.34)nkat/L,高于其他各组(P<0.05)。⑤骨钙素检测结果:在培养的第7天、第14天,联合培养组的骨钙素分泌量分别为2.03,3.17μg/L,明显高于其他各组(P<0.01)。结论:由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞能够增强骨髓间充质干细胞的成骨活性,提高骨髓间充质干细胞的增殖能力。     

骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的研究现状和展望

目前心肌梗死的治疗手段主要包括药物治疗、冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路手术等，这些手段只能在一定程度上挽救濒死心肌细胞，防止梗死扩大，缩小心肌缺血范围，也在可以在一定程度上缓解患者的临床症状，理想的疗法应是能使心肌重生来改善心脏的功能。干细胞是一类具有无限或较长期增殖、自我更新和分化潜能的细胞，干细胞移植是一项新兴的细胞生物工程技术。因此，近年来，干细胞移植治疗心肌梗死成为一个研究热点。     

克隆化兔骨髓基质干细胞系的建立及其生物学特性

建立克隆化兔骨髓基质干细胞系，为组织缺损修复研究寻找理想的种子细胞提供新的途径。方法：实验于2004—09／2005—12在浙江省医学科学院生物工程研究所完成。①取3个月龄新西兰白兔，无菌抽取骨髓液，经密度梯度离心和贴壁培养，获得原代培养骨髓基质干细胞。用有限稀释法进行克隆化培养，选择单细胞克隆增殖细胞，进行扩大培养和液氮冻存保种。②取对数生长期第2，15和32代克隆化骨髓基质干细胞，用四甲基偶氮唑盐法测定其吸光值（A值），绘制生长曲线。⑧取第4和32代对数生长期骨髓基质干细胞，按常规方法制作染色体标本，进行染色体分析。④取第5代对数生长期骨髓基质干细胞，用成骨诱导试验进行体外分化潜能鉴定。⑤取第5代对数生长期的骨髓基质干细胞．按常规方法测定最适细胞接种密度。结果：①克隆化兔骨髓基质干细胞系的建立结果：获得一株克隆化兔骨髓基质干细胞系，其细胞形态为均一的长梭形，体外连续传代培养至32代，细胞仍保持旺盛的增殖能力。经-196℃冻存复苏后仍保持良好的生长状态。②生长曲线：克隆化骨髓基质干细胞的第2，15和32代细胞生长曲线基本相同，细胞增殖速度没有明显的下降趋势。⑧染色体分析：第4和32代克隆化兔骨髓基质干细胞的染色体众数均为44条，结构未见异常。显示该细胞在体外经过32代培养，仍保持稳定的二倍体核型。④最适接种密度：第5代对数生长期骨髓基质干细胞，经常规方法测定，以1&;#215;10^3／cm^2的接种密度为最适接种密度。⑤体外分化潜能：第6代克隆化骨髓基质干细胞，在向成骨细胞诱导条件下，4，8，12碱性磷酸酶的表达均显著高于对照组[（375．41&;#177;13．17）比（239．38&;#177;7．33）nkat／L，（503．77&;#177;13．34）比（249．22&;#177;5．17）nkat／L，（605．95&;#177;10．84）比（298．73&;#177;8．17）nkat／L．P〈0．01]；茜素红染色显示有钙化结节形成，对照组为阴性。表明克隆化兔骨髓基质干细胞具有体外诱导分化潜能。结论：采用克隆化分离技术，成功获得了单细胞克隆的具有旺盛增殖能力和分化潜能，遗传性能稳定的兔骨髓基质干细胞系。