B7-H1阻断对CD3AK细胞体外生物学活性的影响

目的: 探讨B7-H1阻断对CD3AK细胞增殖活化及其抗肿瘤免疫效应的影响.方法: 利用CD3单克隆抗体(mAb)刺激健康人外周血淋巴细胞诱导产生CD3AK细胞,然后利用B7-H1阻断型抗体阻断B7-H1通路,3H-TdR渗入法检测阻断后CD3AK细胞的增殖能力,ELISA法检测阻断后CD3AK细胞分泌IFN-γ、 TNF-α和IL-10的水平,同时将CD3AK细胞作用于膀胱肿瘤BIU-87细胞,MTT法检测阻断后CD3AK细胞的杀伤活性.结果: B7-H1阻断后,CD3AK细胞的增殖能力明显增强,体外存活时间明显延长;其分泌IFN-γ、 TNF-α的水平明显提高,而分泌IL-10的水平明显下降;同时CD3AK细胞对BIU-87细胞的杀伤活性亦明显升高.结论: 阻断B7-H1通路可以促进和维持CD3AK细胞的增殖和活化,并增强其抗肿瘤的免疫效应.阻断B7-H1通路将有望成为肿瘤免疫治疗的新策略.     

联合应用CD3/CD28单克隆抗体对小鼠T淋巴瘤细胞EL4活化的影响

目的:研究联合应用CD3/CD28单克隆抗体对小鼠T淋巴瘤细胞EL4活化的影响.方法:ELISA方法检测不同浓度CD3/CD28抗体在不同时间点体外刺激EL4细胞后培养上清中IL-2的分泌;CCK-8方法检测EL4细胞增殖能力;流式细胞术检测EL4细胞周期;RT-PCR检测IL-2、NF-κB和NF-AT转录因子的转录情况.结果:在48小时抗CD3抗体(25μg/ml)与抗CD28抗体(2μg/ml)共刺激EL4细胞明显增加IL-2的分泌和细胞增殖能力,不影响细胞周期.结论:EL4细胞可以作为研究小鼠T淋巴瘤细胞活化的细胞模型.     

CD28单抗对CD3AK细胞增殖及表型的影响

CD3AK细胞是用小剂量CD3单抗交联CD3分子而活化的T细胞 ,它具有较强的细胞增殖和细胞毒效能。CD2 8分子则是T细胞激活过程中所需的协同刺激分子 ,可提供T细胞活化所需的第二信号。本文利用CD2 8单抗作为CD2 8分子的配体 ,观察了CD2 8信号途径的激活对CD3AK细胞的影响。结果显示CD2 8单抗可增强CD3AK细胞的增殖活性和趋化团聚形成集落的能力 ,并优先引起CD4+T细胞的增殖。     

抗人CD28激发性单抗对T细胞淋巴瘤的抑制作用研究

目的:研究鼠抗人CD28单克隆抗体(克隆号:2F5)对T淋巴细胞瘤的抗肿瘤效应,为抗体介导肿瘤靶向治疗提供新的方法和思路。方法:流式细胞术检测鼠抗人CD28单克隆抗体2F5对人T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞表面膜型CD28分子的识别;MTT法检测2F5对Jurkat细胞体外增殖的影响;将Jurkat细胞株接种于裸鼠腋下,建立Jurkat细胞荷瘤裸鼠模型;经瘤内多点注射2F5(注射剂量1μg/mm3),逐日观察肿瘤的大小和裸鼠的生存状态。结果:2F5能够识别Jurkat细胞表面CD28分子,阳性结合率可达93.37%;2F5与Jurkat细胞共培养后,显微镜下观察可见胞质中出现黑色颗粒,胞膜破裂,细胞的折光性和立体感减弱;MTT法分析结果显示,抗CD28单抗对Jurkat细胞的体外增殖具有明显的抑制作用;将Jurkat细胞接种35只裸鼠(成瘤率达70%);经瘤内多点注射2F5,35天后荷瘤小鼠体内肿瘤的生长速率明显降低;而生理盐水对照组肿瘤生长无明显改变。结论:鼠抗人CD28单克隆抗体2F5通过与Jurkat细胞表面膜型CD28分子结合对其增殖具有明显的抑制作用,提示CD28分子可作为治疗T淋巴瘤的一个潜在靶点,抗体对治疗CD28分子阳性的肿瘤具有潜在临床应用价值。     

CD3AK细胞的诱导及其抗肿瘤作用机制的初步探讨

采用两种状态的IgG2型小鼠抗人CD3单抗,辅以小剂量外源性IL-2刺激诱导CD3AK细胞,测定其对K562,Raji及P815细胞的杀伤作用。结果发现,0.1μg/ml浓度的游离状态抗CD3单抗和10μg/ml浓度的粘附状态抗CD3单抗刺激人PBMC增殖达最强效果,其中粘附状态抗CD3单抗诱导的PBMC增殖活性明显强于激离状态抗CD3单抗;外源性IL-2能协同增强抗CD3单抗诱导PBMC增殖,但当粘附状态抗CD3单抗处于最强激活浓度时,其协同作用并不明显。实验结果显示,CD3AK细胞对三种不同性质的肿瘤细胞均具有较强的杀伤作用,其杀伤活性既有效靶细胞直接接触杀伤,又有杀伤因子介导。     

抗CD3 scFv基因的真核表达及其生物学活性鉴定

目的：真核表达抗CD3单链抗体(scFv)，并研究其生物学活性。方法：将编码抗CD3 scFv的DNA片段插入真核表达载体pDisplay中。对所构建重组表达载体进行测序确认后，以电穿孔法将重组质粒导入Hela细胞，以原位杂交法检测抗CD3 scFv的表达，以3H TdR掺入法检测其在体外对T细胞的活化作用，以MTT比色法观察转染的。Hela细胞与T细胞混合培养后，诱发的细胞毒性T细胞的杀伤作用。结果：成功地构建了抗CD3 scFv的真核表达载体，并在Hela细胞中获得表达。所分泌的抗CD3 scFv在抗CD28mAb存在的条件下，能够刺激T细胞活化。将转染的Hela细胞与T细胞混合培养能够诱发CTL的杀伤作用。结论：真核表达的抗CD3 scFv具有刺激T细胞活化的活性，可用于构建对肿瘤进行免疫治疗的双功能分子。     

MicroRNA-7 在CD4+ T 细胞体外活化中的表达及意义

目的:观察microRNA-(miR-)在体外活化CD4+ T 细胞中表达的变化,初步探讨其意义。方法:采用免疫磁珠分选法(MACS)获得FVB 小鼠脾脏中CD4+ CD62L+ T 细胞,经抗CD3/ CD28 抗体刺激后,Real-ime PCR 检测miR- 7达水平,FACS 检测活化膜分子CD69 的表达变化;进一步观察刺激不同时间点CD4+ T 细胞中miR-7表达的变化;观察ERK 抑制剂PD98059 处理后,CD4+ T 细胞活化下miR-7表达的变化,同时CCK8 法检测细胞增殖变化,FACS 检测CD69 和CD62L 分子的表达变化;最后, Real-time C 检测各组细胞中IL-7、IL-10 和IFN鄄酌等细胞因子表达水平变化。结果:与对照组相比,抗CD3/ CD28 抗体刺激后,CD4+ CD62L+ T 细胞中miR-7 表达水平显著上调,CD69 分子的表达明显增加(P<0.05);与刺激0 h 组和24 h 组相比,48 h 组和72 h 组miR-7 的表达水平显著上调(P<0.05);PD98059 处理组中,CD4+ T 细胞的miR-7 表达水平显著下降(P<0.05),同时,活化膜分子CD69 的表达比例明显降低(P<0.05);最后,细胞表达IL-6、IL-10 和IFN 的水平均显著减弱(P<0.05)。结论:miR-7 在活化的CD4+ T 细胞中明显上调,并与ERK 信号相关,为后续探讨miR-7 在CD4+ T 细胞功能中的作用提供了前期实验基础。     

微型双功能抗体在裸鼠体内介导人T细胞杀伤白血病细胞

目的:研究抗CD3/抗CD19微型双功能抗体介导人T细胞对白血病细胞的特异性靶向杀伤活性。方法:利用Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞(PBL),流式细胞术从中分选T淋巴细胞,FACS检测T细胞表面标记CD25和CD69激活后的表达变化,实时定量PCR检测各组穿孔素(Perforin)和颗粒酶A(Granzyme A)的释放,建立BALB/c裸鼠Raji细胞移植瘤模型,测定该双功能抗体介导的体内靶向杀伤活性。结果:激活的T细胞,双功能抗体组CD25和CD69的表达以及释放Perforin和Granzyme A的量均明显高于对照组,在对人白血病裸鼠移植瘤模型的生物治疗中,抗CD3/抗CD19微型双功能抗体能有效抑制白血病移植瘤的生长。结论:抗CD3/抗CD19微型双功能抗体在体外及动物肿瘤模型实验中能介导人T细胞有效杀伤白血病细胞,具有潜在的临床应用前景。     

LAK、CD3AK和PHA-LAK细胞体外增殖和杀瘤活性比较

本文对LAK、CD3AK、PHA-LAK细胞的体外增殖能力、杀伤谱进行了同步比较.结果表明,三种效应细胞对悬浮和贴壁的肿瘤细胞系及新鲜分离的脑胶质瘤细胞均有较高的杀伤活性.由于LAK细胞增殖慢、IL-2用量大,PHA-LAK细胞体外存活时间短,而CD3AK细胞扩增倍数最高、细胞存活时间长、培养体系总的杀伤单位明显高于LAK和PHA-LAK细胞,且IL-2用量少.因此,我们认为CD3AK细胞是优于LAK和PHA-LAK细胞的较为安全、有效、经济的用于过继免疫治疗的抗癌效应细胞.     

固相MICA协同s4-1BBL、IL-15体外高效扩增CD3~+CD56~+细胞的研究

目的:观察固相MHCⅠ类相关抗原A(iMICA)是否协同s4-1BBL、IL-15促进外周血CD3+CD56+细胞的增殖并增强其活性。方法:首先将iMICA联合s4-1BBL、IL-15分别刺激外周血单个核细胞或纯化的CD3+CD56+细胞,共培养19天,动态观察CD3+CD56+细胞频率变化及记录其增殖曲线;其次利用LDH释放法和ELISA分别检测长期培养的CD3+CD56+细胞杀伤活性及IFNγ-、IL-4的分泌;最后检测CD3+CD56+细胞表面活性相关受体的表达。结果:iMICA联合s4-1BBL、IL-15促进CD3+CD56+细胞的频率自2%升高至21.7%,绝对细胞数平均增长32倍;扩增后的CD3+CD56+细胞杀伤K562活性明显增高,IFNγ-分泌能力增强,不分泌IL-4;其表面活化性受体表达上调,抑制性受体表达下调。结论:iMICA联合s4-1BBL、IL-15能高效扩增CD3+CD56+细胞,体外大量增殖后可用于肿瘤的过继免疫治疗。     

可溶性肿瘤抗原和CD3单克隆抗体共同诱导的杀瘤细胞——T-AK细胞

用可溶性肿瘤抗原和CD3单克隆抗体共同刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生CD8~ T细胞为主的杀瘤细胞,称其为T-AK细胞。与LAK细胞和CD3-AK细胞比较,T-AK细胞扩增快、低依赖IL-2,培养14天细胞数扩增24倍,比CD3-AK细胞高8倍,比LAK细胞高15倍,并能持续生长21天。T-AK细胞中含CD3~ 86％、CD4~ 20％、CD8~ 95％、CD16~ 40％、CD25~ 53％,它们是CD8~ T细胞为主的异质性细胞群。T-AK细胞对刺激它的STA来源的靶细胞高亲和性杀伤,杀伤率>90％,对NK敏感和不敏感细胞也有杀伤,表现非MHC限制杀伤。     

人外周血细胞因子诱导的自然杀伤细胞的体外高效扩增

使用干细胞生长培养基 (SCGM )和RPMI16 4 0培养基 ,设计不同浓度的抗CD3单抗、IL 2和PHA的培养条件 ,从健康成人外周血单个核细胞 (PBMC )中高效扩增细胞因子诱导的自然杀伤细胞 (CINK ) ,并用MTT法检测其细胞毒活性 ,优化CINK细胞的体外扩增技术。用优化的方法扩增 12例不同类型恶性肿瘤患者CINK细胞。结果显示 ,在以SCGM为基础培养基时 ,PBMC经抗CD3单抗、IL 2作用后获得大量增殖 ,在PHA存在时获得最大增殖 (P <0 0 5 ) ,扩增的CINK细胞以CD3 CD5 6 + NK细胞为主 ,扩增细胞的细胞毒活性显著高于相同来源的CIK细胞和CD3AK细胞 ,为应用CINK细胞进行自体肿瘤过继免疫治疗奠定了基础     

T-AK细胞的细胞毒活性研究

探讨抗ＣＤ３单抗和ｒＩＬ－２共同激活诱生的Ｔ－ＡＫ细胞的细胞毒活性本质。方法：采用ＭＴＴ法分别检测Ｔ－ＡＫ细胞杀伤白血病细胞的活性及其构成。结论Ｔ－ＡＫ细胞为异质性细胞群体,其杀伤活性主体为ＣＤ３ＡＫ活性和ＬＡＫ活性。     

自体CD3AK细胞过继免疫治疗晚期恶性肿瘤的临床观察

目的观察抗CD3单克隆抗体（anti—CD3 mAb）激活的杀伤细胞（cD3AK）过继免疫治疗晚期恶性肿瘤的疗效。方法从51例恶性肿瘤患者自体外周血分离单个核细胞,加入anti—CD3mAb、重组人IL-2（rhIL-2）体外诱导后扩增培养,制备自体CD3AK细胞。待细胞培养至第10～12天时取样用于质控检测。收集质控检测合格的CD3AK细胞,调整至终浓度为（4．0～6．0）×10^9/L,静脉回输至患者体内,每例患者治疗3个疗程,每疗程回输5次（每2d回输1次）,每次回输细胞数不低于1×10^9,每疗程回输细胞总数大于5×10^＊。应用人T细胞亚群检测试剂盒和流式细胞仪测定治疗前后患者外周血CD3＋、CD4＋、CD8＋T细胞以及CD16＋56＋细胞（NK细胞）比例;观察治疗前后患者的相关化验指标、生活质量以及不良反应;评定疗效,计算有效率和临床受益率。结果分离制备的CD3AK细胞符合理想活性细胞质量要求,可用于进一步实验治疗。CD3AK细胞过继免疫治疗后,患者外周血CD3＋、CD4＋、CD8＋T细胞以及CD16＋56＋细胞（NK细胞）比例分别为（48．88±9．42）％、（35．09±4．11）％、（28．17±4．97）％、（20.31±6．98）％]均显著升高（均P〈0．05）。51例患者中,45例患者治疗后全身症状改善明显;所有患者治疗后相关化验指标均未出现异常变化,也未出现其他全身毒副反应;其中完全缓解6例、部分缓解14例、微效11例、稳定12例、进展8例,总有效率达60．8％,临床受益率达84．3％。结论CD3AK细胞过继免疫治疗恶性肿瘤疗效确切、安全且无副作用,能有效改善和提高患者的机体免疫功能。     

抗VEGFR2/抗CD3双特异单链抗体的表达及初步活性检测

目的:构建和表达抗血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)/抗CD3双特异单链抗体(bscVEGFR2×CD3),及亲和活性测定。方法:设计抗VEGFR2/抗CD3双特异单链抗体基因序列,由公司合成并亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),筛选高效分泌表达bscVEGFR2×CD3的克隆株。表达产物经Ni-NTA柱纯化,120 g/L SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定。应用流式细胞术(FCM)检测生物学活性。结果:bscVEGFR2×CD3重组表达载体测序证实序列正确。bscVEGFR2×CD3能够在CHO细胞中进行分泌表达,筛选出6株高表达克隆株。120 g/L SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)约56 000有1条带,与预期相符,Western blot证明anti-His抗体能与这条蛋白条带发生特异性结合。FCM检测bscVEGFR2×CD3能与CD3+jurkat细胞和VEGFR2+A375细胞特异性结合。结论:成功构建和表达抗VEGFR2/抗CD3双特异单链抗体,该抗体具有与VEGFR2、CD3特异性结合的免疫学活性。     

人脐带血清不同组分对CD3AK细胞增殖的影响

人脐带血清有很好的支持ＣＤ３ＡＫ细胞增殖的活性，本文证明这种活性主要在大分子血清物质中。用截留分子量为１０５的滤膜超滤合并的人脐带血清，分成上下两部分，各占全血清的１／４和３／４。膜上部分为＞１０５血清；膜下部分为＜１０５血清。促进ＣＤ３ＡＫ细胞增殖的活性，主要在＞１０５血清；＜１０５血清的活性较低，尤其是对４天以上的增殖，即使增加浓度，添加＜１０５血清组的ＣＤ３Ａ细胞数目还是随培养天数下降。培养液中添加全脐带血清、＞１０５血清或重混合脐血清、ＣＤ３单抗和白细胞介素－１（ＩＬ－１），促进ＣＤ３ＡＫ细胞增殖；若培养液中改加＜１０５血清，则ＣＤ３单抗和ＩＬ－１反而使ＣＤ３ＡＫ细胞减少。此外，这两部分血清组分对ＣＤ３ＡＫ细胞合成ＤＮＡ和ＲＮＡ、对其表型、细胞表面分子表达和其杀伤活性均有不同影响。上述结果提示，人脐带血清中有分子量超过１０５的促进ＣＤ３ＡＫ细胞增殖的物质。     

IL-6+CD3AK细胞对MGC-803胃癌细胞株杀伤作用的体外实验研究

目的 :培育杀伤效应更强的肿瘤杀伤细胞。方法 :IL 6 +CD3AK细胞是用人外周血单个核细胞加rIL 6、rIL 2、CD3单抗制备的 ;靶细胞用MGC 80 3胃癌细胞株。效应细胞分 5组 ,每一组又按效靶比例分 4组 ,到培养第 2 4小时和 4 8小时检测各组癌细胞的死亡情况。用四唑盐 (MTT)比色法、台盼蓝排斥法检测死亡的癌细胞 ;并用各种显微镜观察肿瘤杀伤细胞杀伤靶细胞的形态变化。结果 :显示rIL 6 +CD3AK细胞组杀伤癌细胞效应比其他组强 (P <0 0 5 ) ;随效靶比例的增加和作用时间的延长 ,杀伤效应出现增强趋势。在光镜下观察到肿瘤杀伤细胞围绕癌细胞形成玫瑰花结样结构 ,在扫描电镜下观察到肿瘤杀伤细胞和靶细胞的微绒毛呈犬牙交错状结合 ,随着时间的延长 ,靶细胞表面的微绒毛逐渐变短消失 ,核膜表面出现众多孔洞 ,以至靶细胞碎裂死亡。结论 :IL 6 +CD3AK细胞对胃癌细胞的杀伤力强于LAK(只加rIL 2 )细胞。     

抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体并研究其生物活性.方法：分离纯化后的抗CD3 ScFv蛋白免疫BALB/c小鼠,采用传统杂交瘤技术制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体;采用ELISA和Western blot鉴定其亚类和抗原结合特异性;采用FACS测定抗抗CD3 ScFv单克隆抗体对Jurkat细胞特异活性.结果：成功筛选出一株能稳定分泌抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的杂交瘤细胞株（10B7）,其分泌的抗体亚类为IgG1.该抗抗CD3 ScFv单克隆抗体直标后可特异性结合抗CD3 ScFv蛋白和抗CD3抗体.结论：文中所研制的抗抗CD3 ScFv单克隆抗体具有与抗CD3抗体、抗CD3 ScFv蛋白特异结合的活性,在肿瘤导向治疗中抗CD3/抗肿瘤双特异抗体的亲和层析纯化、药代动力学监测等方面具有广泛的应用前景.